李寶鈞，劉少貞，任有蛇，喬利英，劉建華，王偉偉，劉文忠

（山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷 030801）

“鋅指”是一種小的蛋白結(jié)構(gòu)基元，可以結(jié)合1 個或幾個鋅離子保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。鋅指蛋白包括眾多不同結(jié)構(gòu)的蛋白家族，如CCHH 型、C4 型、C6 型和CCCH型等[1]，鋅指蛋白的典型功能是與DNA、RNA、蛋白以及其他分子結(jié)合。CCCH 型鋅指蛋白（Cys-Cys-Cys-His，Cys 為半胱氨酸，His 為組氨酸）包括1～6 個CCCH 型鋅指基元。CCCH 型鋅指基元氨基酸序列最初被定義為C-X6-14-C-X4-5-C-X3-H，X 表示其他氨基酸，目前被定義為C-X4-15-C-X4-6-C-X3-H[2]，其中最常見的形式是C-X7-C-X5-C-X3-H 和C-X8-C-X5-C-X3-H。與其他類型鋅指蛋白相比，CCCH 鋅指蛋白的研究較少。

家畜中胴體脂肪含量決定肉類產(chǎn)品的嫩度、汁液含量和風味。調(diào)控體內(nèi)脂肪沉積，生產(chǎn)脂肪含量適中的羊肉是肉羊育種的主要目標之一。成體動物的脂肪沉積主要為脂肪細胞的增加或脂肪體積的增加，而成體動物脂肪細胞的增加則由脂肪組織中前體脂肪細胞的增殖和分化來實現(xiàn)。因此，探明前體脂肪細胞分化的分子機制對于調(diào)控綿羊的脂肪沉積非常重要。前體脂肪細胞的分化由眾多轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)蛋白所調(diào)控。本課題組前期已經(jīng)對部分綿羊脂肪沉積相關(guān)蛋白基因進行了組織表達研究[3-5]。最新研究表明，ZC3H10 促進肌肉細胞的分化，而ZC3H10 的純合突變子表現(xiàn)為脂肪含量升高和體內(nèi)脂肪分布改變[6]。因此，ZC3H10 可能在脂肪細胞分化或脂肪代謝過程中發(fā)揮作用。本實驗旨在研究綿羊ZC3H10 在不同脂肪組織部位和其他主要器官組織的mRNA 表達，以及在體外綿羊脂肪細胞分化模型中研究ZC3H10 隨細胞分化的mRNA 表達規(guī)律，為研究ZC3H10 在綿羊脂肪沉積中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗中屠宰程序和飼養(yǎng)管理按照中華人民共和國飼料衛(wèi)生標準（GB 13078-2017）、畜類屠宰加工通用技術(shù)條件（GB/T 17237-2008）和無公害食品肉羊飼養(yǎng)獸藥使用準則（NY 5148-2002）進行。選取4 只10 月齡小尾寒羊去勢公羊（飼養(yǎng)條件相同）進行屠宰，并分別采集皮下脂肪組織以及心臟、腎、肝、肺、脾、小腸和肌肉（背最長?。┑冉M織樣品，快速用鋁箔紙包裹，置于液氮中，隨后帶回實驗室保存于-80℃，用于實時熒光定量PCR。

考慮到方便取材，采用1 周齡晉中綿羊作為細胞培養(yǎng)的實驗動物。綿羊前體脂肪細胞的分離、培養(yǎng)與分化參照趙艷艷等[7]的方法。如圖1-A 所示，分離培養(yǎng)的前體脂肪細胞呈現(xiàn)紡錘形、星形、三角形等形態(tài)。如圖1-B 所示，分化10 d 的脂肪細胞，其間有白色透亮的脂滴聚集。在綿羊前體脂肪細胞分化的0、2、4、6、8、10 d 分別收集細胞，每個時間點3 個重復，用于實時熒光定量PCR。

圖1 培養(yǎng)的綿羊前體脂肪細胞（A）和分化10 d 的脂肪細胞(B)

1.2 生物信息學在線平臺 使用SMART 工具（http://smart.embl-heidelberg.de）對綿羊ZC3H10 基因翻譯的氨基酸序列進行結(jié)構(gòu)域分析。使用Nucleotide BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析綿羊ZC3H10 基因與其他物種的序列同源性；進化樹構(gòu)建平臺為Phylogeny.fr（http://www.phylogeny.fr/）。進行同源性分析和進化樹的各物種序列信息：綿羊（XM_027967606.1）、爪蟾（NM_001008144.2）、斑馬魚（NM_207098.1）、家鼠（XM_006513013.2）、雞（XM_015300307.2）、牛（NM_001097993.1）、 豬（XM_003126269.6） 和人（NM_001303124.1）?；虮磉_熱圖在Omicshare平臺完成（http://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/heatmap）。以上分析均采用默認參數(shù)完成。

