蔣成勇，杜國榮，王麗達，張 杰，嚴莉紅，白若石，鄭曉曼，蘆 楠，周 駿

上海煙草集團有限責任公司技術中心北京工作站，北京市通州區(qū)萬盛南街99 號101121

煙用香精的質量監(jiān)控一直是香精企業(yè)和卷煙生產(chǎn)企業(yè)高度關注的問題，目前，主要依照系列行業(yè)標準測定煙用香精折光指數(shù)、相對密度和酸值等指標來監(jiān)控香精質量[1]。然而，煙用香精是一個復雜的多組分體系，各組分對香味的貢獻存在協(xié)同效應，即使含量極少的香氣組分也可能對卷煙的感官品質產(chǎn)生較大影響[2]。因此，對煙用香精中全組分香氣成分進行監(jiān)控，不僅可以清楚地了解香精的內在品質，還可以掌握各批次香精的質量波動情況，有助于穩(wěn)定卷煙產(chǎn)品質量。

通過化學組分監(jiān)控煙用香精質量，主要采用氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質譜聯(lián)用法（GCMS）、全二維氣相色譜-飛行時間質譜法（GC×GC-TOFMS）和液相色譜法（HPLC）等分析手段結合化學計量學方法[3-12]。GC-MS/MS 近年來發(fā)展迅速，已在農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染物、煙草化學等研究領域得到了廣泛應用[13-16]，由于該方法選擇性好且具有高通量和高靈敏度的優(yōu)點，因此在煙用香精復雜體系的分析方面具有較大的應用空間。

采用多元統(tǒng)計過程控制（Multivariate Statistical Process Control，MSPC）方法進行質量監(jiān)控，主要是利用正常狀態(tài)下的樣品測量信息建立多元統(tǒng)計模型，將大量的過程變量通過多元統(tǒng)計的方法投影到由少量隱變量定義的低維空間中，并通過計算各樣品的統(tǒng)計量（如Hotelling T2、平方預測誤差Q等）和以統(tǒng)計量建立控制圖，使過程監(jiān)控、質量檢測及相應研究得到簡化[17]。近年來，MSPC 技術在藥物制造、食品與飼料生產(chǎn)、卷煙制絲過程等領域得到了廣泛的應用[18]。

本研究中采用GC-MS/MS 分析方法結合基于主成分分析的MSPC 技術，建立煙用香精質量監(jiān)控評價方法，通過監(jiān)測香氣成分變化實現(xiàn)煙用香精的質量監(jiān)控，旨在為進一步研究卷煙產(chǎn)品加香工藝、產(chǎn)品質量監(jiān)控及卷煙調香提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

配方香精A（溶劑為乙醇和丙二醇）為卷煙表香香精產(chǎn)品，由北京卷煙廠提供。

無水乙醇、丙酮、環(huán)己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯（色譜純，美國Fisher 公司）；丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、（+）-檸檬烯、異丁酸異戊酯、異戊醇、正己酸乙酯、異戊酸丁酯、丁酸異戊酯、2-甲基丁酸-2-甲基丁酯、異戊酸異戊酯、丁酸戊酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、戊酸異戊酯、對甲苯甲醚、辛酸乙酯、乙酸、己酸異戊酯、過氧化乙酰丙酮、苯甲醛、丙酸、芳樟醇、乙酸芳樟酯、5-甲基糠醛、β-石竹烯、γ-戊內酯、乙酰丙酸乙酯、γ-丁內酯、薄荷醇、苯乙酮、苯甲酸乙酯、糠醇、丁二酸二乙酯、異戊酸、乙酸松油酯、α-松油醇、十二醛、乙酸橙花酯、乙酸芐酯、2-甲基戊酸、苯乙酸乙酯、甲基環(huán)戊烯醇酮、α-紫羅蘭酮、苯甲醇、乙基環(huán)戊烯醇酮、苯乙醇、β-紫羅蘭酮、麥芽酚、β-氧化石竹烯、乙基麥芽酚、對茴香醛、4-羥基-2,5-二甲基-3（2H）呋喃酮、反式-橙花叔醇、DL-蘋果酸二乙酯、十四酸乙酯、肉桂酸甲酯、肉桂酸乙酯、對甲氧基苯乙酮、對甲氧基苯基丙酮、丁香酚、棕櫚酸乙酯、茴香醇、異丁香酚、芐醚、十八酸乙酯、5-羥甲基糠醛、乙基香蘭素、香蘭素、苯甲酸芐酯、3-羥基-4-甲氧基苯甲醛等72 種香氣物質標準品（95%～99%，北京百靈威科技有限公司）；苯甲酸正丙酯（99%，日本TCI 公司）。

