張 嫻，李超林，鄭喬木，嚴子成，廖 海，周嘉裕

(西南交通大學 生命科學與工程學院，四川 成都 610031)

胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)屬于絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶的S1家族成員，在動物、植物、微生物、病毒中均有發(fā)現(xiàn)，其活性部位常含有Ser-His-Asp組成的催化三聯(lián)體，專一性切割苯丙氨酸、酪氨酸與色氨酸的羧基端肽鍵[1-4]。在斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、煙草天蛾(Manducasexta)與小菜蛾(Plutellaxylostella)等鱗翅目昆蟲中，胰凝乳蛋白酶是中腸的重要蛋白質(zhì)水解酶，能夠水解食物蛋白質(zhì)，為昆蟲提供必需氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[5]。此外，胰凝乳蛋白酶還參與多種生理過程，如免疫應(yīng)答[6]、幾丁質(zhì)合成[7]、蛻皮[8]、發(fā)育[9]及蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)毒蛋白的激活[10]等。

菜青蟲(Pierisrapae)屬鱗翅目粉蝶科菜粉蝶屬，是菜粉蝶的幼蟲，已知的寄主植物有9科35種之多，嗜食十字花科植物，特別偏食厚葉片的甘藍、花椰菜、白菜、蘿卜等，每年給十字花科蔬菜造成極其嚴重的損失。目前，預(yù)防和控制菜青蟲主要通過施用化學農(nóng)藥，但由于菜青蟲耐藥性不斷增加，必須頻繁用藥才能防止菜青蟲再度猖獗，而頻繁用藥導致的食品安全和環(huán)境污染問題，一直備受爭議和重視[11]。BROADWAY[12]研究發(fā)現(xiàn)，菜青蟲主要依賴胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶行使消化功能，由此認為胰凝乳蛋白酶可能是抗蟲因子作用的重要靶點。目前，國內(nèi)有關(guān)菜青蟲中腸絲氨酸蛋白酶研究的報道較少，僅朱洋鏗[13]從菜青蟲蛹期脂肪體和血細胞中克隆出4個胰蛋白酶基因，證明其參與菜粉蝶的先天免疫反應(yīng)。

XIANG等[14]前期對菜青蟲中腸開展了比較轉(zhuǎn)錄組學研究，發(fā)現(xiàn)菜青蟲中腸中有多個胰凝乳蛋白酶候選基因，其中，部分基因的表達受到了抗蟲因子——蛋白酶抑制劑的影響。本研究選取在轉(zhuǎn)錄組3個樣本間(正常、饑餓、喂食抑制劑)表達顯著差異的1個胰凝乳蛋白酶候選基因 (編號:c31814.graph_c0)進行克隆、序列分析及原核表達，并利用qRT-PCR分析其在菜青蟲不同組織部位及受到饑餓和決明胰蛋白酶抑制劑(Cassiaobtusifoliatrypsin inhibitor，COTI)脅迫后的表達變化，為進一步研究該基因的功能及篩選抗蟲新靶點奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試蟲源

菜青蟲購自神農(nóng)生物科技有限公司。將菜青蟲置于(25±1)℃、相對濕度75%、光周期L∶D=14∶10條件下，用新鮮未施用農(nóng)藥的白菜葉片飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

RNA提取TRIzol?-Reagent 購自Invitrogen公司；DNA 純化試劑盒購自天根生化科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV Reverse Transcriptase、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、DL2000 DNA Marker、高保真酶PrimesSTAR HS DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、pMD19-T克隆載體購自TaKaRa公司；蛋白質(zhì)Marker購自賽默飛世爾科技有限公司;鎳離子親和層析柱購自GE公司；大腸桿菌DH5α、大腸桿菌Rosetta(DE3)、質(zhì)粒pET28a由本實驗室(藥用植物資源與分子生物學實驗室)保存；COTI由本實驗室前期構(gòu)建的重組菌表達純化所得[15]；其余試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

