程 琰,毛旭虎，宋 陽,賀政新,陳 晶,曾 倩,高杰英,王縛鯤△

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八○醫(yī)院/白求恩國際和平醫(yī)院檢驗科,河北石家莊 050082；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)系臨床微生物與免疫學(xué)教研室，重慶 400038；3.中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心檢驗醫(yī)學(xué)中心，北京 100853)

查菲埃立克體為一類革蘭陰性專性細(xì)胞內(nèi)寄生病原體，是重要的人獸共患自然疫源性疾病病原體。該病原體通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞侵入宿主細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)空泡中，以膜包裹的包涵體形式生存和繁殖。諸多研究表明[1-2]，查菲埃立克體通過抑制吞噬體溶酶體的融合，從而逃避宿主殺傷并導(dǎo)致宿主的持續(xù)性感染，但其機制尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，查菲埃立克體吞噬體雖然具有早期吞噬體標(biāo)記分子Rab5，且空泡型腺苷三磷酸酶為陽性，但是缺乏溶酶體標(biāo)記分子，導(dǎo)致吞噬體的發(fā)育成熟及其與溶酶體的融合受到了抑制[3]。

早期內(nèi)吞體相關(guān)蛋白1(EEA1)為Rab5重要的效應(yīng)分子之一，通過與活化形式的Rab5(Rab5-GTP)相互作用在早期吞噬體的發(fā)育成熟過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。以往的研究以及本課題組前期的研究均證實了查菲埃立克體感染宿主細(xì)胞后，Rab5存在于吞噬體上，但吞噬體與溶酶體融合受到了抑制，本課題組推測Rab5的效應(yīng)分子EEA1在病原體感染過程中發(fā)揮重要作用。為驗證此假設(shè)，本研究擬構(gòu)建EEA1的慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的DH82細(xì)胞系，探索EEA1過表達(dá)后對細(xì)胞感染率及病原體繁殖的影響，為進一步闡明查菲埃立克體導(dǎo)致宿主持續(xù)感染的致病機制提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑 慢病毒載體GV287、包裝質(zhì)粒pHelper1.0、pHelper2.0由上海吉凱生物公司提供；Lip2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、AgeⅠ購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自上海生工公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mega公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；PCR產(chǎn)物快速膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒均購自TaKaRa公司；EEA1單克隆抗體購自Santa Cruz公司；兔抗鼠IgG-HRP購自中山生物技術(shù)有限公司；DH82細(xì)胞、查菲埃立克體分離株由美國德克薩斯醫(yī)學(xué)院病理系于學(xué)杰教授惠贈；293T細(xì)胞由陸軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)系臨床微生物與免疫學(xué)教研室惠贈。

1.2引物設(shè)計與目的片段的擴增 使用Trizol法提取犬巨噬細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板擴增目的基因。從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到EEA1序列，交由上海吉凱生物有限公司進行引物合成。上游引物序列：5′-GGA TCCCGC CAC CAT GGA AAT TGC A-3′，下游引物序列為：5′-ACC GGTTCC TTG CAA GTC ATT GAA ACA T-3′，下劃線區(qū)為酶切位點，上游引物酶切位點為BamHⅠ，下游引物酶切位點為AgeⅠ。以含有待擴增序列的DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 40 s，72℃ 55 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳回收基因片段。

1.3慢病毒表達(dá)載體GV287-EEA1的構(gòu)建與鑒定 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段并純化。目的片段進行BamHⅠ和AgeⅠ雙酶切，并與慢病毒表達(dá)載體GV287連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌E.coli DH5a，經(jīng)氨卞抗性篩選，挑取單菌落增菌后抽提質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行BamHⅠ和AgeⅠ雙酶切鑒定。經(jīng)雙酶切及PCR鑒定陽性的重組質(zhì)粒送上海生工公司測序。

