呂觀(guān) 常彥磊 石磊

（暨南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院，廣東 廣州 510632）

摘 要：建立免疫磁珠分離（immunomagnetic separation，IMS）聯(lián)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)檢測(cè)牛肉中鼠傷寒沙門(mén)氏菌與金黃色葡萄球菌的方法。用生物素標(biāo)記的鼠傷寒沙門(mén)氏菌抗體和生物素標(biāo)記的金黃色葡萄球菌菌體蛋白抗體對(duì)鏈霉親和素磁珠進(jìn)行功能化，從牛肉中捕獲和分離目標(biāo)致病菌。結(jié)果表明：經(jīng)優(yōu)化后，每毫克磁珠與10 ?L鼠傷寒沙門(mén)氏菌抗體偶聯(lián)，400 ?L鼠傷寒沙門(mén)氏菌免疫磁珠在45 min內(nèi)對(duì)104 CFU/mL鼠傷寒沙門(mén)氏菌的捕獲率為52.16%;每毫克磁珠與6 ?L金黃色葡萄球菌抗體偶聯(lián)，300 ?L金黃色葡萄球菌免疫磁珠在30 min內(nèi)對(duì)104 CFU/mL金黃色葡萄球菌的捕獲率為56.80%;建立的IMS-LAMP方法特異性高，對(duì)牛肉中鼠傷寒沙門(mén)氏菌的檢測(cè)靈敏度為1.2×103 CFU/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)靈敏度為4.4×104 CFU/mL;富集5 h后，鼠傷寒沙門(mén)氏菌的檢測(cè)限可至1.2 CFU/mL，富集7 h后，金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限可降至4.4 CFU/mL。建立的IMS-LAMP方法用時(shí)短，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，可以有效檢測(cè)牛肉中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌。

關(guān)鍵詞：鼠傷寒沙門(mén)氏菌;金黃色葡萄球菌;免疫磁珠;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增;牛肉

Rapid Detection of Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus in Beef by Immunomagnetic Separation Combined with Loop-Mediated IsothermaL Amplification Method

L? Guan， CHANG Yanlei， SHI Lei*

（Institute of Food Safety and Nutrition， Jinan University， Guangzhou 510632， China）

Abstract： A method combining immunomagnetic separation （IMS） and loop-mediated isothermal amplification （LAMP） was developed to detect Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus in beef. Streptavidin magnetic beads were functionalized with biotin-labeled Salmonella typhimurium antibodies and biotin-labeled Staphylococcus aureus protein antibodies to capture and isolate the target pathogen from beef. After optimization， 400 ?L of immunomagnetic beads （IMBs） conjugated with 10 ?L/mg of anti-Salmonella typhimurium antibody presented a capture efficiency of 52.16% for 104 CFU/mL

of Salmonella typhimurium within 45 min， and 300 ?L of IMBs conjugated with 6 ?L/mg of anti-Staphylococcus aureus antibody presented a capture efficiency of 56.80% for 104 CFU/mL of Staphylococcus aureus within 30 min. The proposed IMS-LAMP had a high specificity. When applied on beef， the detection limit was about 1.2 × 103 CFU/mL for Salmonella typhimurium and 4.4 × 104 CFU/mL for Staphylococcus aureus in beef. After 5 and 7 h of enrichment， the detection limit of Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus was improved to 1.2 and 4.4 CFU/mL， respectively. Hence， the IMS-LAMP assay provides a rapid， simple， and highly sensitive method for the detection of Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus in beef.

Keywords： Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus; immunomagnetic separation; loop-mediated isothermal amplification; beef

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190612-124

中圖分類(lèi)號(hào)：TS207.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2019）07-0042-07

引文格式：

呂觀(guān)， 常彥磊， 石磊. 免疫磁珠-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)牛肉中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌與金黃色葡萄球菌[J]. 肉類(lèi)研究， 2019， 33（7）： 42-48. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190612-124.? ? http：//www.rlyj.net.cn

L? Guan， CHANG Yanlei， SHI Lei. Rapid detection of Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus in beef by immunomagnetic separation combined with loop-mediated isothermal amplification method[J]. Meat Research， 2019， 33（7）： 42-48. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190612-124.? ? http：//www.rlyj.net.cn

