王少敏， 牛 穎， 代 敏， 魏 一， 劉宏民

(1.鄭州大學 化學與分子工程學院 河南 鄭州 450001； 2. 新藥創(chuàng)制與藥物安全性評價河南省協(xié)同創(chuàng)新中心 河南 鄭州 450001)

0 引言

基因毒性物質(zhì)是一類能對DNA結構造成破壞而產(chǎn)生致癌性的物質(zhì)，因此對藥物中此類物質(zhì)的檢測引起人們廣泛關注[1-3].在制藥過程中，烷基磺酸常用作原料藥的成鹽試劑來提高藥物的穩(wěn)定性和溶解性，磺酸酯的前體物質(zhì)(如磺酰氯)也常用作反應試劑或催化劑，這些應用都可能生成磺酸酯類基因毒性物質(zhì)[4].替比培南酯是第1個可口服的碳青霉烯類抗生素，對大多數(shù)臨床分離的菌株均具有比青霉素及頭孢類抗生素更強的抗菌性，但由于在其側鏈的生產(chǎn)中使用了甲磺酰氯[5]，會與殘留的溶劑醇生成甲磺酸酯，因此需要對替比培南酯側鏈中的甲磺酸酯類雜質(zhì)進行檢測.

目前檢測甲磺酸酯的方法主要有GC-MS法[6-10]、LC-MS法[11-13]和氣相色譜-微池電子捕獲法[14].微池電子捕獲檢測器靈敏度高，但線性范圍窄；質(zhì)譜(MS)檢測器因具有選擇性強、靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)勢而成為重要的檢測手段[15].由于直接進樣測定難以避免原料藥本身對儀器的污染及離子化效率低等問題，在GC-MS方法中，使用低揮發(fā)性的衍生試劑，通過頂空萃取揮發(fā)性衍生產(chǎn)物可有效降低基質(zhì)干擾.目前采用較多的方法是以乙腈/水(體積比80∶20)混合溶劑為衍生基質(zhì)的碘化鈉衍生方法[9-10]，本文改進了碘化鈉衍生方法，將甲磺酸酯與碘化鈉在2-己酮/水(體積比3∶97)溶劑中反應得到相應的碘代烷烴產(chǎn)物，在優(yōu)化樣品的頂空萃取條件和色譜條件的基礎上，實現(xiàn)了同時對7種甲磺酸酯類雜質(zhì)的定性、定量檢測，可用于活性物質(zhì)中甲磺酸酯類雜質(zhì)的檢測.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Trace ISQTM氣質(zhì)聯(lián)用儀，配套有Triplus頂空自動進樣器、頂空進樣瓶(20 mL)和Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(EI離子源，美國Thermo Scientific公司)；FiveEasy PlusTM pH計(瑞士Mettler Toledo公司)；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司).

甲磺酸甲酯(MMS，98.0%，吳?；瘜W有限公司)；甲磺酸正丙酯(n-PMS)和甲磺酸異丁酯(i-BMS)(>98.0%，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；甲磺酸仲丁酯(s-BMS)和甲磺酸正丁酯(n-BMS)(>98.0%，蘇州麥凱生物醫(yī)藥科技有限公司)；甲磺酸乙酯(EMS，98.5%)、甲磺酸異丙酯(i-PMS，97.0%)、碘化鈉(99.0%)、2-己酮(99.0%)(百靈威科技有限公司)；內(nèi)標CHCl3(99.8%，J. T. Baker公司)；硫代硫酸鈉(99.0%，Sigma Aldrich公司)；其他試劑均為色譜純或分析純.

1.2 溶液的配制

衍生試劑：稱取60 g 碘化鈉和30 mg硫代硫酸鈉，加水溶解并稀釋至50 mL，搖勻備用.

內(nèi)標溶液：量取CHCl3適量，用2-己酮溶解并稀釋，配制質(zhì)量濃度為14.84 g/L的內(nèi)標儲備液，再用超純水稀釋至質(zhì)量濃度為7.42 mg/L的內(nèi)標溶液，搖勻備用.

甲磺酸酯類混合標準溶液：精密量取MMS、EMS、i-PMS、n-PMS、s-BMS、i-BMS、n-BMS標準品適量，用2-己酮溶解并稀釋，配制質(zhì)量濃度約為5 g/L的儲備液，搖勻，于4 ℃冷藏備用.精密量取標準品儲備液適量，用超純水分別稀釋至質(zhì)量濃度約為1、1、3、2、2、2、2 mg/L的混合標準溶液，現(xiàn)制現(xiàn)用.

