姚沖學(xué)， 王方， 王智紅， 呂婷， 劉宇， 肖劍， 陳明勇

(云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明650091)

兩棲類蝌蚪的生長發(fā)育受多種環(huán)境因素的綜合影響，如溫度、食物、種群密度、水位變化和天敵等。有關(guān)兩棲類蝌蚪生長發(fā)育的研究得到廣泛關(guān)注，無尾目Anura如東北林蛙Ranadybowskii(衛(wèi)功慶等，2003)、中國林蛙Ranachensinensis(王漢屏，2007)、棘腹蛙Quasipaaboulengeri(陳高鵬等，2010；徐敬明等，2018)、澤陸蛙Fejervaryamultistriata(施林強(qiáng)等，2011)、大樹蛙Rhacophorusdennysi(謝文華等，2014)、棘胸蛙Quasipaaspinosa(章海鑫等，2014；毛劍婷等，2017)、中華蟾蜍Bufogargarizans(李軍德等，2016)等；有尾目Caudata如紅螺疣螈Tylototritonshanjing(王本君等，2017)等。密度是影響蝌蚪生長發(fā)育的重要因素(謝文華等，2014)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，高密度會導(dǎo)致中國林蛙、澤陸蛙和大樹蛙的蝌蚪生長率下降、發(fā)育時(shí)間延長；Semlitsh和Caldwell(1982)也發(fā)現(xiàn)，高密度會導(dǎo)致霍氏掘足蟾Scaphiopusholbrooki蝌蚪發(fā)育時(shí)間縮短。在諸多研究中，密度常與其他因子一起作為綜合因子來研究，而把密度作為單因子或主要因子來研究其影響兩棲類蝌蚪生長發(fā)育的報(bào)道很少。

大蹼鈴蟾Bombinamaxima隸屬于無尾目鈴蟾科Bombinatoridae鈴蟾屬Bombina，生活在海拔 2 000～3 300 m的靜水塘、山溪緩流處石塊下、井泉、路旁小溝內(nèi)，主要分布于四川(昭覺、宜賓等西南部高山區(qū))(費(fèi)梁，1999)、貴州(費(fèi)梁，1999)及云南(麗江、巧家、大姚、寧蒗、大理、賓川、洱源鄧川、東川、威信、武定等)(楊大同，饒定齊，2008)。對該種的研究主要見于皮膚分泌液中抗菌活性肽的分離純化及其性質(zhì)(賴仞等，1998；張?jiān)疲?006)、轉(zhuǎn)錄組深度分析及其免疫系統(tǒng)的功能研究(張英霞等，2008)、皮膚白蛋白的胰蛋白酶抑制劑活性研究(趙鋒等，2013)以及兩性異形(姚沖學(xué)等，2019)等方面。張?jiān)?2006)發(fā)現(xiàn)，從大蹼鈴蟾皮膚分泌物中提取的maximin 3抗菌肽對人類免疫缺陷病毒(艾滋病病毒)有明顯的抑制作用，因此，大蹼鈴蟾對艾滋病病毒防治藥物及其他科學(xué)研究具有重要價(jià)值。目前，有關(guān)大蹼鈴蟾蝌蚪生長發(fā)育的研究尚未見報(bào)道。本文主要研究密度對大蹼鈴蟾蝌蚪生長發(fā)育和存活率的影響，探索種群密度在該物種從幼體到成體的生長發(fā)育中的作用機(jī)制，為進(jìn)一步了解該物種提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2018年6月1日，將正在抱對的5對大蹼鈴蟾成體從云南昆明金殿水庫后山(102.776 185°E，25.093 346°N，海拔1 989 m)帶回實(shí)驗(yàn)室，分別放到水溫20～25 ℃、pH6.6～7.0、水深3 cm的容器盒(長25 cm×寬16 cm×高17 cm)中產(chǎn)卵，每一對所產(chǎn)的卵置于相同條件下自然孵化(每天09∶00用經(jīng)過氧氣泵加氧后的自來水換水一次)。為了消除親代遺傳、母體效應(yīng)等因素的影響(謝文華等，2014)，400只蝌蚪均來自同一親代，同時(shí)從400只剛孵化的蝌蚪中隨機(jī)抽取50只，用電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺(精度0.01 mm，上海恒量)測量：(1)全長(total length)：自吻端至尾末端的長度；(2)尾長(tail length)：自肛孔基部至尾末端的長度；(3)體寬(body width)：體兩側(cè)的最大寬度(費(fèi)梁，1999)。剛孵化的蝌蚪全長8.99 mm±0.10 mm(n=50)、尾長3.67 mm±0.09 mm(n=50)、體寬3.12 mm±0.06 mm(n=50)，并以此為各組剛孵化的測定值。