1.4EEA1慢病毒的包裝和滴度測定 將成功構(gòu)建的GV287-EEA1載體與2種輔助包裝載體pHelper1.0、pHelper2.0混合，按照Invitrogen公司Lip2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。37 ℃孵育8 h后棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入新鮮培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集含有病毒顆粒的293T細(xì)胞上清，4℃ 4 000×g離心10 min，去除細(xì)胞碎片，以0.45 μm濾器過濾上清液，獲得慢病毒原液，并使用逐孔稀釋法測定病毒滴度。測定前1 d，按照每孔1×104個細(xì)胞將293T細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種100 μL，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。準(zhǔn)備8個Ep管，每管中加入90 μL無血清培養(yǎng)基，取待測定的病毒原液10 μL加入到第1管中，混勻后取10 μL加入到第2管中，依次倍比稀釋至最后1管。選取所需細(xì)胞孔，棄去原孔中90 μL培養(yǎng)液，加入90 μL對應(yīng)稀釋好的病毒原液，37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后加入完全培養(yǎng)基100 μL，96 h后觀察熒光表達(dá)情況。根據(jù)表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)計算病毒滴度。病毒滴度(TU/mL)=GFP陽性細(xì)胞數(shù)/稀釋倍數(shù)。

1.5慢病毒感染DH82細(xì)胞及qPCR鑒定EEA1表達(dá) 將生長狀態(tài)良好的DH82細(xì)胞接種在6孔板，每孔2×105個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，按照慢病毒轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)30進行轉(zhuǎn)染。棄去細(xì)胞上清液，加入GV287-EEA1慢病毒與無血清培養(yǎng)基的混合液，加入Polybrene至終濃度為6 μg/mL。同時設(shè)立慢病毒空載體GV287對照組，培養(yǎng)條件同GV287-EEA1慢病毒感染組。12 h后更換細(xì)胞上清為新鮮MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，在熒光顯微鏡下觀察GV287-EEA1慢病毒感染組細(xì)胞內(nèi)GFP表達(dá)，計算慢病毒感染效率。分別收集GV287-EEA1慢病毒載體和GV287慢病毒空載體感染的DH82細(xì)胞，提取各組細(xì)胞總RNA。采用TaKaRa公司qPCR試劑盒檢測EEA1表達(dá)水平。以總RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以cDNA為模板進行實時定量PCR擴增。EEA1上游引物序列為：5′-AGA AAG CTG GAT AAT AC CACT GC-3′，下游引物序列為：5′-TAC TGA GAA GCC TTT CCC ACA-3′；反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s，45個循環(huán)；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。應(yīng)用相對定量法進行數(shù)據(jù)分析。mRNA的相對表達(dá)量用2-ΔΔCt方法來表示，其中ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，-ΔΔCt=對照組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值。2-ΔΔCt反映實驗組相對對照組樣品目的基因的相對表達(dá)水平。

1.6Western blot檢測感染細(xì)胞EEA1的表達(dá) 分別收集GV287-EEA1慢病毒感染組和GV287慢病毒空載體組的DH82細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，800 r/min離心收集細(xì)胞。加入預(yù)冷的含有酶抑制劑PMSF的細(xì)胞裂解液RIPA，冰浴5～10 min后刮取細(xì)胞至離心管，冰浴超聲3次，每次10 s。4 ℃條件下，10 000 r/min離心后收集上清，加入上樣緩沖液，并于100 ℃煮沸10 min。蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，將凝膠電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉過夜以阻斷非特異性結(jié)合位點。利用EEA1單克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG作為二抗，進行Western blot檢測，同時以BSA作為陰性對照。

