劉長(zhǎng)風(fēng) 張功領(lǐng) 高品一

摘要：為了探究木醋液的抑菌活性，以雜木木醋液為原料，對(duì)其進(jìn)行基本理化性質(zhì)的測(cè)定，采用靜置結(jié)合活性炭吸附法精制粗木醋液，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）對(duì)比粗木醋液與精制木醋液成分的差別。將精制木醋液分別用稀釋法、中和法、蒸餾法、萃取法4種方法處理，確定木醋液有效的抑菌時(shí)間和試驗(yàn)最佳觀察時(shí)間。精制和處理的木醋液用于抑菌試驗(yàn)，研究精制后的木醋液、調(diào)節(jié)pH的木醋液、稀釋木醋液、減壓蒸餾木醋液、萃取木醋液對(duì)霉菌的抑菌效果的影響。結(jié)果表明，木醋液中主要成分是酸類、酚類、酮類和醇類，對(duì)于霉菌的有效抑菌時(shí)間是48 h，最低抑菌濃度為V精制木醋液∶V滅菌水=1∶20，最佳pH為4，減壓蒸餾最宜溫度60 ℃，最佳萃取劑是乙酸乙酯。

關(guān)鍵詞：雜木;木醋液;成分分析;抑菌活性

中圖分類號(hào)：S482.2? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）14-0076-04

Abstract： To explore the antibacterial activity of wood vinegar， the wood vinegar of serayah was used as raw materials to measure the basic physical and chemical properties. The crude wood vinegar was refined by static adsorption combined with activated carbon adsorption. The difference between the crude wood vinegar and the purified wood vinegar was compared by gas chromatography-mass spectrometer（GC-MS） and the purified wood vinegar were disposed of dilution， neutralization， distillation and extraction， respectively. It was determined on effective antibacterial time and the best observation time of the wood vinegar through experiments. The purified and disposed wood vinegar was used for bacteriostatic experiments. The bacteriostatic effects of wood vinegar were studied on mildew in different treatment conditions which were purification， pH regulating， dilution， decompression distillation and extraction， respectively. The results showed that the main components were acids， phenols， ketones and alcohols in wood vinegar and the effective antibacterial time was 48 h for mildew. The minimum bacteriostatic concentration was Vrefined wood vinegar∶Vsterilized water=1∶20， and the optimum pH was 4. The appropriate temperature of decompression distillation was 60 ℃ and the best extraction solvent was ethyl acetate.

Key words： serayah; wood vinegar; component analysis; antibacterial activity

粗木醋液是木材等含纖維素和半纖維素的生物質(zhì)在熱解炭化過程中產(chǎn)生的氣體經(jīng)冷凝回收分離得到的有機(jī)液體組分，是木炭生產(chǎn)的副產(chǎn)品。精制木醋液則是指粗木醋液經(jīng)過精制后所得到的紅褐色澄清液體。木醋液作為一種很好的天然植物素材，制取和精制過程都不產(chǎn)生污染，對(duì)環(huán)境友好，對(duì)人畜無毒害作用。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，木醋液具有殺菌、抑菌、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、除臭、抗氧化性等多種作用，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)、畜牧業(yè)、工業(yè)、環(huán)境保護(hù)、食品加工保鮮及醫(yī)療衛(wèi)生等諸多領(lǐng)域[1-3]。

目前，木醋液的成分分析和應(yīng)用已被廣泛研究。李忠徽等[4]發(fā)現(xiàn)灌施木醋液可有效改善土壤性狀和促進(jìn)辣椒生長(zhǎng);薛桂新等[5]通過木醋液抑制桃黑根霉，可較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)久保桃保鮮;周紅娟等[6]通過灌施木醋液提高鹽堿土酶活性和改善土壤性質(zhì);施琳等[7]發(fā)現(xiàn)苦杏殼木醋液多酚在高溫條件下對(duì)核桃油過氧化具有很好的抑制作用。本試驗(yàn)對(duì)雜木粗木醋液和精制木醋液進(jìn)行成分分析，再對(duì)精制木醋液進(jìn)行處理研究其抑菌活性，為木醋液在醫(yī)療衛(wèi)生方面的應(yīng)用提供支持。

