李 丹 趙偉仲 李 楓

0 引 言

為適應(yīng)當(dāng)今時(shí)代綠色發(fā)展，氫氣作為一種高效清潔能源，它的開發(fā)利用將成為世界各國發(fā)展的主旋律。生物發(fā)酵產(chǎn)氫作為一種有廣闊發(fā)展前景的能源制備技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。生物暗發(fā)酵制氫技術(shù)因成本低、耗能小以及發(fā)展前景優(yōu)越引起廣泛關(guān)注，眾多學(xué)者對生物發(fā)酵產(chǎn)氫從宏觀到微觀進(jìn)行了廣泛的研究。HARUHIKO et al[1-2]培養(yǎng)的高效產(chǎn)氫菌取得了顯著成效。有學(xué)者利用基因敲除法從小球藻抽脂殘留物中獲得了產(chǎn)氣腸桿菌工程菌，產(chǎn)氫效率為54.61 mL/g[3]。目前，發(fā)酵產(chǎn)氫技術(shù)的底物僅僅限于有機(jī)廢水[4]或秸稈[5]等，也有一些進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵制氫的研究[6]，但以煤為發(fā)酵底物的產(chǎn)氫技術(shù)報(bào)道較鮮見。蘇現(xiàn)波等[7]研究了煤厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫條件，包括不同的培養(yǎng)基底物以及不同量的輔助菌種等，這對于生物采煤和生物采殘煤有重要意義，為煤炭資源的安全和有效開采開辟了一條新的途徑，具有增加能源儲(chǔ)備和溫室減排的社會(huì)效益和環(huán)境效益。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，從礦井水中對煤層本源菌進(jìn)行富集篩選，成功分離出一株高效產(chǎn)氫菌，對菌株進(jìn)行了鑒定，優(yōu)選出最適碳源作為富集培養(yǎng)的底物。以煤為發(fā)酵底物，不同氣相條件作為發(fā)酵產(chǎn)氫菌的影響因子，進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)，測定菌種生長特性及發(fā)酵產(chǎn)氫能力。通過對產(chǎn)氫速率及產(chǎn)氫量來確定最優(yōu)質(zhì)的氣相條件，對實(shí)驗(yàn)結(jié)束的煤樣進(jìn)行蘭氏體積和密度分析，探討單株產(chǎn)氫菌對煤樣的降解情況，以便為煤發(fā)酵制氫工程提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品的制備及菌種來源

采集塊狀煤樣，按照GB/T 474-2008《煤樣制備方法》，利用粉碎機(jī)將煤樣破碎、研磨，最后篩選粒徑為0.180 mm～0.250 mm的煤樣顆粒。以義馬礦井水作為菌種來源。

1.2 培養(yǎng)基配方

為分離出產(chǎn)氫菌群，采用以下配方對義馬礦井水中的菌群進(jìn)行富集與培養(yǎng)：胰化酪蛋白，1.0 g；MgCl2·6H2O，0.1 g；K2HPO4·3H2O，0.4 g；NH4Cl，1 g；NaCl，2.0 g；酵母膏，1.0 g；EDTA二鈉，2.0 g；L-鹽酸半胱氨酸，0.5 g；NaHCO3，2.0 g；超純水，1 000 mL；煤，10 g；微量元素液，10 mL；pH=7.0[8]。添加的碳源為：葡萄糖、乳糖、甘露醇，10 g。為了進(jìn)一步篩選出單一產(chǎn)氫菌株，在富集培養(yǎng)基中加入瓊脂粉制作篩選平板。

1.3 氣體收集方法

采用倒置排水集氣法對生成的氣體進(jìn)行收集。為避免集水瓶中液體因重力流入反應(yīng)瓶造成反應(yīng)液鹽度增高而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，集氣瓶中采用超純水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方案

1.4.1 分離菌種

利用義馬礦井水進(jìn)行微生物暗發(fā)酵產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)，取產(chǎn)氣高峰期菌液備用。

將初次分離的產(chǎn)氫菌液均勻涂布于平板培養(yǎng)基，放置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀測菌落生長情況，按菌落的形態(tài)學(xué)特征使用接種環(huán)挑取形態(tài)一致、生長完好的單菌落進(jìn)行多次重復(fù)篩選，取得單一菌株作為產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)的菌種來源。