1.7DH82細(xì)胞感染率及胞內(nèi)查菲埃立克體繁殖檢測 當(dāng)細(xì)胞感染率達(dá)到90%時，收集細(xì)胞，MEM培養(yǎng)基洗滌后，加入不含新生牛血清的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，加入玻璃珠，利用震蕩器破碎細(xì)胞(3次，30 s/次)，4 ℃，400×g離心3 min去除細(xì)胞核和未破碎的細(xì)胞，利用5 μm過濾器分離獲得不含宿主細(xì)胞的查菲埃立克體。待DH82細(xì)胞及穩(wěn)定高表達(dá)EEA1的DH82細(xì)胞密度約為60%時，加入不含宿主細(xì)胞的查菲埃立克體(MOI=50:1～100:1),37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后，參考文獻(xiàn)[5]的方法，通過Diff-Quik染色分別檢測DH82細(xì)胞組及高表達(dá)EEA1 DH82細(xì)胞組在不同感染時間的細(xì)胞感染率并計數(shù)細(xì)胞內(nèi)染成紫色的查菲埃立克體桑葚狀包涵體數(shù)目。

2 結(jié) 果

2.1重組慢病毒載體GV287-EEA1的酶切鑒定與測序 經(jīng)過PCR擴增及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得產(chǎn)物EEA1基因片段大小為400 bp,與預(yù)期大小相符。PCR產(chǎn)物酶切后，與載體GV287連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌DH5a，經(jīng)氨卞抗性篩選挑取單個菌落增菌后，抽提質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和AgeⅠ雙酶切后電泳檢測，在400 bp處可見酶切片段，見圖1。初步證實目的基因已經(jīng)插入到質(zhì)粒載體GV287中。重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明，目的基因成功克隆入慢病毒載體，其序列與GeneBank中公布的完全一致。

注：1為GV287-EEA1雙酶切后的產(chǎn)物；2為標(biāo)準(zhǔn)帶圖1 重組慢病毒載體GV287-EEA1的雙酶切鑒定

2.2慢病毒載體GV287-EEA1的包裝與病毒滴度測定 將構(gòu)建的慢病毒載體GV287-EEA1及包裝質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集濃縮病毒液。慢病毒表達(dá)載體中含有綠色熒光蛋白報告基因標(biāo)記，可通過熒光顯微鏡計數(shù)熒光細(xì)胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。熒光顯微鏡觀察可見大量綠色熒光，見圖2。提示轉(zhuǎn)染成功。本次構(gòu)建病毒滴度為1×109TU/mL。

注：A為GV287-EEA1 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后白光圖像(×200)；B為GV287-EEA1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后綠色熒光圖像(×200)圖2 慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T后GFP表達(dá)

2.3慢病毒GV287-EEA1感染DH82細(xì)胞 攜帶EEA1基因的慢病毒感染DH82細(xì)胞后，熒光顯微鏡可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，感染率為80%以上，見圖3。

2.4qPCR檢測EEA1 mRNA的表達(dá) qPCR檢測結(jié)果顯示，GV287-EEA1慢病毒載體與GV287病毒空載體感染的DH82細(xì)胞表達(dá)EEA1存在差異，GV287-EEA1慢病毒感染組EEA1表達(dá)豐度是GV287慢病毒空載體對照組的1 227 343.825倍(P<0.05)，見圖4A。

2.5Western blot檢測感染細(xì)胞中EEA1的表達(dá) GV287-EEA1及GV287病毒空載體感染DH82細(xì)胞72 h后，Western blot檢測目的蛋白EEA1的表達(dá)。與GV287慢病毒空載體對照組相比GV287-EEA1慢病毒感染組在相對分子質(zhì)量17×103處檢測到一條明顯的蛋白條帶，而空載體對照組未檢測到蛋白條帶。結(jié)果提示，慢病毒載體GV287-EEA1感染的DH82細(xì)胞中EEA1蛋白穩(wěn)定表達(dá)，見圖4B。

注：A為慢病毒GV287-EEA1感染DH82細(xì)胞后白光圖像(×200)；B為慢病毒GV287-EEA1感染DH82細(xì)胞后綠色熒光圖像(×200)圖3 慢病毒感染DH82后GFP表達(dá)

注：A為qPCR檢測EEA1 mRNA的表達(dá)，GV287-control表示GV287慢病毒空載體對照組,GV287-EEA1表示GV287-EEA1慢病毒感染組；B為Western blot 檢測EEA1蛋白的表達(dá)，1表示GV287慢病毒空載體對照組。2表示GV287-EEA1慢病毒感染組圖4 qPCR及Western blot檢測EEA1的表達(dá)