1.3 總RNA 提取 綿羊各組織和培養(yǎng)細胞的總RNA 按照Trizol（TaKaRa 公司，美國）試劑盒說明書進行提取。RNA 濃度用NanoDrop 公司的核酸濃度測定儀檢測，樣品的OD260/280值在1.8～2.0。RNA 完整性通過1.2%凝膠電泳檢測，28S 條帶亮度約為18S 條帶亮度的2 倍。提取的總RNA 保存于-80℃。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于Li 等[8]文獻。用于轉(zhuǎn)錄組測序的腎周、皮下、尾部脂肪組織來自4 只10 月齡小尾寒羊去勢公羊，同1.1。

1.5 反轉(zhuǎn)錄與實時熒光定量PCR 根據(jù)TaKaRa 公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說明書合成cDNA 第一鏈。熒光定量PCR 儀為Applied Biosystems 公司的7500 Fast Real-Time PCR System，熒光定量PCR 試劑盒為TaKaRa 公司的SYBR Premix Ex Taq Ⅱ kit。反應體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10.0 μL，PCR 正反向引物各0.8 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA 模板2.0 μL，去RNA 酶超純水6.0 μL。反應程序：預變性95℃ 30 s； 95℃ 5 s 和60℃ 34 s，45 個循環(huán)；熔解曲線階段為95℃ 15 s，60℃ 1 min，再以每10 s 0.5℃的速率從60℃上升到95℃。每個樣品進行3 次技術(shù)重復。RPL13A 由于表達穩(wěn)定而作為內(nèi)參基因。特異性引物通過在線工具Primer-BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）設計而成，引物序列見表1?；虻膍RNA 相對表達量由2-ΔΔCT方法計算得出。

1.6 統(tǒng)計分析 運用SPSS 19.0 軟件中單因素方差分析檢驗ZC3H10 基因在綿羊各種不同組織間或綿羊前體脂肪細胞分化的各時間點的表達差異性，各組織或各時間點基因表達量間的差異采用Duncan′s 法進行多重比較。P＜0.05 表示差異顯著。結(jié)果以平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊ZC3H10 基因序列的生物信息學分析 ZC3H10基因（NCBI ID：114108653）位于綿羊3 號染色體，含有3 個外顯子。綿羊ZC3H10 基因序列與各物種同源序列間具有較高的保守性，其mRNA 序列與爪蟾、斑馬魚、雞、小鼠、豬、牛和人的一致性（Identities）分別為67.32%、71.62%、73.27%、82.85%、88.73%、97.23%和90.86%，其中與牛的序列一致性最高。ZC3H10 基因編碼的蛋白質(zhì)基元序列非常保守，稱為“CCCH 鋅指”；綿羊ZC3H10 基因翻譯的氨基酸序列在128～154、167～190 和226～252 位 置 有3 個CCCH 鋅 指。ZC3H10基因進化樹顯示（圖2），斑馬魚和非洲爪蟾與其他物種親緣關(guān)系遠，各列為一支；雞與其他家畜及家鼠形成分支；家鼠與其他家畜形成分支，豬和人列為一支，牛和羊列為一支。

表1 實時熒光定量PCR 所用引物

圖2 ZC3H10 基因進化樹

2.2 ZC3H10 基因在綿羊不同部位脂肪組織的mRNA 表達 根據(jù)Li 等[8]的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，按照mRNA 表達水平高低將所有檢測到的基因進行排序，ZC3H10 基因在綿羊腎周脂肪、皮下脂肪和尾部脂肪轉(zhuǎn)錄組所有基因中的排名分別為第20、16、18。這說明ZC3H10 基因在這3 種脂肪組織中均有很高的mRNA 表達水平。將3 個脂肪組織轉(zhuǎn)錄組中表達量最高的前20 個基因進行交集，獲得12 個基因，包括TMSB4、FABP4、ADIPOQ、VIM、ZC3H10 基因和7 個核糖體蛋白基因，即RPLP1、RPS12 、RPS8、RPS11、RPL27a、RPL31 和RPS24。根據(jù)這12 個基因在3 種脂肪組織中的mRNA表達豐度，將其進行聚類分析。如圖3 所示，所有基因被分為4 組，F(xiàn)ABP4、ADIPOQ 和ZC3H10 聚為一組，其他7 個核糖體蛋白基因聚為一組，TMSB4（Thymosin β4，胸腺素β4）和VIM（Vimentin，波形蛋白）各為一組。

2.3 ZC3H10 基因在綿羊各器官組織的mRNA 表達 圖4 表明， ZC3H10 在綿羊皮下脂肪、心臟、腎、肝、肺、脾、小腸和肌肉等器官組織中均有表達。ZC3H10 在肌肉組織中的mRNA 表達最高，顯著高于其他組織。ZC3H10在腎中的表達僅次于肌肉，與心、肝、脾和小腸中的表達差異不顯著，但顯著高于脂肪和肺。ZC3H10 在脂肪中的mRNA 表達顯著高于肺，顯著低于肌肉和腎，與心臟、肝、脾、小腸間的表達差異不顯著。ZC3H10 在肺中的mRNA 表達最低，且顯著低于其他各組織。

