劉紀(jì)愛 束愛萍 劉光榮 李祖章 劉增兵 高崢

（1. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與資源環(huán)境研究所 國家紅壤改良工程技術(shù)研究中心，南昌 330200；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 作物國家重點(diǎn)實驗室，泰安 271000）

施肥是提高土壤肥力和作物產(chǎn)量的有效途徑。通過大量施加肥料以達(dá)到糧食高產(chǎn)的效果是目前我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)常用手段，但不斷增加的化肥施用量和過高的化肥施用強(qiáng)度給環(huán)境帶來了巨大的壓力，導(dǎo)致嚴(yán)重的土壤退化和環(huán)境污染［1]。自20世紀(jì)80年代以來中國一直在大力推薦有機(jī)肥的應(yīng)用，有機(jī)肥可通過改變土壤物理性狀、養(yǎng)分、酶活性及微生物組群落結(jié)構(gòu)，來降低或消除因長期單施或過施無機(jī)肥對土壤理化性狀和微生物生態(tài)產(chǎn)生的負(fù)面影響，被認(rèn)為是增加土壤有機(jī)質(zhì)和提高土壤肥力的有效途徑［2-3]。目前的研究表明，無機(jī)和有機(jī)肥料的組合比單獨(dú)的無機(jī)或有機(jī)肥料更促進(jìn)可持續(xù)的作物生產(chǎn)、提高谷物產(chǎn)量［4-5]。尤其在測土配方施肥行動及到2020年化肥使用量零增長行動的大背景下，有機(jī)無機(jī)配施將是我國今后肥料施用發(fā)展的必然趨勢。

微生物組在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著舉足輕重的作用，影響著大量至關(guān)重要的生態(tài)系統(tǒng)過程，包括土壤能量流動和元素循環(huán)、土壤有機(jī)質(zhì)的礦化分解及一些作物生長必需營養(yǎng)的供給，其生物量、多樣性和活動是陸地生態(tài)系統(tǒng)土壤質(zhì)量、生產(chǎn)力和可持續(xù)性的敏感指標(biāo)［6-8]。微生物組包括微生物（細(xì)菌、古細(xì)菌、低等或高等真核生物和病毒）及其基因組（基因），以及其周圍環(huán)境在內(nèi)的全部，包括環(huán)境中的所有生物和微生物因素［9]。土地利用類型、季節(jié)、植被、長期或短期施肥處理均會對細(xì)菌、真菌、古菌等不同種類微生物的豐度、多樣性及群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同影響，通常來講，施用有機(jī)肥處理土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性指數(shù)高于施用無機(jī)肥處理，并且不同施肥處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也存在差異［8，10-11]。土壤微生物組對不同施肥處理的響應(yīng)和變化可以通過傳統(tǒng)的微生物檢測手段及現(xiàn)代的擴(kuò)增子高通量測序和宏組學(xué)技術(shù)進(jìn)行揭示。

1 土壤微生物組的研究方法

而快捷檢測土壤中微生物群落生物量和結(jié)構(gòu)的方法，但磷脂脂肪酸不能表征特定的微生物群落，無法給予系統(tǒng)發(fā)育信息［13]?？寺∥膸斓臉?gòu)建可以獲取不同微生物的系統(tǒng)發(fā)育信息，但因其操作流程繁冗、工作量大、測序深度及覆蓋度較低，逐步被取代。

擴(kuò)增子高通量測序和宏組學(xué)技術(shù)憑借其數(shù)據(jù)量大、避開培養(yǎng)過程、囊括信息全面等優(yōu)點(diǎn)為土壤微生物組的研究揭開了新篇章。16S rRNA基因的高通量測序和系統(tǒng)發(fā)育分析為微生物群落的現(xiàn)代研究奠定了基礎(chǔ)［14]。包括宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白組學(xué)、宏代謝組學(xué)在內(nèi)的宏組學(xué)技術(shù)分別在DNA、RNA、蛋白質(zhì)、代謝水平上來反映土壤微生物組成及群落結(jié)構(gòu)，不同水平上的測序手段存在其各自的利弊，詳細(xì)信息見表1。珂博和張彤團(tuán)隊在近期聯(lián)合多維宏組學(xué)（宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組及目標(biāo)性代謝組學(xué)）解析了混合微生物群落內(nèi)細(xì)菌間協(xié)同代謝關(guān)系［15]。除此之外，高通量基因芯片GeoChip也用于分析微生物群落的功能多樣性、組成、結(jié)構(gòu)、代謝潛力/活性和動態(tài)［16]。