1.3 基因克隆及序列分析

選取菜青蟲4齡幼蟲，解剖得到中腸，采用傳統(tǒng)Trizol萃取法提取中腸總RNA，每只菜青蟲中腸用液氮研磨之后加入1 mL TRIzol?-Reagent。提取的總RNA用酶標儀和1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其純度和完整性，放入-80 ℃冰箱中備用。按照反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV Reverse Transcriptase說明書方法，以O(shè)ligo(dT)18為引物(表1)合成cDNA，保存于-20 ℃。以菜青蟲中腸cDNA為模板，用引物PrCT1F和PrCT1R進行PCR擴增，擴增條件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán);72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠回收純化后，克隆到pMD19-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株感受態(tài)細胞，PCR篩選菌液陽性克隆，并測序驗證。

對PrCT1的分子質(zhì)量(http://web.expasy.org/compute_pi/)、信號肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、功能域(http://smart.emblheidelberg.de/)等進行在線預(yù)測；利用MEGA 7軟件對PrCT1與其同源絲氨酸蛋白酶進行多序列比對，并用ESPript著色[16]，再用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(去除空位，采用1 000次重復進行自舉檢驗)。

表1 研究所用引物及其用途

注：＿表示限制性酶切位點。

Note：＿indicates restriction enzyme sites.

1.4 原核表達

根據(jù)克隆的PrCT1基因編碼區(qū)序列，設(shè)計帶酶切位點引物PrCT1YF和PrCT1YR(表1)。以克隆質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，擴增條件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，30個循環(huán);72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠回收純化后，克隆到pET28a載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株感受態(tài)細胞，菌液以PCR篩選陽性克隆，并進行雙酶切鑒定和測序驗證。將獲得的pET28a-PrCT1重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)表達菌株感受態(tài)細胞，用終濃度為 0.5 mmol/L的異丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)于27 ℃過夜誘導表達。收集誘導表達后的菌體，用50 mmol/L Tris-HCl(pH值為8.0)重懸，經(jīng)超聲波破碎和高速離心，分別收集破碎菌體的上清和沉淀，用15% SDS-PAGE進行檢測。將重組菌在不同溫度(19、23、27、30、33、37 ℃)、不同IPTG濃度(0.1、0.5、0.8、1.0、1.2、2.0 mmol/L)條件下分別進行表達，對PrCT1表達條件進行優(yōu)化。表達條件優(yōu)化后大量誘導重組菌表達目的蛋白，按照馮文榮[17]的方法，將包涵體洗滌、變性后，經(jīng)Ni2+親和層析純化，用250 mmol/L咪唑洗脫，再經(jīng)SDS-PAGE檢測純化蛋白質(zhì)。

1.5 PrCT1基因在不同組織中和不同脅迫處理條件下表達模式分析

不同組織：取4齡菜青蟲，將其解剖為頭、尾、脂肪體、中腸4個組織。

饑餓處理：在正常飼養(yǎng)條件下，對4齡菜青蟲進行饑餓處理，分別在饑餓處理4、8、16 h后收集菜青蟲中腸。

COTI喂食處理：從菜青蟲3齡開始喂食含COTI(質(zhì)量濃度0.8 mg/mL)白菜，4齡時收集菜青蟲中腸。

不同處理均以正常喂食4齡菜青蟲作為對照(CK)，每組樣品分別收集6頭幼蟲。利用所取材料獲得的cDNA為模板，以UPF3為內(nèi)參基因[18]，使用UPF3與PrCT1熒光定量PCR引物(表1)，按照熒光定量SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說明書方法進行操作。反應(yīng)總體系為20 μL，擴增程序：94 ℃ 60 s；94 ℃ 30 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。每個樣品進行3次重復試驗，收集PrCT1基因和UPF3基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜青蟲胰凝乳蛋白酶PrCT1基因的克隆與序列分析

對菜青蟲中腸轉(zhuǎn)錄組中編號為c31814.graph_c0的序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其含有1個長度為861 bp的完整ORF，編碼286個氨基酸。在ORF的兩側(cè)設(shè)計引物進行T-A克隆，核酸測序結(jié)果顯示其與c31814.graph_c0相似度為97.10%，表明已成功克隆得到PrCT1基因，其全長序列及預(yù)測氨基酸序列見圖1。利用NCBI的BLAST工具，發(fā)現(xiàn)PrCT1基因編碼的氨基酸序列與菜青蟲基因組中預(yù)測的chymotrypsin-1-like(GenBank登錄號：XP_022112774.1)完全一致，其基因由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。與其他鱗翅目昆蟲絲氨酸蛋白酶的同源性為34%～49%，其中，與黑脈金斑蝶(GenBank登錄號：OWR53227)胰凝乳蛋白酶的同源性最高，達到49%，親緣關(guān)系最近。PrCT1的1—18位氨基酸殘基為信號肽，34—274位氨基酸殘基為絲氨酸蛋白酶的特征結(jié)構(gòu)域(Tryp_SPc domain)。去除N-末端信號肽后，預(yù)測分子質(zhì)量為29.71 ku，理論等電點為9.23。