1.3 衍生反應

混合標準溶液的衍生：精密量取混合標準溶液200 μL置于20 mL頂空瓶中，加入超純水320 μL、2-己酮30 μL、內(nèi)標溶液50 μL和衍生試劑400 μL，立即加蓋密封，渦旋混勻，于60 ℃下反應20 min.

樣品溶液的衍生：精密稱取原料藥25 mg置于20 mL頂空瓶中，加入超純水520 μL和2-己酮30 μL，渦旋使其溶解，再加入內(nèi)標溶液50 μL和衍生試劑400 μL，立即加蓋密封，渦旋混勻，于60 ℃下反應20 min.

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為TR-wax MS柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升溫：40 ℃保持6 min，然后以20 ℃/min升至240 ℃，保持5 min；載氣為高純氦氣；流速為0.8 mL/min，恒流模式；進樣口溫度200 ℃；進樣量100 μL；進樣方式為分流進樣，分流比50∶1；孵化室溫度80 ℃，平衡時間為30 min.質(zhì)譜條件：離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；EI離子源能量70 eV；檢測模式為選擇離子掃描(SIM).定量監(jiān)測離子：m/z142(碘甲烷)，m/z156(碘乙烷)，m/z170(碘代正丙/異丙烷)，m/z184(碘代正丁/異丁/仲丁烷)；m/z83(CHCl3).定性監(jiān)測離子：m/z127(碘代烷烴)，m/z118(CHCl3).

2 結果分析與討論

2.1 衍生反應條件

2.1.1反應溶劑和用量 目前的碘化鈉衍生方法均是以乙腈/水(體積比80∶20)混合溶劑為衍生基質(zhì)，衍生結束后經(jīng)頂空萃取，大量的強極性乙腈進入儀器中會產(chǎn)生很強的溶劑峰，不僅降低離子源燈絲的壽命，還容易引起色譜柱的填料流失.因此，對一些出峰位置不干擾檢測物目標組分的有機相進行了考察.按1.3所述過程操作，其他條件不變，分別加入30 μL的有機相苯甲醚、氯苯、正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸正丁酯、2-庚酮、正丁醇、2-己酮，與未加入有機相的各組分對比分析，發(fā)現(xiàn)2-己酮效果最好.同時對2-己酮的用量也進行了優(yōu)化，確定2-己酮/水(體積比3∶97)的最佳用量為30 μL.

2.1.2衍生試劑用量 分別加入0.2、0.3、0.4、0.5 mL衍生試劑，按1.3所述過程操作，通過調(diào)整超純水用量使頂空瓶內(nèi)的液體總量保持在1 mL.結果表明，當衍生試劑加入0.4 mL時可達到最佳衍生效果，略低于文獻[9-10]中0.5 mL的用量.

2.1.3衍生溫度和時間 按1.3所述過程操作，分別在40、50、60、70 ℃下衍生反應20 min后進樣測定，發(fā)現(xiàn)60 ℃下衍生效果最佳.在此基礎上，考察了反應時間10、20、30、40 min對衍生反應的影響，確定最佳反應時間為20 min.

2.2 頂空萃取條件

將衍生后的樣品分別在50、60、70、80 ℃下平衡30 min后頂空進樣分析.結果發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，所檢測到的組分含量逐漸增大，其中相對分子質(zhì)量高的化合物受溫度的影響程度較大，考慮到頂空瓶內(nèi)壓力和氣密性等問題，選擇在80 ℃下平衡.在此基礎上，考察了在80 ℃下平衡時間對分析結果的影響，結果表明，平衡30 min時萃取效果最好，因此將頂空萃取條件設為80 ℃下平衡30 min.

2.3 混合標準溶液和衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性

將新制的甲磺酸酯類混合標準溶液于室溫下放置，依次取放置0、20、40、60、80 min的樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)在20 min內(nèi)各個組分可保持穩(wěn)定，超出20 min后，s-BMS最容易分解，其次是i-PMS和i-BMS.對衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性進行考察，4個由混合標準溶液配制的樣品衍生后于室溫下放置，每隔24 h檢測1個樣品，發(fā)現(xiàn)碘代烷烴產(chǎn)物在3 d內(nèi)都能保持穩(wěn)定.