土壤微生物組的揭示依賴于有效而恰當(dāng)?shù)奈⑸餀z測手段和研究方法。傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法包括微生物純培養(yǎng)技術(shù)、磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acids，PLFA），以及基于核酸分子的克隆文庫等方法。土壤中大約有107種細(xì)菌物種，通過純培養(yǎng)的手段僅能夠檢測到其中的1%-10%，難以全面揭示微生物的組成［12]。磷脂脂肪酸分析是一種靈敏

2 施肥對土壤性狀的影響

2.1 施肥對土壤物理性狀的影響

表1 土壤微生物組研究方法的特征對比

土壤質(zhì)量是土壤物理、化學(xué)和生物學(xué)性狀的綜合表現(xiàn)，良好的土壤條件可以為作物生長提供良好的生態(tài)環(huán)境。無機(jī)肥的施加對土壤團(tuán)聚性、土壤容重并不會產(chǎn)生負(fù)面影響［20-21]。適當(dāng)施加有機(jī)肥可以降低土壤容重、提高土壤的孔隙度、提高土壤大團(tuán)聚體含量，促進(jìn)良好土壤物理結(jié)構(gòu)的形成，改善土壤質(zhì)量，有利于農(nóng)作物生長［22-23]。Sihi等［24]發(fā)現(xiàn)，長期施加有機(jī)肥的印度北部水稻土壤容重指標(biāo)較常規(guī)NPK施肥處理土壤容重低。Williams等［25]的研究中，有機(jī)耕作土壤的土壤團(tuán)聚體平均重量直徑和孔隙度增加，具有更強(qiáng)的吸水能力和更低的密實度。Chaudhary和Suja等［20，26]也報道了類似的結(jié)果。

2.2 施肥對土壤養(yǎng)分的影響

施肥是維持土壤肥力的重要管理措施，其最直接的作用是改變土壤的理化指標(biāo)和養(yǎng)分含量。短期施加無機(jī)肥可以顯著影響退化羊草草原土壤速效氮、速效鉀等速效養(yǎng)分的含量，但對土壤全氮、有機(jī)質(zhì)等指標(biāo)沒有明顯的改變［27]。Bei等［28]在對華北平原石灰性土壤的研究中指出，有機(jī)肥替代的短期施加不僅會顯著影響土壤速效氮、速效鉀含量，也會顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)和全氮含量。長期NPK的施加會顯著提高土壤含水量、可獲得性磷、陽離子交換量等指標(biāo)，而長期有機(jī)肥處理對土壤有機(jī)碳、總氮、可獲得性磷、可獲得性鉀含量等指標(biāo)的影響更顯著［29-31]。需要特別注意的是，越來越多的研究證明，長期施加無機(jī)肥會導(dǎo)致土壤pH降低，引起土壤酸化，有機(jī)肥替代可以提高深層土壤的肥效和耐酸性，減緩因單獨(dú)施加無機(jī)肥產(chǎn)生的土壤酸化趨勢［32-35]。

2.3 施肥對土壤酶活性的影響

土壤酶活性也是土壤質(zhì)量的指標(biāo)之一，是土壤系統(tǒng)生化功能的關(guān)鍵組成部分［36]。土壤酶活性能夠直接敏感地響應(yīng)施肥處理和土壤環(huán)境的變化，與施加無機(jī)肥相比，有機(jī)肥的添加可以提高土壤脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶、酸和堿性磷酸酶活性等土壤酶活性［37-39]。沈冰濤等［40]研究有機(jī)肥替代無機(jī)肥對小麥產(chǎn)量及土壤養(yǎng)分和酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)比例有機(jī)肥替代無機(jī)肥處理既能保證作物產(chǎn)量，又能一定程度的提高土壤肥力和酶活性（過氧化氫酶、蔗糖酶和磷酸酶活性）。Wu等［41]指出施用有機(jī)肥和有機(jī)-無機(jī)肥可顯著提高丘陵果園地區(qū)土壤過氧化氫酶、蔗糖酶、脲酶和酸性磷酸酶的活性。