1.4.2 菌種鑒定

按SK8255(細(xì)菌)試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取。采用通用引物7F1540R和27F1492R，將得到的細(xì)菌基因組16SrDNA作為模板進(jìn)行PCR(體外基因擴(kuò)增技術(shù))擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：Template(基因組DNA 20 ng/μL～50 ng/μL)0.5 μL，10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL，脫氧核糖核苷酸三磷酸dNTP(2.5 mmol/L)1 μL，酶0.2 μL，上游引物F(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物R(10 μmol/L)0.5 μL、加雙蒸H2O至25 μL。PCR循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃高溫變性45 s，55 ℃低溫退火45 s，72 ℃引物延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72 ℃修復(fù)延伸10 min，4 ℃保存，并用1%瓊脂糖電泳(150 V，100 mA，20 min)觀察結(jié)果?；厥盏腜CR產(chǎn)物用PCR引物直接測序，在NCBI上進(jìn)行blast比對分析。

1.4.3 優(yōu)選營養(yǎng)物質(zhì)

為保證實(shí)驗(yàn)成功，選取鑒定出的高效產(chǎn)氫菌可利用的營養(yǎng)物質(zhì)[9-11]，對這些物質(zhì)進(jìn)行控制單一變量產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)，選擇能使菌種發(fā)揮最大產(chǎn)氫能力的碳源。

1.4.4 發(fā)酵產(chǎn)氫

利用富集后的高效產(chǎn)氫菌進(jìn)行產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基使用優(yōu)選出來的營養(yǎng)物質(zhì)。樣品分裝情況見表1。在反應(yīng)瓶左側(cè)通入相應(yīng)氣體，檢測其產(chǎn)氣速率，利用分光光度計(jì)定期測定菌液濃度的變化。對原煤與實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的煤樣進(jìn)行密度及蘭氏體積測試，烘干煤樣，進(jìn)行脫酸處理，測定反應(yīng)前后煤樣密度與蘭氏體積值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種分離純化結(jié)果

利用產(chǎn)氫培養(yǎng)基，從義馬礦井水中分離篩選得到形態(tài)清晰完好，生長狀況穩(wěn)定，繁殖迅速，兼性厭氧型的單菌落，形態(tài)如圖1所示。

圖1 單菌落照片F(xiàn)ig.1 Photo of bacterial colonies

2.2 菌種鑒定結(jié)果

以分離純化得到的單一菌株基因組16SrDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增lip基因，經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測得到約為1 495 bp的DNA片段(見圖2)。

圖2 菌株lip PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Electrophoresis result of PCR product of lip genes

一般認(rèn)為，序列相似率在95%～99%之間定義為屬，序列相似率達(dá)到99%定義為種[12]。菌株的16SrDNA測序結(jié)果見表2。由表2可知，在NCBI相關(guān)序列中blast對比后表明，該菌株屬于腸桿菌屬(Enterobacter)與Enterobactercloacaestrain AR0093 的序列同源性達(dá)到100%，為革蘭陰性粗短桿菌，最適生長溫度為30 ℃，兼性厭氧細(xì)菌，可利用大部分醇類和糖類作為底物產(chǎn)氫[13-14]，已廣泛用于研究生物降解制氫領(lǐng)域，本實(shí)驗(yàn)命名為EnterobactercloacaeYM-01。

2.3 不同碳源培養(yǎng)條件下菌種的產(chǎn)氫能力

為比較EnterobactercloacaeYM-01在不同碳源條件下的產(chǎn)氫能力，本實(shí)驗(yàn)選取三種成本低廉、能被多數(shù)細(xì)菌利用的糖類及醇(甘露醇、葡萄糖和乳糖)為底物。不同碳源條件下累積產(chǎn)氣量見圖3。由圖3可知，在100 h之前，菌群降解不同的碳源得到的氫氣產(chǎn)量差別較小，甘露醇先結(jié)束產(chǎn)氫。葡萄糖和乳糖的產(chǎn)氫周期相同，但葡萄糖在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中始終處于領(lǐng)先地位，產(chǎn)氫速率最快，累積產(chǎn)氣量達(dá)到127 mL。說明該菌對葡萄糖的利用更高效，此條件下的產(chǎn)氫能力最強(qiáng)。