目前，98.5%食源性疾病的起因是微生物污染，而沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌就是2 種市面上常見(jiàn)的食源性致病菌[1]。沙門(mén)氏菌屬于兼性厭氧革蘭氏陰性菌，是造成人類(lèi)腸胃炎爆發(fā)的主要原因之一[2]。金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，能產(chǎn)生多種腸毒素，引發(fā)人類(lèi)皮膚和軟組織感染，導(dǎo)致敗血癥和肺炎等疾病[3-4]。這2 種病菌常存在于生肉[5]、雞蛋[6]、水果[7]和蔬菜[8]中，人類(lèi)食用被這2 種病菌污染的食品會(huì)引發(fā)一系列的食品安全問(wèn)題，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康。

官方的食品安全機(jī)構(gòu)對(duì)這2 種食源性致病菌的檢測(cè)仍采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，主要包括預(yù)富集、選擇性富集、選擇性瓊脂分離結(jié)合菌落的生物化學(xué)表征最終確認(rèn)[9-10]。傳統(tǒng)方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、價(jià)格便宜、設(shè)備簡(jiǎn)單，但需要5～10 d不等，對(duì)人員的專(zhuān)業(yè)經(jīng)驗(yàn)要求高、靈敏性差、無(wú)法快速檢測(cè)、在等待測(cè)試結(jié)果的過(guò)程中可能會(huì)對(duì)經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)活動(dòng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的負(fù)面影響，故市場(chǎng)上急需一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法[11-12]。

免疫磁珠分離（immunomagnetic separation，IMS）技術(shù)是目前一種運(yùn)用廣泛的前處理方法，能夠縮短微生物檢測(cè)的增菌時(shí)間、消除食品基質(zhì)的影響、實(shí)現(xiàn)微生物致病菌的快速富集[13]。該方法利用磁珠上的抗體與食品基質(zhì)中的抗原發(fā)生特異性結(jié)合后，在磁力的吸附下，將致病菌分離出來(lái)[14]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi等[15]提出的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)利用4～6 條特異性引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增，有效避免了對(duì)溫度和儀器的要求，其特異性強(qiáng)、靈敏度高、實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單、不需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員，適用于食源性致病菌的快速檢測(cè)[16]。本研究將IMS技術(shù)與LAMP技術(shù)相結(jié)合，針對(duì)牛肉中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌2 種食源性致病菌，利用免疫磁珠富集致病菌，同時(shí)選擇鼠傷寒沙門(mén)氏菌的invA基因和金黃色葡萄球菌的nuc基因作為靶基因構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光LAMP體系，進(jìn)而建立準(zhǔn)確、快速檢測(cè)牛肉中鼠傷寒沙門(mén)氏菌與金黃色葡萄球菌的IMS-LAMP方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC25923、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）CMCC63303、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）ATCC29544、大腸桿菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7）ATCC35150、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC19115和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）ATCC17802 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

鏈霉親和素磁珠（500 nm） 上海羧菲生物醫(yī)藥科技有限公司;生物素標(biāo)記的沙門(mén)氏菌抗體、生物素標(biāo)記的金黃色葡萄球菌菌體蛋白抗體 北京博奧森生物技術(shù)有限公司;營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國(guó)HyClone公司;吐溫-20 天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng);Bst DNA聚合酶? ?紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司;甜菜堿、dNTPs、MgSO4·7H2O 美國(guó)Sigma公司;SYTO-9熒光染料?英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司;引物 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7500熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI（Applied Biosystem）公司;HS-3垂直混合儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;奧磁?多功能磁分離器 上海奧潤(rùn)微納新材料科技有限公司;微量移液槍?zhuān)?.1～1.0 mL） 塞默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的培養(yǎng)

將甘油保存的鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌分別在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h;用接種環(huán)挑取各自單個(gè)典型單菌落于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)18～24 h;取1 mL培養(yǎng)好的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液和金黃色葡萄球菌菌液于試管中，分別加入9 mL磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST，0.01 moL/L PBS，pH 7.2，體積分?jǐn)?shù)0.05%的吐溫-20）進(jìn)行10 倍梯度稀釋?zhuān)脿I(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

1.3.2 免疫磁珠捕獲率的計(jì)算

按照下式計(jì)算免疫磁珠捕獲率[17]。

式中：CE為捕獲率/%;C0為總菌落數(shù)/（CFU/mL）;