7890B-7000D 型GC-MS/MS、MassHunter QQQ定量分析軟件（Version B.07.01 SP1）（美國Agilent公司）；D-78224 型超聲波清洗儀（德國Elma 公司）；PI-214 型電子天平（感量0.000 1 g，美國Denver Instrument 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取5 g 苯甲酸正丙酯標準品，用無水乙醇定容于100 mL 容量瓶中，得質量濃度為50 mg/mL 的內標儲備液。移取0.1 mL 內標儲備液于100 mL 容量瓶中，用無水乙醇稀釋并定容，得質量濃度為50的內標標準工作液。分別稱取香氣標準物質各0.1 g（精確至0.1 mg），用丙酮溶解后定容于100 mL 容量瓶中，配制成質量濃度為1 mg/mL 的標準樣品混合液，并置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，使用前將其恢復至室溫?/p>

1.2.2 樣品前處理

準確稱取0.5 g（精確至0.1 mg）試樣于25 mL具塞三角瓶中，加入10 mL 丙酮和內標溶液，再加入5 g 無水硫酸鈉，輕搖至無水硫酸鈉不變化；超聲提取5 min，靜置5 min；將提取液用微孔濾膜過濾，進行GC-MS/MS 分析。分析條件為：

色譜柱：DB-WAX 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：250 ℃；進樣量：1 μL，不分流進樣；恒流模式，柱流量1 mL/min；升溫程序：初始溫度45 ℃，保持5 min，以4 ℃/min 的速率升溫至200 ℃，再以10 ℃/min 的速率升溫至240 ℃，保持5 min。電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；Q1 和Q3 溫度：150 ℃；碰撞氣：N2（99.999%），流速1.5 mL/min；淬滅氣：He，流速2.25 mL/min；掃描方式：Scan、SIM、多反應監(jiān)測（MRM）模式。

1.2.3 感官評價

以配方香精A 為表香的“中南海”卷煙產(chǎn)品作為對照樣，采用調整不同添加比例（±20%、±10%、±5%）的配方香精A 制作待測樣品卷煙；按照行業(yè)標準YC/T 138—1998《煙草及煙草制品 感官評價方法》，組織7 名具有資質的評吸人員組成評吸小組對樣品進行感官評價；采用三點檢驗法評估待測樣品與對照樣之間差異顯著性。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

在MassHunter QQQ 定量分析工作站打開采集的MRM 數(shù)據(jù)，利用編輯好的分析方法對目標物峰進行自動積分，得到各目標物的峰面積。用相對峰面積（各目標物的峰面積與內標峰面積的比值）對樣品進行半定量分析。采用基于PCA 的MSPC 方法對正常狀態(tài)下采集的煙用香精成分半定量結果進行分析并建立模型，計算統(tǒng)計 量Hotelling T2，以3σ 為 控 制 上 限，繪 制 控制圖。

2 結果與討論

2.1 全組分香氣成分定性分析

選擇不同極性溶劑（乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷和環(huán)己烷）和不同色譜柱（DB-5MS 和DBWAX）對香精樣品進行提取和分離，采用3 種方式進行全組分香氣成分定性分析。①保留時間確認：以GC-MS 全掃描方式分析待測樣品，首先通過NIST 譜庫匹配確定目標香氣成分，然后比較標準樣品與待測樣品中目標香氣成分保留時間的一致性。②標準加入法：將配制的標準樣品溶液加入到香精樣品中進行提取和分析，并與未加入標準樣品溶液的樣品進行對比分析，目標香氣成分的色譜峰顯著增高。③MRM 監(jiān)測：針對每種目標香氣成分，通過優(yōu)化碰撞電壓，挑選出兩對離子對分別用于定量和定性分析。從配方香精A 中共鑒定出72 種全組分香氣成分，其MRM 參數(shù)見表1。由于三重四級桿串聯(lián)質譜具有高通量離子傳輸性能和碰撞室零串擾技術特點，因此可有效解決重疊組分和基質干擾問題，進而提高定性和定量的準確性。