——表示活性相關(guān)的保守基序；*表示催化三聯(lián)體位點(H57、D102、S195)—— indicates activity related conservation motif; * indicates conserved catalytic triad(H57,D102,S195)圖1 菜青蟲胰凝乳蛋白酶PrCT1基因核苷酸序列和推導的氨基酸序列

PrCT1的氨基酸序列中含有高度保守的催化三聯(lián)體(H57、D102、S195)和成熟體活化位點RIVGG，且活性位點附近序列TAAHC和GDSGSAL，以及3對二硫鍵的半胱氨酸殘基等相關(guān)活性元件都較為保守(圖2A)[3-4,19-20]。HEDSTROM[3]與PERONA等[21]對絲氨酸蛋白酶底物特異性口袋分析、多序列比對顯示，上述蛋白酶的底物特異性位點均是G189-G216-D226，因此，PrCT1屬于胰凝乳蛋白酶，這與NCBI的BLAST搜索結(jié)果一致。系統(tǒng)進化樹分析(圖2B)表明，上述蛋白酶主要聚為2支，一支包括了PrCT1和蛺蝶科、螟蛾科、蠶蛾科、尺蛾科物種的絲氨酸蛋白酶，且PrCT1與黑脈金斑蝶在進化關(guān)系上較近；另一支由鳳蝶科、天蛾科、菜蛾科、夜蛾科物種的絲氨酸蛋白酶組成。將多序列比對和系統(tǒng)進化樹結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)進化關(guān)系越接近的物種其氨基酸序列相似性越高。

2.2 菜青蟲胰凝乳蛋白酶PrCT1基因的原核表達及純化情況

由于大腸桿菌表達體系無法切掉信號肽，因此，在構(gòu)建pET28a-PrCT1重組載體時去掉了信號肽。重組載體轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)菌株，27 ℃誘導過夜，經(jīng)SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)重組菌株超聲破碎的沉淀物中有1條分子質(zhì)量為33.26 ku的誘導蛋白條帶(圖3A)，其分子質(zhì)量超過了PrCT1重組蛋白的分子質(zhì)量。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是在重組蛋白N末端上游加入了His標簽，導致表達蛋白的分子質(zhì)量偏高。誘導表達的PrCT1重組蛋白出現(xiàn)在沉淀中，表明其以包涵體形式表達，還需后期的蛋白質(zhì)復性。研究了不同溫度及不同IPTG濃度對PrCT1表達的影響，發(fā)現(xiàn)溫度為27 ℃時，PrCT1的表達量最高。IPTG濃度為0.1 mmol/L時即有大量重組蛋白表達。IPTG濃度的增加對PrCT1表達量沒有明顯的影響，因此，誘導溫度為27 ℃、IPTG濃度為0.5 mmol/L是PrCT1的最佳誘導條件。將重組菌在最佳誘導條件下進行大量表達，收集菌體以超聲波破碎，包涵體經(jīng)洗滌、變性、Ni2+親和層析獲得純化目的蛋白(圖3B)。

黑色長方塊表示相同的氨基酸；□表示較保守的氨基酸；★表示保守的催化三聯(lián)體位點(H57、D102、S195)；表示成熟體切割位點；▲表示底物特異性位點(189、216、226)；●表示6個保守的半胱氨酸殘基；─表示活性相關(guān)的保守基序

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1：重組菌誘導前；2：重組菌誘導后；3：重組菌誘導破碎上清液；4：重組菌誘導破碎沉淀；5：重組菌未誘導破碎上清液；6：重組菌未誘導破碎沉淀；7：空載菌誘導破碎上清液；8：空載菌誘導破碎沉淀；9：10 mmol/L咪唑洗脫后的蛋白質(zhì)；10：250 mmol/L咪唑洗脫后的蛋白質(zhì)