3 施肥對土壤微生物組的影響

3.1 施肥對土壤微生物豐度和多樣性的影響

除了土壤理化和酶活性指標(biāo)，土壤微生物也可以對土壤環(huán)境的改變做出快速響應(yīng)。土壤細(xì)菌對于維持土壤肥力和土壤生態(tài)系統(tǒng)功能至關(guān)重要，并且通常對肥料投入敏感［42]。Hu等［43]使用基于16S rRNA基因的定量PCR（qPCR）方法估算長期不同施肥處理的細(xì)菌豐度，結(jié)果顯示NPK處理和未施肥對照之間沒有顯著差異，有機(jī)肥的替代或單純有機(jī)肥的施加均使細(xì)菌豐度比對照顯著提高。Sun等［32]的研究中也得到了類似的結(jié)果，并且他們指出NPK加牲畜糞便的細(xì)菌豐度比NPK加小麥秸稈高得多。關(guān)于細(xì)菌多樣性對施肥處理的響應(yīng)，許多研究都得到了一致的結(jié)論：長期NPK施肥會導(dǎo)致土壤細(xì)菌豐富度和多樣性降低，有機(jī)肥替代或者單獨(dú)有機(jī)肥處理的細(xì)菌豐富度和多樣性升高，甚至顯著高于NPK處理及不施肥對照［43-46]。值得一提的是，無機(jī)肥導(dǎo)致細(xì)菌豐度和多樣性降低的趨勢在短期施肥中就可以被發(fā)現(xiàn)［47]。

土壤中的細(xì)菌和真菌通常占土壤微生物總量的90%以上，它們是土壤有機(jī)質(zhì)分解和養(yǎng)分動態(tài)的主要調(diào)節(jié)劑［48]。Bei等和 Guo 等［28，47]的研究均顯示，短期無機(jī)肥和有機(jī)肥處理之間，真菌ITS基因拷貝沒有顯著差異。長期NPK處理也會導(dǎo)致土壤真菌多樣性指標(biāo)均顯著下降，有機(jī)肥的添加使真菌豐富度和多樣性提高［49-51]。Wang等［52]的研究中也提出不同的施肥方式改變了真菌類群的豐度，并按其營養(yǎng)策略分組，與礦物肥料處理相比，土壤有機(jī)輸入增加了土壤真菌α-多樣性。

一些古菌，特別是氨氧化古菌（Ammoniaoxidizing archaea，AOA）也會對不同施肥方式作出響應(yīng)，但其對施肥處理敏感性低于氨氧化細(xì)菌（Ammonia-oxidizing bacteria，AOB），即使AOA的數(shù)量比AOB高數(shù)百倍［53-54]。不同無機(jī)肥、有機(jī)肥短期處理下，AOA的豐度和多樣性無顯著差異［55-56]。長期無機(jī)肥或有機(jī)肥處理對AOA的豐度的影響較小，并且無機(jī)肥和有機(jī)肥的聯(lián)用并不會引起AOA豐富度和α多樣性顯著變化［57-58]。原生生物是施用氮肥最易感的微生物組分，氮肥通過改變不同的非生物特性和細(xì)菌和真菌群落間接地減少了原生生物的多樣性［59]。有機(jī)肥處理會使土壤形成根本不同的原生生物群落結(jié)構(gòu)，并且增強(qiáng)最豐富的原生生物分類群的相對豐度，進(jìn)而使得整體多樣性降低［60-61]。

3.2 施肥對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

不同施肥措施和施肥周期對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響程度存在一定差異，這種影響差異除了土壤因素外，還受到植物類型的影響［62-63]。不同無機(jī)和有機(jī)長期處理的土壤中的細(xì)菌群落組成彼此分開，表現(xiàn)出微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著差異，而短期施肥處理則對微生物群落產(chǎn)生輕微的影響［28-29，46]。目前無機(jī)和有機(jī)肥料的研究中，各類土壤樣本中主要的細(xì)菌門包括：Proteobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria等，并且它們相對豐度的總和占細(xì)菌群落的 70%以上［2，8，45]。Ramirez等［42]在N富集對北美生態(tài)系統(tǒng)微生物活動和群落組成變化的研究中發(fā)現(xiàn)，N添加使Actinobacteria和Firmicutes的相對豐度分別增加，同時減少了Acidobacteria、Verrucomicrobia、Cyanobacteria、Planctomycetes和Deltaproteobacteria等5個門的豐度。Cui等［45]的研究表明NPK肥料的長期施用顯著增加了紅壤性水稻土壤的Nitrospirae的豐度，而糞肥增加了Proteobacteria、Chloroflexi和Firmicutes的豐度，但在糞肥和化學(xué)NPK聯(lián)合施用的處理中檢測到最豐富的Actinobacteria和Planctomycetes。此外，有機(jī)肥的施加可以顯著富集細(xì)菌微生物組成中的Firmicutes。Kumar等［46]在水稻土中連續(xù)施用無機(jī)和有機(jī)肥料47年，發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥和無機(jī)肥配施處理的Firmicutes的OTU比例明顯高于無機(jī)肥處理。Tu等［64]在7年、9年和10年的人工林中均發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥增加了Firmicutes的比例，而對照和無機(jī)肥料處理中沒有此效果，并且他們也提出芽孢桿菌是最豐富的Firmicutes類，可能代表對有機(jī)肥施肥反應(yīng)最明顯的細(xì)菌類型，可作為提高土壤肥力和實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展的高效細(xì)菌。

