劉芳 張琳 張志信 張四純

摘要：基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜作為一種軟電離質(zhì)譜技術(shù)，可快速、可靠地從植物組織中獲得分子組成結(jié)構(gòu)信息，還可以通過(guò)成像的方式獲得成分分布信息，因此在藥用植物分析中受到了越來(lái)越多的關(guān)注。本文對(duì)基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像技術(shù)及其在藥用植物分析中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)和展望。

關(guān)鍵詞：基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜成像;藥用植物;直接分析;評(píng)述

1引言

藥用植物作為藥物開(kāi)發(fā)的重要資源受到了越來(lái)越多的重視，其成分分析成為生化、制藥和臨床研究的重要課題[1]。隨著儀器分析技術(shù)的發(fā)展，紫外光譜（UV）[2]、紅外光譜（IR）[3～5]、拉曼光譜（RamanSpectrum）[6]、色譜（GC/HPLC）[7～9]、質(zhì)譜（MS）[10]和核磁共振光譜（NMR）[11]等技術(shù)被廣泛用于藥用植物鑒定、化學(xué)成分分析及指紋圖譜的建立，推動(dòng)了藥用植物成分定性和定量分析的研究。其中，質(zhì)譜技術(shù)因具有較高的分辨率、選擇性和靈敏度成為藥用植物質(zhì)量控制、活性成分篩選及藥理毒理研究的有效工具。

基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（MALDI-MS）是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來(lái)的一種“軟”電離質(zhì)譜技術(shù)，具有碎片少、靈敏度高、分辨率高和高通量等特點(diǎn)，非常適用于復(fù)雜樣品體系研究[12]。采用MALDI-MS分析蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子時(shí)，可直接分析完整的蛋白質(zhì)分子，并具有高靈敏度、高離子傳輸和高采集速率的優(yōu)點(diǎn)，在生物化學(xué)領(lǐng)域得到了極大的關(guān)注，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有利工具[13]。新型基質(zhì)材料和基質(zhì)抑制劑以及無(wú)基質(zhì)材料的使用推動(dòng)了小分子化合物的MALDI-MS檢測(cè)的發(fā)展，此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用范疇也進(jìn)一步擴(kuò)展。MALDI-MS與成像技術(shù)結(jié)合，通過(guò)對(duì)組織切片表面的掃描，實(shí)現(xiàn)了組織中的分子（如蛋白質(zhì)、多肽、代謝產(chǎn)物）的原位分析，獲得了其空間分布信息，在藥用植物分析中具有很大的應(yīng)用潛力。已有一些綜述文章對(duì)各種質(zhì)譜成像技術(shù)在植物內(nèi)源性分子原位表征中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了介紹[14]。本文主要針對(duì)MALDI-MS成像技術(shù)在藥用植物分析中的應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)述，對(duì)該領(lǐng)域的研究工作進(jìn)行了總結(jié)和展望。

2基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜成像技術(shù)

2.1MALDI-MS的原理

目前被廣泛采用的MALDI-MS技術(shù)主要是MALDI與飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（Timeofflight，TOF）兩者的組合，工作原理如圖1所示。樣品與基質(zhì)先形成共結(jié)晶，激光（337nm的氮激光或355nm的固體激光）照射后，基質(zhì)吸收大部分的激光能量，將樣品分子送入氣相。同時(shí)，吸收能量后的基質(zhì)瞬間由固態(tài)變成氣態(tài)，形成基質(zhì)離子。被分析物與基質(zhì)離子相互碰撞的過(guò)程中，通過(guò)能量交換離子化。帶電荷的離子在飛行時(shí)間質(zhì)量分析器中按照質(zhì)荷比（m/z）的不同先后到達(dá)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[15]。離子化過(guò)程中，基質(zhì)先吸收激光的能量，然后再傳遞給樣品，對(duì)樣品起到了保護(hù)作用，所以離子化條件比較溫和;其次，高濃度的基質(zhì)將樣品分子彼此分開(kāi)，減弱了樣品分子之間的相互作用，使被分析物不容易形成簇群，因此它是一種軟電離技術(shù)，并具有高耐鹽、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，適用于大分子物質(zhì)和復(fù)雜樣品的測(cè)定。