M:Protein marker(standard);1:Before recombinant bacteria were induced by IPTG;2:After recombinant bacteria were induced by IPTG;3:Supernatant with ultrasonic disruption after the recombinant bacteria were induced by IPTG;4:Deposit with ultrasonic disruption after the recombinant bacteria were induced by IPTG;5:Supernatant with ultrasonic disruption after the recombinant bacteria were not induced by IPTG;6:Deposit with ultrasonic disruption after the recombinant bacteria were not induced by IPTG;7:Supernatant with ultrasonic disruption after the control bacteria were induced by IPTG;8:Deposit with ultrasonic disruption after the control bacteria were not induced by IPTG;9:Expression product eluted by 10 mmol/L imidazole;10:Expression product eluted by 250 mmol/L imidazole

圖3 菜青蟲胰凝乳蛋白酶PrCT1基因的原核重組表達(A)及純化(B) 檢測
Fig.3 Prokaryotic recombinant expression(A) and purification(B) detection of the chymotrypsinPrCT1gene ofPierisrapae

2.3 菜青蟲胰凝乳蛋白酶PrCT1基因在不同組織中和不同脅迫處理條件下表達模式分析

將菜青蟲解剖為頭、尾、脂肪體和中腸，利用qRT-PCR檢測PrCT1mRNA在菜青蟲不同組織中表達情況(圖4A)。結(jié)果顯示，PrCT1基因在其4個組織中均有表達，但在不同組織中的表達水平差異顯著，表現(xiàn)出組織特異性。其中，在中腸內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平最高，其次是尾，脂肪體中表達量最低。昆蟲中腸是食物消化、營養(yǎng)吸收的主要器官，而絲氨酸蛋白酶家族是鱗翅目昆蟲幼蟲中腸內(nèi)最主要的蛋白質(zhì)消化酶，家族成員主要包括胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其約占消化酶活性的95%[5]，因此，PrCT1基因可能參與食物消化。

對菜青蟲進行饑餓、COTI喂食脅迫處理，利用qRT-PCR檢測PrCT1mRNA在中腸中的表達情況(圖4B、C)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菜青蟲受到饑餓脅迫后，PrCT1的相對表達量在饑餓4 h后迅速下降，只有對照組的0.63%，8 h后表達水平略有升高，為對照組的11.90%，16 h后表達水平持續(xù)下降，僅為對照組的0.29%，表明PrCT1的表達情況與中腸食物量密切相關(guān)，推測其可能是菜青蟲中腸內(nèi)發(fā)揮食物消化作用的重要蛋白質(zhì)。其中，饑餓8 h相對表達量略有升高，可能是消化體內(nèi)儲存的物質(zhì)以供饑餓狀態(tài)下生理活動需要所致。菜青蟲在喂食含有COTI的葉片后，其表達水平也顯著降低，僅為對照組的0.24%，表明其表達受到COTI的負調(diào)控，而蛋白酶抑制劑被昆蟲攝食后，會抑制腸道內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶活性或負調(diào)控其表達水平[5,22]，因此，PrCT1基因可能是重要的抗蟲靶點。

圖4 菜青蟲胰凝乳蛋白酶基因PrCT1 mRNA在不同組織中(A)和不同脅迫處理條件下(B、C)表達分析Fig.4 Expression analysis of the chymotrypsin PrCT1 mRNA of Pieris rapae in different tissues(A) and different stress treatment conditions(B and C)

3 結(jié)論與討論

鱗翅目昆蟲中腸內(nèi)蛋白質(zhì)的消化主要依靠胰凝乳蛋白酶等絲氨酸蛋白酶，占消化酶活性的95%[5]。在鱗翅目昆蟲體內(nèi)，胰凝乳蛋白酶的功能呈現(xiàn)多樣化，各成員的具體功能及在生理活性中的作用仍不清楚，因此，有必要獲取胰凝乳蛋白酶并對其開展功能研究。根據(jù)XIANG等[14]前期獲得的菜青蟲中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從中篩選出11個胰凝乳蛋白酶基因和7個活性位點不完整的胰凝乳蛋白酶基因同源物。小菜蛾[23]與家蠶[24]中也存在多個胰凝乳蛋白酶活性位點不完整同源物，推測這些同源物可能參與昆蟲對植物抗蟲因子(尤其是植物蛋白酶抑制劑)的適應(yīng)過程，有利于昆蟲對植源性食物的消化。