2.6EEA1過表達(dá)可抑制細(xì)胞感染及細(xì)胞內(nèi)查菲埃立克體桑葚狀包涵體繁殖 如圖5所示，查菲埃立克體分別感染DH82細(xì)胞及穩(wěn)定高表達(dá)EEA1的DH82細(xì)胞36 h后，高表達(dá)EEA1DH82細(xì)胞組的細(xì)胞感染率低于對照組的，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高表達(dá)EEA1DH82細(xì)胞組細(xì)胞內(nèi)查菲埃立克體包涵體數(shù)目低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。感染后48 h，高表達(dá)EEA1DH82細(xì)胞組細(xì)胞內(nèi)包涵體數(shù)目少于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但兩組細(xì)胞感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。感染2 d后，高表達(dá)EEA1的DH82細(xì)胞組與DH82細(xì)胞組的細(xì)胞感染率及胞內(nèi)包涵體數(shù)目差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，在感染后的36 h，細(xì)胞感染率有所下降，胞內(nèi)查菲埃立克體的增殖受到一定程度的抑制。

注：A為細(xì)胞感染率的比較；B為包涵體數(shù)目的比較圖5 EEA1過表達(dá)對細(xì)胞感染及細(xì)胞內(nèi)查菲埃立克體桑葚狀包涵體繁殖的影響

3 討 論

立克次體目、無形體科、埃立克體屬的查菲埃立克體，是一種寄生于單核細(xì)胞內(nèi)的革蘭陰性病原體。該病原體于1987年首次被報道，1991年從患者血液中獲得分離鑒定[6]。其所致疾病為單核細(xì)胞埃立克體病(HME)，是一種經(jīng)蜱傳播的人獸共患病。近年來，世界范圍內(nèi)查菲埃立克體感染的報道逐年上升，目前已成為世界性關(guān)注的疾病[7-8]。美國已將其列為法定上報傳染病。分子流行病學(xué)證據(jù)提示我國存在人埃立克體病感染和流行的危險[9-10]。然而，我國對埃立克體的研究開展較晚，臨床確診病例較少，埃立克體導(dǎo)致宿主持續(xù)感染的機制研究還尚屬空白。因此，有必要及時深入開展埃立克體的相關(guān)研究，明確其與宿主相互作用模式和致病機制，為埃立克體的防控提供參考和指導(dǎo)。但是，查菲埃立克體為專性細(xì)胞內(nèi)寄生病原體，無法在體外培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)，其基因敲除技術(shù)也面臨巨大挑戰(zhàn)，并且缺乏有效的研究工具，很大程度上制約了其與宿主細(xì)胞相互作用機制的研究。

Rab蛋白是一類屬于Ras蛋白家族的小GTP酶，人的Rab蛋白包括60多個成員，Rab蛋白家族成員可以特異性地定位于胞質(zhì)中的某些亞細(xì)胞器[11]，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)運過程，包括囊泡的形成、遷移和融合過程[12-14]。Rab5主要位于早期內(nèi)體，控制早期內(nèi)體間的融合與成熟[15]，可作為早期吞噬體的標(biāo)記分子。Rab5存在活化和失活兩種功能狀態(tài)，與GDP結(jié)合時處于失活狀態(tài)，而與GTP結(jié)合時為活化狀態(tài)。EEA1是Rab5蛋白重要的效應(yīng)分子，EEA1與Rab5-GTP相互作用使早期吞噬體發(fā)育為晚期吞噬體。以往的研究發(fā)現(xiàn)EEA1存在于查菲埃立克體吞噬體上[16]；另有研究報道，EEA1短暫(宿主細(xì)胞吞噬乳膠珠的1 h內(nèi))地募集于乳膠珠吞噬體上，但在結(jié)核分枝桿菌吞噬體上未檢測到EEA1[17]；課題組前期利用密度梯度離心法成功獲得了查菲埃立克體吞噬體，并將吞噬體進行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜結(jié)果顯示查菲埃立克體吞噬體具有早期吞噬體標(biāo)記分子Rab5，但未檢測到EEA1及溶酶體標(biāo)志分子[3]，推測可能原因：EEA1短暫的一過性地出現(xiàn)在查菲埃立克體吞噬體上，并與Rab5相互作用促進吞噬體的發(fā)育，但本課題組提取吞噬體并進行質(zhì)譜檢測是在感染率達(dá)到90%，此時距病原體感染宿主細(xì)胞已有2～3 d的時間?；谝陨险撌觯琑ab5的效應(yīng)分子EEA1成為進一步研究查菲埃立克體抑制吞噬體溶酶體融合機制的關(guān)鍵分子之一，如果可以獲得EEA1的過表達(dá)細(xì)胞株，將為下一步研究查菲埃立克體致病機制提供實驗基礎(chǔ)。