1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)器材與設(shè)備主要有：便攜式pH計(jì)、上海恒量電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺(精度0.01 mm)、GPS、撈網(wǎng)、直尺、解剖盤、圓規(guī)、容器盒等。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將剛孵化的400只大蹼鈴蟾蝌蚪隨機(jī)分成A組(30只/L)、B組(60只/L)和C組(90只/L)3個(gè)組(由于帶回實(shí)驗(yàn)室的 5對中產(chǎn)卵量最多一對為473粒，但只有405粒卵成功孵化，蝌蚪總數(shù)量有限，因此沒有設(shè)置重復(fù)組)。實(shí)驗(yàn)組各設(shè)置1個(gè)平行組，平行組的個(gè)體數(shù)量、投食量和水量與實(shí)驗(yàn)組一致。當(dāng)實(shí)驗(yàn)組中有蝌蚪死亡時(shí)，分別從相應(yīng)的平行組中抽取與死亡個(gè)體全長相同或相近的個(gè)體進(jìn)行補(bǔ)充(謝文華等，2014)。蝌蚪飼養(yǎng)在水溫20～25 ℃、pH6.6～7.0、水深3 cm的容器盒中，5 d為一個(gè)測量周期，分別從每組中隨機(jī)抽取20只測量全長、尾長、體寬，并記錄每個(gè)測量周期內(nèi)各組死亡數(shù)量，共測量8次。每天換水后將顆粒狀魚飼料研磨成粉末投食1次，A、B、C組投食量分別為0.1 g、0.2 g、0.3 g。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用Excel和SPSS 23.0處理數(shù)據(jù)。首先用Kolmogorov-Smirnov和Levene分別檢測所有數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差同質(zhì)性，當(dāng)測量數(shù)據(jù)符合正態(tài)性和方差同質(zhì)性時(shí)，相關(guān)分析采用Pearson檢驗(yàn)，否則用Spearman檢驗(yàn)。當(dāng)測量數(shù)據(jù)符合正態(tài)性和方差同質(zhì)性時(shí)，可以直接進(jìn)行方差分析，否則將數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換以達(dá)到正態(tài)性和方差同質(zhì)性后進(jìn)行方差分析。以各組密度為自變量，蝌蚪的其他形態(tài)指標(biāo)(全長、尾長和體寬)分別為因變量做一元線性回歸分析，通過各組中一元回歸方程斜率判斷密度對大蹼鈴蟾蝌蚪生長發(fā)育的影響程度。描述統(tǒng)計(jì)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，顯著性水平設(shè)置為α=0.05。全長、尾長和體寬的生長率=(每組第40天測定值-剛孵化的測定值)/40 d(徐敬明等，2018)。

2 結(jié)果

2.1 密度對大蹼鈴蟾蝌蚪生長發(fā)育的影響

3組蝌蚪均呈早期快速生長、后期生長率逐漸減小的特點(diǎn)，飼養(yǎng)到40 d時(shí)，全長、尾長和體寬表現(xiàn)為：A組>B組>C組。C組蝌蚪第30天已經(jīng)進(jìn)入變態(tài)期，而A組和B組第35天才開始進(jìn)入變態(tài)期。變態(tài)期時(shí)3組蝌蚪的全長、尾長和體寬達(dá)到最大值(表1)。

密度與全長、尾長和體寬均具有顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，全長、尾長和體寬的r值為：A組

密度與形態(tài)特征均具有顯著相關(guān)性(P<0.05)，全長、尾長和體寬的一元線性回歸斜率為：A組

2.2 密度對存活率及全長、尾長和體寬生長率的影響

密度與存活率間有顯著相關(guān)性(r=0.877，P<0.01)。飼養(yǎng)第1～10天內(nèi)，A、B和C 3組的存活率分別為0.93、0.92和0.92；第25天后各組存活率均急劇下降，分別為0.83、0.78和0.74(圖1)。

表1 不同發(fā)育時(shí)段大蹼鈴蟾蝌蚪的全長、尾長和體寬Table 1 Descriptive statistics of the total length， tail length and body width of Bombina maxima tadpolesat different growth periods

飼養(yǎng)到第40天時(shí)，A、B和C 3組的全長生長率分別為0.49、0.44和0.34，尾長生長率分別為0.31、0.29和0.22，體寬生長率分別為0.11、0.10和0.08(圖1)。