經(jīng)過序列比對，c31814.graph_c0所編碼的氨基酸序列具有明顯的絲氨酸蛋白酶的典型特征，即催化三聯(lián)體(H57、D102、S195)，這與已克隆得到的其他鱗翅目昆蟲絲氨酸蛋白酶氨基酸序列擁有共同的酶活催化中心，但其同源性差異較大。絲氨酸蛋白酶根據(jù)底物口袋中3個特異性位點(189、216、226)氨基酸殘基的差異，可分為胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶等不同類型。第189位的氨基酸殘基位于底物口袋的底部，是決定酶催化底物特異性的最重要氨基酸；而第216位和第226位氨基酸位于酶底物口袋的入口處，限制了底物大小，若被替換為較大的氨基酸，將只有小分子底物能夠進入底物口袋[3,21]。PrCT1的第189位氨基酸殘基是甘氨酸，第216位和第226位氨基酸殘基分別是甘氨酸與天門冬氨酸，側(cè)鏈較小，形成了較大的入口，允許擁有較大側(cè)鏈的芳香族氨基酸進入底物口袋，屬于胰凝乳蛋白酶。

將PrCT1導入原核表達系統(tǒng)大腸桿菌中，通過不同IPTG濃度、不同溫度誘導，發(fā)現(xiàn)27 ℃、0.5 mmol/L IPTG的誘導效果最好。融合蛋白的可溶性分析表明，在各種優(yōu)化篩選條件下，PrCT1均為包涵體蛋白，這可能是由于目的蛋白合成速度較快，沒有足夠的時間進行加工，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀所致；還可能是由于絲氨酸蛋白酶為真核蛋白質(zhì)，在原核系統(tǒng)中進行表達的時候，缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，蛋白質(zhì)內(nèi)部的3對二硫鍵不能正確配對[25]所致。

蛋白酶參與消化過程的一個重要特點是在食物刺激下，其表達量會明顯增加。很多研究通過饑餓處理試驗來探究中腸絲氨酸蛋白酶與消化之間的關(guān)系，如斜紋夜蛾的類胰凝乳蛋白酶(Sfctlp1和Sfctlp2)均在饑餓后下調(diào)表達，重新喂食后上調(diào)表達[26-27]，這表明饑餓處理昆蟲幼蟲后，中腸內(nèi)與食物消化相關(guān)的蛋白酶表達下調(diào)。蛋白酶抑制劑是植物抵抗攝食昆蟲的防御物質(zhì)，其能夠抑制昆蟲絲氨酸類蛋白酶的活性，影響昆蟲的營養(yǎng)吸收，從而抑制昆蟲的正常生長發(fā)育與生理代謝，甚至導致死亡[28]。昆蟲在與植物的長期斗爭中產(chǎn)生了對植物源蛋白酶抑制劑的適應(yīng)性進化，其中一種方式是誘導表達一些對蛋白酶抑制劑不敏感的新蛋白酶；另一種方式是提高蛋白酶的表達水平，以補償?shù)鞍酌敢种苿┮鸬牡鞍酌富钚該p失[5]。由此，TELANG等[22]認為蛋白酶抑制劑發(fā)揮抗蟲作用的靶點可能是那些敏感的蛋白酶，其能夠與蛋白酶抑制劑結(jié)合，觸發(fā)酶活性下降，亦或其表達水平會受到蛋白酶抑制劑的負調(diào)控。本研究中，PrCT1mRNA主要在菜青蟲中腸表達，且經(jīng)饑餓和喂食決明胰蛋白酶抑制劑COTI后其表達水平均下調(diào)，表明PrCT1的表達受中腸食物的誘導，但受COTI的抑制，推測PrCT1可能是菜青蟲中腸中發(fā)揮食物消化作用的重要蛋白質(zhì)，且可能是蛋白酶抑制劑重要的作用靶點。后續(xù)將進一步對PrCT1開展復性研究，檢測COTI對其是否具有抑制作用。