Ca為磁分離后上清液中的菌落數(shù)/（CFU/mL）。

1.3.3 免疫磁珠富集條件優(yōu)化

1.3.3.1 免疫磁珠的制備

吸取50 ?L的500 nm鏈霉親和素磁珠（20 mg/mL）于1.5 mL滅菌離心管中，顛倒混勻PBS中的鏈霉親和素磁珠，洗滌磁珠，在磁力架上進(jìn)行磁場(chǎng)吸附，棄上清液;將磁珠重懸于1 mL 0.01 mol/L PBST，加入適量的含生物素標(biāo)記的鼠傷寒沙門(mén)氏菌抗體和金黃色葡萄球菌的多克隆抗體，在垂直混勻儀上輕柔振蕩，在室溫下孵育45 min;再進(jìn)行磁場(chǎng)吸附，棄去上清液;加入0.01 mol/L PBST（每次1 mL）洗滌磁珠3 次，每次5 min，磁場(chǎng)吸附，棄去上清液;最后將磁珠重懸在1 mL含有0.02 g/100 mL Na3N和0.1 g/100 mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBST中，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，免疫磁珠保存于4 ℃冰箱。

1.3.3.2 磁珠與抗體投料比的確定

吸取50 ?L的500 nm鏈霉親和素磁珠（20 mg/mL）于1.5 mL滅菌離心管中，顛倒混勻PBS中的鏈霉親和素磁珠，洗滌磁珠，在磁力架上進(jìn)行磁場(chǎng)吸附，棄上清液;將磁珠重懸于1 mL 0.01 mol/L PBST，分別加入2、6、10、20、30、40、50、60 ?L含生物素標(biāo)記的鼠傷寒沙門(mén)氏菌抗體和金黃色葡萄球菌的多克隆抗體，其磁珠與抗體的投料比分別100∶0.2、100∶0.6、100∶1.0、100∶2.0、100∶3.0、100∶4.0、100∶5.0、100∶6.0（m/m），在垂直混勻儀上輕柔振蕩，在室溫下孵育45 min;再進(jìn)行磁場(chǎng)吸附，棄去上清液;加入0.01 mol/L PBST（每次1 mL）洗滌磁珠3 次，每次5 min，磁場(chǎng)吸附，棄去上清液;最后將磁珠重懸在1 mL含有0.02 g/100 mL Na3N和0.1 g/100 mL BSA的PBST中。

分別投入制備好的免疫磁珠300 ?L混勻，將其置于磁力架上5 min使磁珠充分吸附后，將上清液移除;分別取1 mL 104 CFU/mL的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液和金黃色葡萄球菌菌液于已加免疫磁珠的1.5 mL離心管中，垂直混勻儀上室溫孵育45 min后，將其置于磁力架上5 min使磁珠充分吸附后，將上清液移至新的離心管中，取100 ?L上清液涂于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后觀(guān)察結(jié)果，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算吸附效率，每個(gè)樣品3 個(gè)平行。

1.3.3.3 免疫磁珠最適添加量的確定

分別投入制備好的免疫磁珠50、100、200、300、400、500、600 ?L于1.5 mL離心管中，將其置于磁力架上5 min使磁珠充分吸附后，將上清液移除;分別取1 mL 104 CFU/mL的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液和金黃色葡萄球菌菌液于已加免疫磁珠的1.5 mL離心管中，混勻;在垂直混勻儀上室溫孵育45 min后，將其置于磁力架上5 min使磁珠充分吸附后，將上清液移至新的離心管中;取100 ?L上清液涂于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后觀(guān)察結(jié)果，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算吸附效率，每個(gè)樣品3 個(gè)平行。

1.3.3.4 免疫磁珠與菌液最佳反應(yīng)時(shí)間的確定

分別取1 mL 104 CFU/mL的鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液和金黃色葡萄球菌菌液于1.5 mL離心管中，分別投入已經(jīng)確定的免疫磁珠最適加入量，混勻;在垂直混勻儀上分別室溫孵育5、15、30、45、60 min后，將其置于磁力架上5 min使磁珠充分吸附后，將上清液移至新的離心管中;取100 ?L上清液涂于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后觀(guān)察結(jié)果，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并計(jì)算吸附效率，每個(gè)樣品3 個(gè)平行。