表2 菌株16SrDNA核苷酸序列結(jié)果
Table2Strainsof16SrDNAnuclearacidsequence

2.4 不同氣相條件下菌種濃度及其產(chǎn)氣量的變化

本實(shí)驗(yàn)選用氦氣、空氣、一氧化碳和二氧化碳作為不同氣相條件，控制通氣速率和時(shí)間，研究它們對反應(yīng)液中EnterobactercloacaeYM-01繁殖能力的不同氣相條件下的累積產(chǎn)氣量見圖5。由圖5可以看出，對于空氣和一氧化碳來說，產(chǎn)氣量開始較低，之后出現(xiàn)小幅度的提高，但產(chǎn)氣量仍然很小，最大值分別為86 mL和98 mL。在氦氣和二氧化碳條件下，產(chǎn)氫能力明顯提高，產(chǎn)氣速率較快，其最大產(chǎn)氫速率分別達(dá)到1.87 mL/h和1.30 mL/h，累計(jì)產(chǎn)氣量分別為224 mL和156 mL，是空氣條件下的2倍。由圖4和圖5還可以看出，相應(yīng)產(chǎn)氣總量的變化和菌液濃度值呈現(xiàn)較好的對應(yīng)關(guān)系(菌液濃度越高，產(chǎn)氣量越大)。

圖3 不同碳源條件下累積產(chǎn)氣量Fig.3 Cumulative gas production at different carbon sources

影響。用分光光度計(jì)(設(shè)定波長為420 nm)測定OD值表征不同氣相條件下菌種濃度的變化(見圖4)。由圖4可知，在以空氣和一氧化碳為氣相條件下，隨著時(shí)間的推移菌群濃度變化相似，均呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在45 h時(shí)達(dá)到峰值，之后菌群濃度下降，繁殖能力減弱；在以氦氣和二氧化碳為氣相條件下，菌種濃度與時(shí)間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，分別達(dá)到0.983 Abs和0.732 Abs。

圖4 不同氣相條件下菌液OD值Fig.4 OD value of bacterium at different gas phases

圖5 不同氣相條件下累積產(chǎn)氣量Fig.5 Cumulative of gas production at different gas phases

綜上分析，四種氣相條件下細(xì)菌的生長繁殖能力均不同：1) 該菌在以空氣為氣相條件時(shí)仍能生長，但與煤反應(yīng)產(chǎn)生的氫氣量很少，這說明在該氣相條件下菌種能夠生長。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間足夠長時(shí)，菌液濃度降低，菌株的生長代謝受到抑制，可能與氧氣濃度有關(guān)：首先，空氣中存在78%的氮?dú)?，但該條件下細(xì)菌的生長繁殖能力沒有顯著增強(qiáng)，氮?dú)鈱ζ錄]有影響，說明該菌株為非固氮菌；其次，空氣中存在21%的氧氣，說明該氧氣濃度下不利于菌株的生長；2) 以CO為氣相時(shí)，細(xì)菌生長繁殖及產(chǎn)氫能力和以空氣為氣相時(shí)的情況類似，在反應(yīng)時(shí)間達(dá)到45 h左右時(shí)，達(dá)到峰值，而后持續(xù)下降，說明細(xì)胞代謝繁殖受到抑制，CO累積到一定量使產(chǎn)氫菌細(xì)胞內(nèi)的氫化酶處于抑制狀態(tài)[15]，因此菌液濃度下降；3) 以二氧化碳和氦氣作為氣相條件時(shí)，菌液濃度一直呈上升趨勢，這是因?yàn)?，反?yīng)裝置中的氧被吹脫，能使培養(yǎng)基中保持較低的氧化還原電位和厭氧環(huán)境，有利于厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫反應(yīng)的進(jìn)行[16]，能夠比較充分地發(fā)揮細(xì)菌的產(chǎn)氫能力；4) 與氦氣相比，以二氧化碳為氣相時(shí)，細(xì)菌的產(chǎn)氫能力較弱一些，這是由于二氧化碳溶解度較高，可以與培養(yǎng)基中的水進(jìn)行反應(yīng)生成碳酸，改變發(fā)酵環(huán)境的pH值，從而對細(xì)胞的代謝起到抑制作用[17]。氣相中較高的二氧化碳濃度會(huì)產(chǎn)生反饋抑制，其對產(chǎn)氫反應(yīng)的抑制性甚至高于氫氣的抑制性。另外，從反應(yīng)機(jī)制上分析，二氧化碳的濃度與NADH的殘量成反比，而NADH途徑是產(chǎn)氫反應(yīng)重要途徑之一[18]，NADH的殘量是產(chǎn)氫發(fā)酵細(xì)菌提高氫氣釋放的重要基礎(chǔ)，所以較高的二氧化碳濃度減少了NADH殘量，減少了總氣量的產(chǎn)生；5) 以氦氣作為通氣氣源時(shí)菌種的生長情況最好，氦氣屬于稀有氣體較穩(wěn)定，最大程度地保護(hù)了產(chǎn)氫菌的代謝環(huán)境。