同細(xì)菌群落一樣，土壤真菌群落組成在無機(jī)和有機(jī)施肥方式之間可以明顯分開，但其對土壤養(yǎng)分狀況變化的敏感度低于細(xì)菌［8，65]。多數(shù)研究中，Ascomycota門在真菌群落中占主導(dǎo)地位，占總序列的60%以上［2，8，65]。與不施肥處理相比，有機(jī)肥的應(yīng)用能夠顯著增加增加主導(dǎo)真菌Ascomycota的相對豐度，但在無機(jī)肥處理下其豐度降低［50-51，66]。除此之外，NPK應(yīng)用顯著增加了已知致病性狀的真菌類群的豐度，如Chaetothyriales目，Chaetothyriaceae和Pleosporaceae科，以及Corynespora、Bipolaris和Cyphellophora種；相反，在有機(jī)肥施加的處理中則抑制了可能的致病性真菌生長，并增加真菌的生物多樣性，從而提高土壤和作物的健康狀況［49，51，67-68]。AOA和AOB對不同施肥處理的響應(yīng)也有差異，與NPK相比，有機(jī)肥的應(yīng)用增加了AOB豐度，但降低了AOA豐度［55，69]。有機(jī)肥能夠強(qiáng)烈改變原核生物的組成，提高原核多樣性，改善長期施肥下原核生物的群落結(jié)構(gòu)［34，70]。

3.3 施肥條件下土壤性質(zhì)和土壤微生物的耦合

土壤微生物群落的生長、活動和功能多樣性受到各種土壤理化的影響，包括土壤pH、總氮（TN）、有機(jī)碳（SOC）含量及土壤酶活性。在施肥條件下，pH是改變細(xì)菌、真菌、古菌及原生生物等微生物落群落的主要驅(qū)動因素，TN、SOC、酶活性等因素也是不同種類微生物群落組成的重要貢獻(xiàn)者［2，53，71-72]。無機(jī)肥長期施加下，細(xì)菌多樣性在中性土壤中最高，在酸性土壤中較低，并且在pH低于5的土壤中，細(xì)菌群落組成的差異最為明顯［73]。Ma等［51]在探究中國黑土地上真菌群落組成對長期化學(xué)和有機(jī)肥施用的響應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，土壤有機(jī)質(zhì)和pH值是真菌群落組成的兩個最重要的貢獻(xiàn)者。Zhang等［74]的研究中，隨著不同施肥處理土壤pH的降低，AOA與AOB豐度的比例大大增加，表明紅壤水稻土的pH值是影響AOA和AOB豐度和群落結(jié)構(gòu)的重要因素。施用氮磷鉀肥加豬糞可以提高土壤pH值，改善土壤有機(jī)碳含量和聚集，提高原核多樣性，改善27年施肥后原核生物的群落結(jié)構(gòu)［34]。不同施肥處理引起的碳、氮水平改變，影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。Zhang等［75]在短期N添加后，人工林土壤SOC、TN和總磷（TP）的含量和元素比率發(fā)生了變化，進(jìn)而引起微生物群落分布受到N添加的限制。Wang等［76]對中國東北黑土長期施肥的研究中指出，土壤NH4+、TN和TC分別解釋了不同有機(jī)無機(jī)肥處理間21%、19%和18%的尿素分解微生物豐富變化，并且他們也提出糞肥應(yīng)用是尿素分解微生物群落的主要驅(qū)動力。與此同時，微生物自身活動會改變土壤團(tuán)粒的直徑和結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變土壤物理性狀；另一方面，微生物會參與土壤有機(jī)質(zhì)和礦物質(zhì)的分解，參與土壤中碳、氮、磷等多種元素的循環(huán)，改變土壤化學(xué)特征［77]。在微生物協(xié)助下，有機(jī)肥的分解歷程中會產(chǎn)生包含有多種酸性功能團(tuán)的腐殖酸，是一類弱酸，其憑借酸基和胺基質(zhì)子化來增強(qiáng)土壤的酸堿緩沖能力，緩解因單純施加無機(jī)肥引起的土壤酸化問題［78]。因此施肥條件下土壤理化性質(zhì)與微生物兩者絕不是割裂開的，兩者相互耦合，相輔相成，共同促進(jìn)作物和植物的生長。