2.2MALDI-MS的基質(zhì)選擇

在MALDI-MS技術(shù)中，基質(zhì)對(duì)樣品的離子化起至關(guān)重要的作用，不同基質(zhì)對(duì)分析物的離子化效率不同。近年出現(xiàn)了大量適用于生物大分子分析的基質(zhì)，如α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamicacid）、2，5-二羥基苯甲酸（2，5-Dihydroxyben-zoicacid）、2，5-二羥基苯乙酮（2，5-Dihydroxyacetophenone）、芥子酸（3，5-Dimethoxy-4-hydroxycinnamicacid）、3-羥基吡啶甲酸（3-Hydroxypicolinicacid）。但上述基質(zhì)大多在低分子量區(qū)域產(chǎn)生離子峰，使得小分子物質(zhì)的檢測(cè)受到了限制。隨著碳、硅、納米金等無(wú)機(jī)材[16]，新型有機(jī)分子基質(zhì)[17]的出現(xiàn)，以及基質(zhì)抑制劑[18]和無(wú)基質(zhì)材料[19]的使用，小分子化合物的MALDI檢測(cè)成為了可能[20～22]，此技術(shù)在藥用植物分析中的應(yīng)用也得到了進(jìn)一步的發(fā)展。

2.3MALDI-MS成像的操作流程

MALDI-MS成像（MALDI-MSI）的一般過(guò)程如圖2所示：在低溫（-16～-20℃）環(huán)境下，使用冷凍切片機(jī)將樣品進(jìn)行切片，獲取厚度為10～20μm的組織切片;將該組織切片用激光掃描儀進(jìn)行掃描，選用合適的基質(zhì)，借助于基質(zhì)噴涂?jī)x將其均勻覆蓋于組織切片表面，使基質(zhì)與分析物在原位形成共結(jié)晶。隨后，將裝載了組織切片的靶板送入質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜成像。

由MALDI-MSI的原理和操作流程可知，與其它藥用植物分析技術(shù)相比，MALDI-MSI具有以下特點(diǎn)[23，24]：可對(duì)植物組織切片直接進(jìn)行分析，樣品制備過(guò)程簡(jiǎn)單;獲取組織空間分布圖像時(shí)不需對(duì)組織中的檢測(cè)分子進(jìn)行體外標(biāo)記或染色，操作方便;具有較高的檢測(cè)靈敏度及較強(qiáng)的分子鑒定能力，測(cè)定時(shí)可在組織切片中同時(shí)找到多種分子，并提供這些分子在組織中空間分布的信息，為尋找、闡明和鑒定重要分子等提供了快速、原位、可視化的結(jié)果。

2.4MALDI成像與其它質(zhì)譜成像技術(shù)的比較

除MALDI-MSI外，質(zhì)譜成像技術(shù)還有很多種，目前應(yīng)用較多的是二次離子質(zhì)譜成像（Secondaryionmassspectrometryimaging，SIMSimaging）和解吸電噴霧離子化質(zhì)譜成像（Desorptionelectrosprayionizationmassspectrometryimaging，DESI-MSI）。這兩種質(zhì)譜成像方法的電離方式和MALDI不同，都無(wú)需基質(zhì)，避免了基質(zhì)質(zhì)譜峰的干擾，同時(shí)還避免了由基質(zhì)對(duì)樣品的溶解所引起的待測(cè)分子移位現(xiàn)象，確保了質(zhì)譜成像的準(zhǔn)確性。然而，DESI-MSI的空間分辨率較低，僅為100～200μm，并且難以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)大分子和非極性物質(zhì)的解離。SIMSimaging是目前空間分辨率最高的質(zhì)譜成像方法，可達(dá)50nm，但它的電離方式易產(chǎn)生碎片離子，而且對(duì)分子量>2kD的分析物顯現(xiàn)出較低的靈敏度[25，26]。