1.3.3.5 免疫磁珠的使用

投入適量制備好的免疫磁珠，混勻，將其置于磁力架上5 min使磁珠充分吸附后，將上清液移除;取1 mL菌液于已加免疫磁珠的1.5 mL離心管中，在垂直混勻儀上室溫孵育最適時(shí)間后，將其置于磁力架上5 min使磁珠充分吸附后，將上清液移除，重復(fù)洗滌3 次，加入1 mL 0.01 mol/L PBS振蕩重懸磁珠，得到的致病菌-磁珠復(fù)合物用于后續(xù)的LAMP檢測(cè)。

1.3.4 LAMP檢測(cè)體系

1.3.4.1 DNA模板制備及引物的合成

樣品中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌與金黃色葡萄球菌經(jīng)過(guò)各自的免疫磁珠富集分離后，參照DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)制備DNA模板，-20 ℃保存。選取鼠傷寒沙門(mén)氏菌的invA基因和金黃色葡萄球菌的nuc基因設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如表1所示。

1.3.4.2 LAMP反應(yīng)體系

LAMP反應(yīng)體系為25 μL，各成分為：外引物（F3和B3）各0.2 μmol/L、內(nèi)引物（FIP和BIP）各1.6 μmol/L、

環(huán)引物（LoopF和LoopB）各0.8 μmol/L、dNTPs濃度1.4 mmol/L、甜菜堿濃度0.8 mmol/L、Mg2+濃度8.0 mmol/L、SYTO-9熒光染料0.5 μL、Bst DNA聚合酶8 U、DNA模板2 μL，超純水補(bǔ)充體積至25 μL，加石蠟油進(jìn)行密封。LAMP反應(yīng)在7500熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?3 ℃、30 s，預(yù)變性;63 ℃、15 s，63 ℃、45 s，共45 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào)。

1.3.5 IMS-LAMP方法的特異性檢測(cè)

利用本研究建立的鼠傷寒沙門(mén)氏菌IMS-LAMP法和金黃色葡萄球菌IMS-LAMP法對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌O157：H7、單核細(xì)胞增生李斯特菌和副溶血性弧菌進(jìn)行檢測(cè)，菌液濃度均為104 CFU/mL，根據(jù)曲線(xiàn)結(jié)果判定該方法的特異性。

1.3.6 人工污染牛肉中鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)所用牛肉從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)獲取，并通過(guò)國(guó)標(biāo)法

（GB 4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》和GB 4789.10—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》）鑒定出不含沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌。將過(guò)夜培養(yǎng)的鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)囵B(yǎng)后進(jìn)行平板計(jì)數(shù);各取1 mL已知菌液濃度的鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌菌液，加入到25 g牛肉樣品中，每個(gè)樣品均與225 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯混合，樣品均質(zhì)化后，使2 種致病菌的濃度為100～105 CFU/mL;沒(méi)有添加致病菌的牛肉樣品作為陰性對(duì)照，用本研究建立的2 種菌的IMS-LAMP法進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)該方法的靈敏度。對(duì)于人為添加濃度為100CFU/mL致病菌的牛肉樣品，在增菌培養(yǎng)1、3、5、7 h后，用IMS-LAMP法進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用7500熒光定量PCR儀自帶的分析軟件對(duì)LAMP的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行擴(kuò)增曲線(xiàn)和循環(huán)閾（circulation threshold，Ct）

值的分析。若Ct值≤35，且擴(kuò)增曲線(xiàn)為“S”形曲線(xiàn)，則為陽(yáng)性擴(kuò)增;若3538，則為陰性擴(kuò)增[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫磁珠投料比的確定