4 不足和展望

雖然前人關(guān)于不同施肥處理對土壤理化性質(zhì)、酶活性以及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響進(jìn)行了大量的研究，但是在新方法的采用、稀有微生物的研究、微生物組的綜合分析及微生物功能的探究等方面仍然缺少深入的闡述，亟待開展相關(guān)的研究。

4.1 新方法的采用與多組學(xué)融合

除上文中提到的微生物檢測方法，單細(xì)胞測序技術(shù)、第三代測序技術(shù)等新方法也應(yīng)該引入土壤微生物組的研究。任何一種單獨(dú)檢測手段都有其優(yōu)缺點(diǎn)，因此以后的研究需要將多種檢測方法結(jié)合（如培養(yǎng)與測序結(jié)合、多種組學(xué)的聯(lián)合使用），優(yōu)勢互助，消除單一技術(shù)的弊端，才能更加全面地了解不同施肥方式對微生物組的影響，并且隨著測序等檢測技術(shù)以及生物信息學(xué)的發(fā)展，檢測成本會逐步降低，數(shù)據(jù)庫會越來越完善。

4.2 稀有微生物的研究

稀有物種代表了大量的遺傳多樣性，并且在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的關(guān)鍵生態(tài)功能［79]。目前土壤微生物的相關(guān)研究大多集中于相對豐度較高的優(yōu)勢微生物，但稀有微生物的種類遠(yuǎn)多于優(yōu)勢微生物，能夠?qū)ν寥拉h(huán)境的變化和施肥處理做出敏感的響應(yīng)，因此確定稀有微生物在不同施肥處理下的波動、了解調(diào)控稀有微生物的因素至關(guān)重要。

4.3 微生物組的綜合分析

土壤微生物對土壤肥力至關(guān)重要，目前大多數(shù)關(guān)于施肥對土壤微生物組的研究集中于細(xì)菌和/或真菌群落上，原生生物、古菌等微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中也起到舉足輕重的作用，其對有機(jī)肥和無機(jī)肥的不同響應(yīng)研究需要被重視。不同有機(jī)-無機(jī)施肥處理下絕非是單一類型微生物的變化，微生物組的綜合分析才能更為全面地揭示復(fù)雜的土壤微生態(tài)。

4.4 微生物功能的探究

微生物組成及其功能多樣性對于生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的維持和修復(fù)起著至關(guān)重要的作用［80]。前人的研究更多的集中在施肥處理如何影響土壤微生物組成，對其影響土壤微生物功能尚缺少充分的闡述。不同類型的微生物在土壤微生物網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著各自的功能，各司其職，不同功能的微生物協(xié)同調(diào)控才能使肥料養(yǎng)分得以高效利用。微生物功能的探究能讓我們進(jìn)一步了解不同施肥處理下土壤的運(yùn)作機(jī)制，指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)合理施肥和可持續(xù)發(fā)展。

綜上，無機(jī)肥可增加土壤速效養(yǎng)分含量，提高土壤肥力；有機(jī)肥可改良土壤物理結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力儲蓄，改善土壤微生物組的豐度和多樣性及菌群結(jié)構(gòu)，有機(jī)-無機(jī)肥配施將是保證農(nóng)業(yè)作物可持續(xù)發(fā)展的重要舉措。不同的作物種類、不同的土地利用類型、不同來源和成分的有機(jī)無機(jī)肥也決定最佳配施比例并不唯一，因此測土配方施肥、有機(jī)-無機(jī)精準(zhǔn)配施將是未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的科學(xué)施肥方式。