2.2 提取分析方法優(yōu)化

表1 72 種香氣成分定性分析參數(shù)及方法學評價Tab.1 Qualitative parameters of 72 aroma components and methodology evaluation

表1（續(xù)）

表1（續(xù)）

2.2.1 分離色譜柱的選擇

由于配方香精A 中香氣成分種類較多，結構復雜，且極性差異較大，部分化合物如乙酸、丙酸、異戊酸等極性香氣成分相對含量較高，但其在非極性色譜柱（DB-5MS）上的保留能力較小且易造成較高的柱流失。因此，為了最大限度獲取全組分香氣成分，選擇DB-WAX 柱進行香氣成分分離。

2.2.2 提取溶劑的選擇

分別稱取5 份同一批次香精樣品各0.5 g 于5個25 mL 具塞三角瓶中，分別以乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷和環(huán)己烷為溶劑，考察提取溶劑對香氣成分提取效率的影響，結果如圖1 所示。結果表明，以丙酮為溶劑提取出的香氣成分數(shù)量最多且總量最高。香精中香氣成分種類多、性質差異大，而丙酮是偏極性溶劑，可以更好地提取多種成分，因此選擇丙酮作為提取溶劑。

圖1 溶劑對提取效率的影響Fig.1 Influence of solvent on extraction efficiency

2.2.3 提取時間的優(yōu)化

分別稱取6 份同一批次香精樣品各0.5 g 于25 mL具塞三角瓶中，加入5 g無水硫酸鈉、10 mL 丙酮和20內標溶液，考察超聲提取時間（5、10、15、20、30 和40 min）對香氣成分提取效率的影響。結果（圖2）表明，超聲時間對香氣成分的提取結果影響較小，相對標準偏差（RSD）為0.52%。綜合考慮，選取超聲提取時間為5 min。

圖2 時間對提取效率的影響Fig.2 Influence of time on extraction efficiency

2.2.4 料液比的選擇

分別稱取5 份同一批次香精樣品各1.0 g 于50 mL 具塞三角瓶中，分別加入5 g 無水硫酸鈉、不同體積（5、10、15、20 和30 mL）丙酮和相應量的內標溶液，超聲提取5 min 后進樣分析，考察料液比（g∶mL）對香氣成分提取效率的影響，結果如圖3所示。結果表明，香氣成分的提取量隨料液比的減小而增大，當料液比＜1∶20 時，香氣成分的提取量趨于穩(wěn)定。因此確定料液比為1∶20。

圖3 溶劑體積對提取效率的影響Fig.3 Influence of solvent volume on extraction efficiency

2.3 方法的檢出限、回收率和重復性

取1.2.1 中配制的香氣成分標準溶液1 mL，用丙酮定容于100 mL容量瓶，配制成濃度為10的標準溶液進行GC-MS/MS 分析，以3 倍信噪比為檢出限。結果（表1）表明，大多數(shù)香氣成分的檢出限均小于1.0 ng/mL。

采用標準加入法在高、中、低3 個濃度下考察香氣成分的回收率。結果（表1）表明，香氣成分的加標回收率為80%～120%。

以日內測定結果的重復性和日間測定結果的重復性來評價方法的重復性。對同一批次樣品在1 d內進行15 次平行處理和檢測，計算RSD；對同一批次樣品每天平行測定5 次，連續(xù)測定3 d，計算RSD。結果（表1）表明，大多數(shù)香氣成分的日內重復性（RSD）＜3%，日間重復性＜5%，說明本方法重復性較好。