犬的巨噬細(xì)胞DH82細(xì)胞是查菲埃立克體的易感細(xì)胞，因此本研究選用DH82細(xì)胞作為工具細(xì)胞。慢病毒載體是在人類免疫缺陷病毒1型基礎(chǔ)上改造而成的一種能高效地將目的基因有效地整合到宿主染色體上并達(dá)到持久性表達(dá)的病毒載體系統(tǒng)。與其他反轉(zhuǎn)錄病毒相比，慢病毒不僅對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，而且具有長期穩(wěn)定表達(dá)、對組織器官無毒性作用、外源基因片段容量大等優(yōu)點。為了獲得長期穩(wěn)定表達(dá)EEA1的細(xì)胞株，本研究選用慢病毒載體。

本研究首先采用分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)，構(gòu)建了慢病毒表達(dá)質(zhì)粒GV287-EEA1，經(jīng)測序證實插入片段序列準(zhǔn)確無誤。將慢病毒重組載體GV287-EEA1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，結(jié)果證實病毒具有良好的滴度及轉(zhuǎn)染效率。然后，利用構(gòu)建成功的EEA1慢病毒載體感染犬的巨噬細(xì)胞DH82，通過qPCR和Western blot從mRNA及蛋白水平檢測DH82細(xì)胞中EEA1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示慢病毒成功感染DH82細(xì)胞。那么，EEA1過表達(dá)后，是否會降低病原體在胞內(nèi)的繁殖呢？本課題組又進一步用查菲埃立克體感染穩(wěn)定表達(dá)EEA1的DH82細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在感染后的36 h，細(xì)胞感染率有所下降，胞內(nèi)查菲埃立克體的增殖受到一定程度的抑制，但病原體沒有能夠被完全清除。這一結(jié)果提示,Rab5與單一效應(yīng)分子EEA1相互作用不足以完全清除病原體；宿主細(xì)胞多種分子在吞噬體與溶酶體融合以及吞噬溶酶體形成中均發(fā)揮作用，其他分子，如Rab7、Rab7的效應(yīng)分子RILP/ORP1L、Rab7與Rab5的共同效應(yīng)分子Mon1/Ccz1，在查菲埃立克體吞噬體成熟、吞噬溶酶體形成、清除病原體過程中發(fā)揮的作用仍有待后續(xù)實驗進一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，本實驗成功構(gòu)建了EEA1慢病毒表達(dá)載體，建立DH82-EEA1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，EEA1過表達(dá)后，病原體的繁殖受到抑制，為進一步研究查菲埃立克體抑制吞噬體溶酶體融合機制提供實驗基礎(chǔ)。但是，本研究仍存在一些不足，EEA1過表達(dá)后，盡管在一定程度上對查菲埃立克體的繁殖起到了抑制作用，但并未清除病原體。其他效應(yīng)分子的作用及這些分子與EEA1協(xié)同在促進吞噬體成熟、吞噬溶酶體形成、有效清除病原體中發(fā)揮的作用有待進一步研究，本課題組將會在后續(xù)研究中不斷探索。