圖3 12 個高表達基因在脂肪組織中的mRNA 表達熱圖

圖4 綿羊ZC3H10 mRNA 的組織表達

2.4 ZC3H10 基因在綿羊體外前體脂肪細胞分化過程中的mRNA 表達 由圖5 可知，隨著前體脂肪細胞分化的進行，綿羊ZC3H10 基因mRNA 的表達呈下調(diào)趨勢。ZC3H10 在前體脂肪細胞（分化0 d）中的mRNA 水平顯著高于分化過程中的任何時期。ZC3H10 在前體脂肪細胞分化2 d 的mRNA 表達顯著高于4、6、8、10 d；而前體脂肪細胞分化4、6、8 d 的mRNA 表達差異不顯著。細胞分化10 d 的ZC3H10 mRNA 表達在所有檢測的時間點中表達最低，且顯著低于其他時期。

圖5 ZC3H10 基因在綿羊前體脂肪細胞分化過程中的mRNA 表達

3 討 論

3.1 ZC3H10 基因的表達與功能 本研究表明， 綿羊ZC3H10 在不同器官組織中均有表達，且在肌肉中表達最高，在肺中表達最低。人ZC3H10 基因在脂肪、心臟、腎、肝、肺、脾、小腸等28 種組織中均有表達[9]。小鼠ZC3H10 基因在胚胎的神經(jīng)、腦、肢等器官組織以及成體的心、腎、肺和脂肪等組織中表達[10]。這些研究顯示ZC3H10 基因的mRNA 廣泛表達于各種組織，但其表達有種屬差異性，在同一物種中也存在組織差異性。

鋅指結(jié)構(gòu)具有與核酸作用的能力。在Hela 細胞中的研究表明，ZC3H10 可做為RNA 結(jié)合蛋白與mRNA結(jié)合[11]。 Treiber 等[12]研究表明，ZC3H10 可結(jié)合到多種細胞系的microRNA。ZC3H10 在哺乳動物癌細胞系MCF-7 中可作為腫瘤抑制因子[13]。Audano 等[6]研究顯示，ZC3H10 在C2C12 肌肉細胞分化過程中表達上調(diào)，ZC3H10 過表達促進了肌母細胞的分化，敲除ZC3H10 則導致肌母細胞分化的抑制。人ZC3H10 突變的純合子呈現(xiàn)身體質(zhì)量指數(shù)和脂肪含量的升高和脂肪分布改變[6]。這些結(jié)果提示ZC3H10 在脂肪代謝中可能發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，ZC3H10 在綿羊不同部位的脂肪組織中均有很高的mRNA 表達，且與脂肪沉積相關(guān)基因脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty Acid Binding Protein 4，F(xiàn)ABP4）和脂聯(lián)素（Adiponectin，ADIPOQ）有相似的表達模式。這說明ZC3H10 基因可能與這2 個基因有相似的功能。FABP4 在脂肪酸轉(zhuǎn)運和動物脂肪沉積中發(fā)揮作用。FABP4 多態(tài)性與牛的脂肪沉積顯著相關(guān)[14]。ADIPOQ 是脂肪細胞分泌的主要脂肪細胞因子，調(diào)控葡萄糖的代謝與脂肪酸氧化[15]。ADIPOQ 的多態(tài)性與牛肉的大理石花紋顯著相關(guān)[16]。因此，ZC3H10 可能在脂肪代謝中發(fā)揮作用。發(fā)育生物學研究顯示，脂肪細胞和肌肉細胞的發(fā)育來源相同，均來自于發(fā)育早期中胚層細胞，一些促進肌肉細胞分化的基因往往抑制脂肪細胞的分化，如SIRT1[17]、Wnt10b[18]等。本研究表明，ZC3H10 的表達隨著綿羊前體脂肪細胞的分化而下調(diào)，所以綿羊ZC3H10 可能抑制脂肪細胞的分化。

3.2 鋅指蛋白在脂肪細胞分化中的作用 PPARγ 和C/EBP是脂肪細胞分化和基因表達的主控因子[19]。目前研究發(fā)現(xiàn)不少鋅指蛋白通過作用PPARγ 或C/EBP 促進或者抑制脂肪細胞的分化。在脂肪細胞分化中起正調(diào)控作用 的CCHH 型 鋅 指 蛋 白KLFs（Krupel-like factors）有KLF4、KLF5、KLF6 和KLF15；起負調(diào)控作用的CCHH 型鋅指蛋白有KLF2、KLF3 和KLF7[20]。CCHH型鋅指蛋白638（Zinc Finger Protein 638，Zfp638）和SNAIL2 均促進脂肪細胞的分化。而C2C2 型鋅指蛋白GATA2 和GATA3 是脂肪細胞分化的負調(diào)控因子[21]。本研究中的ZC3H10 有望成為影響脂肪細胞分化的新的鋅指蛋白成員。

4 結(jié) 論

本實驗結(jié)果顯示，CCCH 型鋅指蛋白基因ZC3H10在綿羊主要器官組織均有mRNA 表達，在不同脂肪部位有較高的mRNA 表達。在體外綿羊前體脂肪細胞分化過程中，ZC3H10 mRNA 的表達呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。需要進一步開展功能喪失或功能獲得等實驗研究，繼續(xù)探明ZC3H10 基因在脂肪細胞分化和代謝中的功能以及作用機制。