相比而言，MALDI-MSI可測(cè)定的分子質(zhì)量范圍最寬，但空間分辨率不及SIMSimaging。Soltwisch等[27]通過(guò)使用波長(zhǎng)可調(diào)諧的位置化激光器在氣相中二次引發(fā)類(lèi)似MALDI的離子化過(guò)程，提高了電離效率，同時(shí)分辨率也達(dá)到了微米級(jí)以下。目前，MALDI-MSI還存在不適合樣品定量分析的問(wèn)題。這是由于基質(zhì)與樣品形成的共結(jié)晶在組織切片上分布不均勻，以及激光會(huì)剝蝕結(jié)晶表面造成樣品的損耗等原因造成的[28]。

3藥用植物的MALDI-MSI分析

MALDI-MS的軟離子化方式對(duì)待測(cè)物的破壞很小，形成的離子多是單電荷離子，譜圖解析更容易，因此在藥用植物相關(guān)領(lǐng)域逐漸得到關(guān)注[29～32]。對(duì)藥用植物成分進(jìn)行分析時(shí)，以往需要將藥用植物研磨成粉末，然后選用合適的溶劑來(lái)進(jìn)行提取、分離和純化，純化后的成分進(jìn)行測(cè)定。提取時(shí)常需采用不同的溶劑，并通過(guò)色譜進(jìn)行分離，樣品制備過(guò)程復(fù)雜費(fèi)時(shí)，導(dǎo)致活性成分被損壞或損失。而且，通過(guò)單一的樣品制備過(guò)程也不能將藥用植物中的活性成分完全提取出來(lái)，導(dǎo)致了分析結(jié)果的不準(zhǔn)確性。因此，對(duì)藥用植物組織的化學(xué)成分進(jìn)行直接分析顯得尤為重要。

3.1藥用植物MALDI-MSI分析的制備技術(shù)

藥用植物的MALDI-MSI分析是否能獲得高質(zhì)量的質(zhì)譜與樣品的制備技術(shù)密切相關(guān)[33，34]。組織切片的制備是MALDI-MSI的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。冷凍切片因具有快速、簡(jiǎn)便、易操作、易于保持組織原有形態(tài)等優(yōu)點(diǎn)，成為MALDI-MSI樣品切片的首選方法[35]。植物細(xì)胞因有細(xì)胞壁和大液泡，含水量較多，在低溫冷凍過(guò)程中容易形成冰晶。對(duì)于不同的植物，甚至同一植物的不同器官，其質(zhì)地及含水量的差異也較大，因此給切片過(guò)程造成了困擾[36～38]。

通常植物組織在切片前先將其在-80℃冷凍，冷凍后的樣品使用冷凍切片包埋劑（OCT）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）或水進(jìn)行固定[39]。使用OCT時(shí)只能固定樣品，不能將樣品包埋起來(lái)，因?yàn)镺CT含有的多聚物會(huì)嚴(yán)重干擾質(zhì)譜測(cè)定。切片溫度選擇-16～-20℃時(shí)可獲得厚度為10～20μm的完整切片，溫度過(guò)低易導(dǎo)致植物組織片破碎。組織切片越薄，圖譜質(zhì)量越好。

切片后將基質(zhì)溶液均勻地覆蓋于組織切片表面，與組織表面分子形成良好的共結(jié)晶?；|(zhì)覆蓋的方法主要有3種：手動(dòng)噴涂、全自動(dòng)噴霧和真空升華[40]。Huang等[41]利用一個(gè)小型加濕器沉積基質(zhì)，不但成本低廉，而且獲得了直徑<10μm的基質(zhì)晶體，提高了靈敏度。目前，還出現(xiàn)了利用多孔納米材料開(kāi)發(fā)出來(lái)的離子化輔助基板[19]，利用毛細(xì)作用使待測(cè)樣品的分子上升到組織切片表面，實(shí)現(xiàn)成像分析。這種離子化輔助基板的使用省略了基質(zhì)覆蓋的操作步驟，極大縮短了樣品的處理時(shí)間。但只適用于小分子化合物的分析，并且離子化的機(jī)理還不清楚。