3 討論

生存空間一定時(shí)，種群密度的增加會減小蝌蚪的生存空間，導(dǎo)致種內(nèi)競爭加劇，從而影響蝌蚪的生長發(fā)育和存活率(Relyea，2002；Relyea & Hoverman，2003)。本研究結(jié)果表明，3組蝌蚪均呈早期快速生長、后期生長緩慢的特點(diǎn)，并且在每個(gè)生長測定點(diǎn)內(nèi)，高密度飼養(yǎng)下的形態(tài)特征均小于低密度。密度對大蹼鈴蟾蝌蚪的生長發(fā)育和存活率有顯著的影響，隨著密度增加，大蹼鈴蟾蝌蚪生長率逐漸減小，存活率逐漸降低，這與中國林蛙(王漢屏，2007)、大樹蛙(謝文華等，2014)等相關(guān)研究的結(jié)論一致。隨發(fā)育時(shí)間增加，3組的生長率存在明顯的差異，B組和C組蝌蚪的生長率較A組慢，這可能是B組和C組蝌蚪隨著飼養(yǎng)時(shí)間增加，自身不斷生長，在有限的空間內(nèi)物理性接觸的機(jī)會較A組多，種內(nèi)競爭加劇，從而影響生長速率。Petranka(1989)發(fā)現(xiàn)豹蛙Ranapipiens蝌蚪在種內(nèi)競爭加劇的情況下，生長速度快、較大個(gè)體的蝌蚪會分泌抑制素來降低較小個(gè)體的生長率，大蹼鈴蟾蝌蚪是否具有類似的行為有待進(jìn)一步研究。

表2 大蹼鈴蟾蝌蚪全長、尾長和體寬與密度的線性回歸Table 2 Linear regression of the total length， tail length and body width withthe density of Bombina maxima tadpoles

圖1 密度對大蹼鈴蟾蝌蚪的存活率(上)及其生長率(下)的影響Fig. 1 Effects of density on the survival rate (upper) and growth rate (bottom) of Bombina maxima tadpoles

本研究結(jié)果表明，密度對大蹼鈴蟾蝌蚪的存活率具有顯著的影響，即密度越大，存活率越低。飼養(yǎng)早期3組存活率差異不大，中后期3組的存活率急劇下降，而且在每個(gè)生長測定點(diǎn)內(nèi)低密度飼養(yǎng)下的存活率始終大于高密度。這可能是蝌蚪生長引起生存空間縮小和溶氧量過度消耗，以及種內(nèi)競爭加劇導(dǎo)致了死亡率升高(謝文華等，2014)，前期蝌蚪較小，生存空間相對寬裕，種間競爭較小，存活率較高。在飼養(yǎng)過程中也發(fā)現(xiàn)蝌蚪相互撕咬尾巴和取食死亡蝌蚪尸體的現(xiàn)象，高密度組下飼養(yǎng)的蝌蚪個(gè)體間接觸機(jī)會較多、相互撕咬的機(jī)率較大，這也是高密度組死亡率增加的一個(gè)主要原因。由此表明，在大蹼鈴蟾蝌蚪的發(fā)育期，密度性制約因素對蝌蚪的存活率影響較為顯著。

本研究還發(fā)現(xiàn)，C組第30天時(shí)進(jìn)入變態(tài)期，而A組和B組第35天進(jìn)入變態(tài)期。說明高密度組較低密度組更早進(jìn)入變態(tài)期。進(jìn)入變態(tài)期前，3組蝌蚪的形態(tài)指標(biāo)達(dá)到了最大值，表現(xiàn)為A組>B組>C組，進(jìn)入變態(tài)期后，形態(tài)特征逐漸減小。說明密度越大，蝌蚪進(jìn)入變態(tài)期時(shí)的全長、尾長和體寬越小。由此可推測，高密度飼養(yǎng)下的蝌蚪較早進(jìn)入變態(tài)期，這可能是蝌蚪生長發(fā)育過程中對高密度環(huán)境的一種適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制。

綜上所述，有關(guān)密度對兩棲類蝌蚪生長發(fā)育的影響已經(jīng)有很多研究報(bào)道，但大多數(shù)都只是將密度作為綜合因子之一來進(jìn)行分析，并且結(jié)論不一，也不能完全反映出密度這一因子的影響成效。本文以密度為主要因子研究其對大蹼鈴蟾蝌蚪生長發(fā)育和存活率的影響，結(jié)果表明，密度越大，大蹼鈴蟾蝌蚪的生長率和存活率越低，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測在高密度飼養(yǎng)下的蝌蚪較低密度組更早進(jìn)入變態(tài)期。影響大蹼鈴蟾蝌蚪生長發(fā)育的其他環(huán)境因素很多，如溫度、食物、水位變化和天敵等，其作用機(jī)理和程度仍有待進(jìn)一步研究。