2.6 煤樣的變化

于不同氣相條件下的產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，煤樣的密度與蘭氏體積較原煤已經(jīng)發(fā)生了顯著的變化(見圖6)。由圖6a可知，蘭氏體積變化波動(dòng)較大，除了CO2氣氛，其他氣氛下的蘭氏體積均較原煤的蘭氏體積有所增加，尤其是通入氦氣后變化最顯著，比原煤增大近2 cm3/g。由圖6b可知，和原煤比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后煤樣密度均有所增加，通入空氣、CO和CO2，煤樣密度反應(yīng)前后變化波動(dòng)不明顯，均在1.2 g/cm3～1.3 g/cm3之間，通入氦氣后的煤樣密度值變化最大，超過1.3 g/cm3。

由圖6還可以看出，反應(yīng)后煤樣密度均有所增加，說明經(jīng)過微生物的作用改變了煤體結(jié)構(gòu)，相比其他氣氛，氦氣條件下煤樣密度變化最大，說明該狀態(tài)下的細(xì)菌對煤樣的利用率更高，反應(yīng)較徹底，但其變化值不明顯，所以并不能由此推斷煤樣結(jié)構(gòu)的具體變化情況。通入氦氣后與原煤樣相比蘭氏體積的變化最明顯，說明通入氦氣后，驅(qū)趕了煤厭氧發(fā)酵的氧氣，使得細(xì)菌能夠在專性厭氧條件下生長繁殖，經(jīng)過產(chǎn)氫菌的作用改變了煤樣吸附甲烷的能力，反應(yīng)后煤樣的開放型孔增加，孔隙連通性增強(qiáng)[19]，該條件下細(xì)菌對煤的利用更徹底。

圖6 不同氣相條件下發(fā)酵結(jié)束后煤樣蘭氏體積及密度Fig.6 Langmuir volume and density of coal after fermentation at different gas phases a—Langmuir volume；b—Density

3 結(jié) 論

1) 通過涂布平板法重復(fù)實(shí)驗(yàn)有效篩選出一株高效產(chǎn)氫菌，該菌株與腸桿菌屬(Enterobacter)的Enterobactercloacaestrain AR0093同16SrDNA序列同源性最高。

2) 改變產(chǎn)氫菌可利用的營養(yǎng)物質(zhì)，優(yōu)選出最適宜該菌的營養(yǎng)物質(zhì)為葡萄糖。

3) 氣相條件對產(chǎn)氫菌的生長和產(chǎn)氫量有著重要影響，通氣條件下的菌濃度由強(qiáng)到弱依次為氦氣、二氧化碳、空氣、一氧化碳。累積產(chǎn)氫量與其也有相同次序，兩者之間具有較好的相關(guān)性。

4) 氧分子對產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫過程有明顯的抑制作用，在進(jìn)行發(fā)酵細(xì)菌的產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)盡量采用其他氣體如氮?dú)?、氬氣和二氧化碳來吹脫空氣中的氧氣?/p>

5) 在反應(yīng)前后煤樣密度變化不大，對反應(yīng)前后的煤樣進(jìn)行等溫吸附后，發(fā)現(xiàn)通入氦氣后蘭氏體積變化較明顯，說明氦氣條件下產(chǎn)氫菌對煤的利用更充分更徹底。