用不同體積的鼠傷寒沙門(mén)氏菌抗體和金黃色葡萄球菌多克隆抗體分別與1 mg的磁珠偶聯(lián)，制備不同投料比的免疫磁珠。由圖1可知，鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的捕獲率隨著抗體的增加而增加，鼠傷寒沙門(mén)氏菌的捕獲率在投料比為100∶1.0時(shí)達(dá)到最大，為52.60%，金黃色葡萄球菌的捕獲率在投料比為100∶0.6時(shí)達(dá)到最大，為50.87%。繼續(xù)增加抗體，2 種菌的捕獲率沒(méi)有明顯提高，甚至抗體加入過(guò)多，2 種菌的捕獲率有所降低，如投料比為100∶3.0時(shí)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌的捕獲率為48.65%，金黃色葡萄球菌的捕獲率為48.78%。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，鼠傷寒沙門(mén)氏菌免疫磁珠選取100∶1.0為最佳投料比，金黃色葡萄球菌免疫磁珠選取100∶0.6為最佳投料比，即每毫克磁珠的鼠傷寒沙門(mén)氏菌抗體偶聯(lián)量為10 ?L，金黃色葡萄球菌抗體偶聯(lián)量為6 ?L。

2.2 免疫磁珠的最適添加量

由圖2可知：鼠傷寒沙門(mén)氏菌免疫磁珠添加量為50、100、200、300、400、500、600 ?L的捕獲率分別為18.77%、17.74%、35.99%、38.56%、51.93%、51.41%和49.36%，金黃色葡萄球菌免疫磁珠添加量為50、100、200、300、400、500、600 ?L的捕獲率分別為11.34%、15.07%、43.58%、54.33%、53.88%、53.28%和52.69%;隨著免疫磁珠添加量的增加，2 種菌的捕獲率逐漸升高，鼠傷寒沙門(mén)氏菌免疫磁珠添加量高于400 ?L，其捕獲率逐漸趨于平穩(wěn);金黃色葡萄球菌免疫磁珠添加量高于300 ?L，其捕獲率逐漸趨于平穩(wěn);繼續(xù)增加免疫磁珠，則會(huì)出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，使免疫磁珠的捕獲率下降，影響實(shí)驗(yàn)效果。故1 mL的反應(yīng)體系中，鼠傷寒沙門(mén)氏菌免疫磁珠的最適添加量為400 ?L，金黃色葡萄球菌免疫磁珠的最適添加量為300 ?L。

2.3 免疫磁珠與菌液的最佳反應(yīng)時(shí)間

由圖3可知：免疫磁珠與菌液孵育5 min和15 min時(shí)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌的捕獲率為16.91%和26.26%，金黃色葡萄球菌的捕獲率為32.00%和48.40%，說(shuō)明15 min內(nèi)，免疫磁珠未能與細(xì)菌充分結(jié)合;鼠傷寒沙門(mén)氏菌免疫磁珠的捕獲率在45 min達(dá)到最大值52.16%，金黃色葡萄球菌免疫磁珠的捕獲率在30 min達(dá)到最大值56.80%。但孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不利于反應(yīng)的進(jìn)行，不僅會(huì)使富集到的細(xì)菌在長(zhǎng)時(shí)間的孵育振蕩過(guò)程中脫落、降低捕獲率，也增加了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，不利于細(xì)菌的快速檢測(cè)。故鼠傷寒沙門(mén)氏菌免疫磁珠的最佳孵育時(shí)間為45 min，金黃色葡萄球菌免疫磁珠的最佳孵育時(shí)間為30 min。

2.4 IMS-LAMP方法的特異性

由圖4可知，對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌與6 株非鼠傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，只有鼠傷寒沙門(mén)氏菌和陽(yáng)性質(zhì)粒有明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)，而非鼠傷寒沙門(mén)氏菌與陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)檢出，說(shuō)明本方法對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌有較好的檢測(cè)特異性。

由圖5可知，對(duì)金黃色葡萄球菌與6 株非金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)，只有金黃色葡萄球菌和其陽(yáng)性質(zhì)粒有明顯的擴(kuò)增曲線(xiàn)，而非金黃色葡萄球菌與陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)檢出，說(shuō)明本方法對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的檢測(cè)特異性。

2.5 人工污染牛肉中鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)梯度進(jìn)行3 次平行檢測(cè)，若3 次全為陽(yáng)性，則陽(yáng)性率為100.00%，2 次為陽(yáng)性，則陽(yáng)性率為66.67%，1 次為33.33%。由表2可知，當(dāng)鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液濃度降至1.2×102 CFU/mL時(shí)，檢測(cè)陽(yáng)性率從100.00%降為33.33%，該濃度下3 次檢測(cè)中只有1 次檢測(cè)到鼠傷寒沙門(mén)氏菌，后續(xù)濃度的陽(yáng)性率為0%，說(shuō)明該方法對(duì)牛肉中鼠傷寒沙門(mén)氏菌的檢測(cè)靈敏度為1.2×103 CFU/mL。對(duì)于鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌液濃度1.2×100 CFU/mL的樣品，增菌5 h即可全部檢出。