3.2MALDI-MSI在藥用植物分析中的應(yīng)用

MALDI是研究?jī)?nèi)源性代謝產(chǎn)物的有力工具。Wu等[42]對(duì)4種藥用植物進(jìn)行了MALDI-MS測(cè)定，結(jié)果表明，使用MALDI-MS直接分析藥用植物切片，進(jìn)而可快速提供可靠有效成分信息。這種從植物組織的直接分析中快速收集信息的方法，對(duì)于新化合物的發(fā)現(xiàn)和藥用植物的質(zhì)量控制具有重要價(jià)值。Ng等[43]在MALDI-MS對(duì)藥用植物組織直接測(cè)定的基礎(chǔ)上，通過(guò)改良MALDI靶板，記錄激光照射植物組織時(shí)垂直和水平軸的位置，然后根據(jù)不同產(chǎn)地青藤莖部組織區(qū)域徑向距離對(duì)應(yīng)的6種代謝物的質(zhì)譜信號(hào)（圖3），發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)區(qū)域的青藤莖部3種代謝物（m/z356、342和314）呈特異性空間分布，其它代謝物則沒(méi)有表現(xiàn)出這種特點(diǎn)。這項(xiàng)研究表明，MALDI-MS是一種對(duì)藥用植物代謝物空間分布研究具有潛力的方法。

在專(zhuān)門(mén)的成像軟件控制下，目前的MALDI-MSI技術(shù)就可實(shí)現(xiàn)采集數(shù)據(jù)后自動(dòng)成像的功能，并同時(shí)提供樣本表面多種分子組成、豐度及原位空間分布信息，因此，該項(xiàng)技術(shù)在藥用植物研究方面凸顯優(yōu)勢(shì)，已逐漸成為質(zhì)譜領(lǐng)域的研究新趨勢(shì)之一（表1）。

MALDI-MSI用于人參皂苷的研究較多，Taira等[44]用MALDI-MSI觀測(cè)了人參皂苷Rb1、Rb2、Rc和Rf的分布，發(fā)現(xiàn)人參皂苷在側(cè)根皮層和周皮中的分布比髓質(zhì)多。同時(shí)，皂苷在根尖（直徑2.7mm）處的分布多于根的中心（直徑7.3mm）。原人參二醇型人參皂苷（Rb1、Rb2、Rc）與原人參三醇型皂苷（Rf）的分布量也存在差異。Bai等[48]利用MALDI-MSI建立了一種簡(jiǎn)單、可靠的方法直接檢測(cè)人參組織中的皂苷，共檢測(cè)到20種原人參二醇型皂苷、7種原人參三醇型皂苷、1種齊墩果酸型皂苷以及3種其它類(lèi)型皂苷，并通過(guò)MALDI-TOFMS/MS進(jìn)行了鑒定。這些皂苷依據(jù)人參根部的植物學(xué)結(jié)構(gòu)，明顯呈現(xiàn)出5種獨(dú)特的分布模式（圖4），這可對(duì)特定組分的提取提供幫助。同時(shí)，以1117.5和1147.5兩處譜峰為依據(jù)，將形貌相似而年齡不同的3種人參區(qū)分開(kāi)來(lái)。Wang等[57]以3種人參屬的藥用植物人參、西洋參和三七為樣品，利用MALDI-MSI檢測(cè)到了51種皂苷，并給出了它們的分布位置，發(fā)現(xiàn)皂苷的分布模式和富集位置在不同參類(lèi)中有著巨大的差異。并通過(guò)對(duì)富集位置數(shù)據(jù)的主成分分析（PCA），篩選出了16種鑒別參類(lèi)的有效標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)了對(duì)3種不同人參屬藥物的快速鑒別。