2.4 香精質量監(jiān)控模型的建立及應用

2.4.1 模型的建立

選擇12 個批次配方香精A進行GC-MS/MS 分析，每個批次樣品抽樣測定5 次，獲取60 個樣品的72 種香氣成分的半定量分析結果。由于香氣成分含量差別較大，而其對感官質量的貢獻也有差異。為了將香氣成分波動對感官質量的影響引入到質量監(jiān)控模型，采用調整加香比例（±20%、±10%、±5%）的方式制作樣品卷煙進行感官評吸。結果表明，增加5%的香精用量，感官質量無明顯差異，其余加香比例則出現(xiàn)不同程度的感官質量差異。因此，將增加5%加香比例的配方香精香氣成分分析結果作為建模樣本數(shù)據(jù)，并建立煙用香精質控模型。

基于PCA 方法建立MSPC 模型時，一般要求主成分的累積貢獻率大于85%。本研究中采用累積方差貢獻率對不同主成分數(shù)進行了分析。結果（圖4）表明，主成分數(shù)為5 時累積貢獻率可達到90%，因此采用5 個主成分計算Hotelling T2。

圖4 主成分數(shù)對累計貢獻率的影響Fig.4 Influence of number of principal components on cumulative contribution rate

配方香精A 的質量監(jiān)控模型見圖5。其中，1～60 號為12 個批次合格樣品，61～65 號為加香比例增加5%時感官評吸合格樣品。以3σ 為控制上限繪制控制圖，由圖5 可見，建模樣品質量雖略有波動，但總體穩(wěn)定，T2值均在3σ 控制上限以內。2 個批次待測香精樣品（66～75 號）的質量判定結果表明，Hotelling T2值都處于3σ 質量控制限以內，說明香精質量穩(wěn)定。

圖5 模型控制圖及待測樣品預測Fig.5 Model control chart and predictio n of test samples

2.4.2 模型的應用

針對實際生產(chǎn)過程中可能出現(xiàn)的加香精度差異造成的香氣成分含量變化，可以通過該模型進行預測。圖6 所示76～80、81～90 號分別為調整加香比例-5%和±10%時感官質量存在顯著差異的香精樣品，Hotelling T2計算結果均超出控制上限，說明配方香精香氣成分相對含量發(fā)生改變，該情況完全可以通過該模型進行直觀呈現(xiàn)，并且預測結果與感官質量評價結果一致。

圖6 異常樣品預測Fig.6 Prediction of abnormal samples

為了進一步反映配方香精批次間的差異情況，基于該模型對香精樣品的主成分狀態(tài)進行了分析。圖7A 顯示，14 個批次合格香精都在置信橢圓內，而異常樣品（76～90 號）則偏離較大。批次1和批次2 相較于其他批次略有差異（圖7B）。圖8中紅色和黑色實線分別表示1、2 批次和其余批次香精香氣成分含量變化趨勢，從A、B、C 區(qū)域可以看出，2-甲基丁酸-2-甲基丁酯（11 號）、乙酰丙酸乙酯（29 號）、異丁香酚（65 號）等香氣成分出現(xiàn)明顯的異常波動，原因可能是1、2 批次樣品存放時間超過2 年，其內在香氣成分可能發(fā)生一定的化學變化，從而影響香精的整體質量，該結果可為過期香精的復檢工作提供技術保障。因此，通過監(jiān)控香氣成分變化可以更加客觀地反映香精的內在質量，且監(jiān)測的靈敏度和準確性較高。

圖7 煙用香精主成分分析結果Fig.7 Principal component analysis of tobacco flavor

圖8 目標香氣成分含量變化趨勢Fig.8 Variation trend of contents of target aroma components

3 結論

建立了同時測定煙用香精全組分香氣成分的GC-MS/MS 分析方法，該方法操作簡便、靈敏度高，準確性好，香氣成分的檢出限一般都小于1.0 ng/mL，日內和日間重復性（RSD）都在3%和5%以內，加標回收率達到80%～120%。GC-MS/MS 分析方法結合基于主成分分析的MSPC 技術，建立的質量監(jiān)控模型能夠快速、準確地從客觀上反映煙用香精的內在質量波動情況，可以作為煙用香精質量監(jiān)控的有效手段。