由表3可知，當(dāng)金黃色葡萄球菌菌液濃度降至4.4×103 CFU/mL時(shí)，檢測(cè)陽(yáng)性率從100.00%降為66.67%，該濃度下3 次檢測(cè)中有2 次檢測(cè)到金黃色葡萄球菌，后續(xù)濃度陽(yáng)性率為0%，說(shuō)明該方法對(duì)牛肉中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)靈敏度為4.4×104 CFU/mL。對(duì)于金黃色葡萄球菌菌液濃度4.4×100 CFU/mL的樣品，增菌7 h即可全部檢出。

3 討 論

近年來(lái)，免疫磁珠技術(shù)在食品樣品目標(biāo)微生物的分離和濃縮過(guò)程中發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用，這一過(guò)程比傳統(tǒng)的離心或過(guò)濾方法更有效[19]。傳統(tǒng)免疫磁珠將抗體固定到磁珠上，采用共價(jià)偶聯(lián)法，利用磁珠表面特殊的活化基團(tuán)，如羧基和氨基等，與抗體蛋白上的氨基或羧基基團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)。該方法雖然簡(jiǎn)單，但吸附抗體易受pH值、單分散性等微小條件變化的影響，且所用磁珠需要過(guò)夜活化和偶聯(lián)[20-21]。鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)具有良好的反應(yīng)特異性和較高的親和力，鏈霉親和素是一種四聚體蛋白，利用氫鍵和范德華力結(jié)合4 個(gè)生物素分子[22]。磁珠的粒徑是影響免疫磁珠捕獲性能的重要因素，諸多研究表明，納米磁珠比微米磁珠能更好地捕獲微生物[23-25]。本研究所用的500 nm鏈霉親和素磁珠能與生物素化的鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌抗體高效結(jié)合，把生物素化抗體緊密地固定在磁珠上。經(jīng)過(guò)體系優(yōu)化，對(duì)于1 mL的反應(yīng)體系，鼠傷寒沙門(mén)氏菌免疫磁珠的最佳投料比為100∶1.0，最適添加量為400 ?L，最佳孵育時(shí)間為45 min;金黃色葡萄球菌免疫磁珠的最佳投料比為100∶0.6，最適添加量為300 ?L，最佳孵育時(shí)間為30 min。

核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可在等溫條件下對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行檢測(cè)，相比傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，不再需要昂貴的熱循環(huán)裝置，而LAMP技術(shù)就是一種高靈敏度的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該方法額外利用2 條環(huán)引物，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間[26-27]。現(xiàn)在，利用LAMP反應(yīng)產(chǎn)物可與熒光染料結(jié)合的特點(diǎn)，在反應(yīng)體系中加入不同的熒光染料，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)LAMP反應(yīng)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，避免肉眼觀(guān)察誤差[28-30]。本研究將IMS技術(shù)與LAMP技術(shù)相結(jié)合建立鼠傷寒沙門(mén)氏菌與金黃色葡萄球菌IMS-LAMP檢測(cè)方法，方法特異性好，對(duì)于牛肉中鼠傷寒沙門(mén)氏菌的檢測(cè)靈敏度為

1.2×103 CFU/mL，增菌5 h后，檢測(cè)限可達(dá)1.2 CFU/mL。金黃色葡萄球菌的靈敏度為4.4×104 CFU/mL，增菌7 h后，檢測(cè)限可達(dá)4.4 CFU/mL。該方法利用IMS技術(shù)對(duì)2 種致病菌進(jìn)行濃縮吸附（<1 h），簡(jiǎn)化樣品的處理過(guò)程，并用LAMP技術(shù)快速確認(rèn)（<45 min），可以在1 個(gè)工作日內(nèi)完成樣品分析。因而，本研究建立的IMS-LAMP方法可作為檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的重要方法，對(duì)于被這2 種病菌污染的牛肉樣品，可在食用前進(jìn)行快速、簡(jiǎn)單和低成本的檢測(cè)，降低食源性疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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