長(zhǎng)春花因含有抗腫瘤活性的萜類(lèi)吲哚生物堿（TIA）而聞名。Yamamoto等[52]利用MALDI-MSI和活體單細(xì)胞質(zhì)譜研究了TIA在長(zhǎng)春花莖中的特異性分布。質(zhì)譜成像表明，大部分TIA位于異細(xì)胞和乳管中。他們還討論了TIA在異細(xì)胞以及乳管中合成與累積的意義，對(duì)藥用植物次生代謝產(chǎn)物其它方面的研究提供了參考。Heskes等[54]在利用MALDI-MSI尋找到穗花牡荊中二萜類(lèi)化合物主要分布于果實(shí)和葉子毛狀體的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)毛狀體特異性轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，鑒定出參與二萜化合物生物合成的7個(gè)候選基因。Kusari等[47]以金絲桃屬植物為研究對(duì)象，采用高分辨率MALDI-MSI技術(shù)對(duì)兩種金絲桃屬植物葉片的金絲桃素及其前體化合物的分布進(jìn)行了研究。通過(guò)與不含金金絲桃素的植物中相同前體物-大黃素分布的比較，證實(shí)了金絲桃素的生物合成理論。同時(shí)也對(duì)另一種前體物質(zhì)大黃素蒽酮的分布和合成進(jìn)行了分析。這項(xiàng)研究工作為進(jìn)一步研究金絲桃素生物合成途徑提供了理論依據(jù)，也為藥用植物代謝物的生物合成途徑研究提供了參考。

Beck等[50]利用MALDI-MSI技術(shù)得出了銀杏葉中黃酮苷的分布情況，用于研究生物/非生物脅迫和防御機(jī)理對(duì)分布的特異性進(jìn)行闡述。黃酮苷分布于葉片的各個(gè)部位，但維管束附近含量較高，因?yàn)橹挥性谌~片內(nèi)部均勻分布的情況下，葉片的紫外線防護(hù)功能才能發(fā)揮作用。同時(shí)，他們還發(fā)現(xiàn)雙黃酮類(lèi)化合物主要位于葉片的表面，而雙黃酮被認(rèn)為是一種真菌毒素，對(duì)昆蟲(chóng)也具有威懾力的物質(zhì)，根據(jù)這一結(jié)果，可以得出銀杏葉的葉片下面是真菌或昆蟲(chóng)入侵的一個(gè)主要位置的結(jié)論。

MALDI-MSI除用于藥用有效成分分析之外，還被用于蛋白組學(xué)以及藥物在生命體中的代謝機(jī)制研究。植物的內(nèi)源肽會(huì)影響細(xì)胞的分裂、發(fā)育、結(jié)瘤、繁殖、共生固氮體系以及防御反應(yīng)，因此需要揭示其在分子水平上的作用。Gemperline等[49]通過(guò)對(duì)蒺藜苜蓿種數(shù)百種內(nèi)源肽以及蛋白片段的成像，發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)階段的內(nèi)源肽總數(shù)和空間分布存在差異性，為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)源肽在藥用植物物生長(zhǎng)中的功能提供了參考。Yang等[58]利用MALDI-MSI對(duì)瑪卡中提取得到的咪唑類(lèi)生物堿在小鼠組織中的代謝機(jī)制及分布進(jìn)行了分析，這種無(wú)標(biāo)記的原位成像技術(shù)將有助于推進(jìn)藥理作用機(jī)制的研究。

4總結(jié)與展望

MALDI-MS具有如高通量、高靈敏度、易于樣品制備和快速分析等優(yōu)點(diǎn)，與成像技術(shù)結(jié)合可實(shí)現(xiàn)原位分析，為藥物活性成分的空間分布情況提供了理論依據(jù)，也為進(jìn)一步研究藥用植物中代謝物的生物合成途徑、儲(chǔ)存與運(yùn)輸過(guò)程奠定了基礎(chǔ)。但研究過(guò)程中仍然存在不足之處：MALDI離子源對(duì)一些低豐度化合物的離子化效率不高;由于不同部位的組織結(jié)構(gòu)不同，在制備植物樣品切片過(guò)程中需采用不同的切片技術(shù)，成像效果不易掌握;切片后基質(zhì)的調(diào)和、涂布、干燥等流程耗時(shí)較長(zhǎng)，基質(zhì)涂布的均勻性等對(duì)MALDI技術(shù)在藥用植物分析應(yīng)用中的推廣產(chǎn)生了一定的制約作用。隨著離子化效率和成像速率的提升，省時(shí)、省力、能大幅提高成像分辨率和重現(xiàn)性的樣品前處理方法的出現(xiàn)，該項(xiàng)技術(shù)在藥用植物的研究中將發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

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