2.4 方法學驗證

2.4.1線性范圍、精密度和回收率 將甲磺酸酯類混合標準溶液稀釋至7個質(zhì)量濃度，以目標物和內(nèi)標的峰面積比對樣品質(zhì)量濃度進行線性回歸，得到線性回歸方程及相關系數(shù).通過混合標準溶液逐級稀釋，由信號響應信噪比(S/N)來確定檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)，結果如表1所示.分析物標準曲線的線性相關系數(shù)均大于0.999 0，檢出限為0.21～2.64 μg/L，定量限為0.70～8.81 μg/L，對應的實際樣品的檢出限為8.4～106 ng/g，定量限為28～352 ng/g.取混合標準溶液(MMS、EMS、i-PMS、n-PMS、s-BMS、i-BMS、n-BMS的質(zhì)量濃度分別為10、9、27、18、22、22、18 μg/L)進行日內(nèi)、日間平行分析，經(jīng)過精密度計算，相對標準偏差(RSD，n=3)為0.95%～10.3%，滿足方法學的要求.稱取替比培南酯中間體樣品25 mg(含微量MMS、EMS和n-PMS雜質(zhì))，分別加入混合標準溶液(MMS、EMS、i-PMS、n-PMS、s-BMS、i-BMS、n-BMS的質(zhì)量濃度分別為10、9、27、18、22、22、18 μg/L)進行回收率試驗，各目標物的加標回收率為88.2%～115.1%(n=3)，滿足方法學的要求.

表1 甲磺酸酯類化合物的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、精密度和回收率Tab.1 The linear range, regression equation, correlation coefficient, precision and recovery of methanesulfonate compounds

2.4.2低級醇的干擾性實驗 文獻[9-10]中提出，空氣中的甲醇會與碘化鈉衍生試劑發(fā)生親核取代反應，生成碘甲烷，進而對檢測準確性造成一定的影響.而在本方法中，未見空白樣品中有甲醇帶來的干擾.作為補充，按照混合標準溶液的配制方法配制了甲醇和乙醇的混合溶液，于頂空瓶中的質(zhì)量濃度均為127 μg/L，按同樣的方法進行衍生分析，也未觀察到碘甲烷或碘乙烷譜峰的出現(xiàn)，表明空氣或樣品中殘留的甲醇或乙醇對該方法的檢測結果沒有影響.文獻[9-10]中的干擾可能是由于使用了大量有機相溶劑乙腈，促進了干擾產(chǎn)物的生成.

2.4.3樣品分析 按上述方法對某藥企生產(chǎn)的5批替比培南酯中間體進行分析，其SIM色譜圖如圖1所示.由圖1(a)可見，7 min內(nèi)所有目標化合物均已出峰，內(nèi)標CHCl3(IS)的保留時間為5.47 min，對應MMS、EMS、i-PMS、n-PMS、s-BMS、i-BMS、n-BMS的衍生物的保留時間分別為2.25、2.77、3.06、4.05、 4.91、5.17、6.43 min.圖1(b)中保留時間為3.68、3.80 min的峰來源于溶劑本底.圖1(c)為實際樣品的SIM色譜圖(圖1(c)中的小圖分別為實際樣品中m/z142、m/z156和m/z170的萃取離子流圖)，均檢出MMS、EMS和n-PMS，來源于生產(chǎn)中甲醇、乙醇、丙醇等溶劑與甲磺酰氯的副反應，而生產(chǎn)中未用到的異丙醇和正、異、叔丁醇沒有檢測到，5批樣品(S1～S5)的測定結果見表2.

圖1 混合標準品溶液(a)、空白溶液(b)和實際樣品(c)的SIM色譜圖Fig.1 Selected-ion monitoring chromatograms of mixed standard solution (a), blank solution (b) and the sample (c)

樣品S1S2S3S4S5MMS0.1810.1990.1760.2130.188EMS0.2780.4380.4110.3740.414n-PMS0.0860.1430.0870.1400.153

3 結論

文獻[8，12]中報道的色譜-質(zhì)譜法對藥物中甲磺酸酯類雜質(zhì)同時檢測的數(shù)量最多有4種，本文方法可以同時對7種甲磺酸酯類雜質(zhì)進行定性、定量分析，具有更廣泛的適用性.與基于碘化鈉衍生的GC-MS法相比，該方法避免了有機相乙腈的大量使用，僅使用少量2-己酮就可達到分析要求.由于衍生反應溶劑中有機相用量少，避免了空氣或樣品中殘留的甲醇或乙醇對檢測結果的影響.該方法具有適用范圍廣、靈敏度高、基質(zhì)干擾小等特點，可用于藥物中間體、原料藥及成品藥中甲磺酸酯類雜質(zhì)的檢測.