1? 材料與方法

1.1? 供試材料

粗木醋液，以雜木為原料，市售。

菌種為青霉菌（Penicillium sp）、米曲霉菌（Aspergillus oryzae），由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心提供。

1.2? 儀器與試劑

1.2.1? 儀器? GC-MS6800型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、KQ118型超聲波清洗器、DZK-C型數(shù)顯恒溫水浴鍋、PGX-150A型智能光照培養(yǎng)箱、VD-650型桌上式凈化工作臺(tái)、LDZX-50型立式壓力蒸氣滅菌器、SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵、RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、PHS-3C型酸度計(jì)。

1.2.2? 試劑? 活性炭、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、蔗糖、氯化鉀、硝酸鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵、無水乙醇、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氫氧化鈉、氨水等。

1.3? 木醋液的精制方法

粗木醋液靜置3個(gè)月，采用虹吸法吸取中間層澄清液，加入5%活性炭，超聲振蕩10 min，靜置36 h，抽濾3次，得精制木醋液[8]。

1.4? 木醋液的成分分析方法

取粗木醋液與精制木醋液各100 mL，分別用30 mL無水乙醚萃取6次，低溫濃縮，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）進(jìn)行檢測(cè)。

氣相色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度280 ℃，柱溫40 ℃，載氣He，恒溫 2 min后，以5 ℃/min的速度升溫至220 ℃，保留時(shí)間35 min，檢出器FID。

質(zhì)譜條件：EI源，電子能量70 eV，加速電壓0.9 kV，源溫230 ℃，掃描范圍m/z 10～350。

質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)：NIST庫(kù)[9]。

1.5? 木醋液的有效抑菌時(shí)間和抑菌性能測(cè)定

木醋液有效抑菌時(shí)間和抑菌性能的測(cè)定采用濾紙片法[10]。每隔固定的時(shí)間測(cè)量其抑菌圈直徑，抑菌能力的強(qiáng)弱由抑菌圈直徑表示，至抑菌圈直徑不變?yōu)橹梗藭r(shí)為有效抑菌時(shí)間。稀釋木醋液的抑菌性能的測(cè)定，以長(zhǎng)菌部分的面積占培養(yǎng)基總面積的百分比來表示不同濃度的木醋液對(duì)菌種的抑制能力。

1.6? 精木醋液的再處理方法

1.6.1? 梯度調(diào)節(jié)木醋液pH? 采用飽和NaOH、氨水調(diào)節(jié)精制木醋液pH為3、4、5、6、7，供抑菌試驗(yàn)用[11]。

1.6.2? 梯度稀釋木醋液? 將精制木醋液與無菌水分別按精制木醋液∶無菌水（V/V）=1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50、1∶70、1∶100的比例配制成濃度不同的木醋液供抑菌試驗(yàn)用[12]。

1.6.3? 減壓蒸餾木醋液? 將精制木醋液放入旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀中進(jìn)行旋蒸，參數(shù)為T=35、40、50、60、85 ℃，P=0.095 MPa，n=35 r/min。直至無蒸出物為止，得到的殘留液和餾出液，供抑菌試驗(yàn)用[13]。

1.6.4? 萃取劑萃取木醋液? 取3份精制木醋液100 mL，分別用無水乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯30 mL進(jìn)行萃取，萃取6次，得到乙醚層、二氯甲烷層、乙酸乙酯層木醋液和水層剩余液，供抑菌試驗(yàn)用。取乙醚層、二氯甲烷層、乙酸乙酯層木醋液平均分為8份，分別經(jīng)不同濃度的NaHCO3溶液萃取，將水層酸化至原木醋液酸值，再以3種萃取劑萃取酸化后的水層，以酸堿滴定法測(cè)定組分中酸性物質(zhì)的含量[14，15]。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 木醋液的基本理化性質(zhì)與成分分析

木醋液的直觀感受呈黑褐色，伴有木焦味、煙熏味，pH為2.20～3.35，相對(duì)密度為0.9 g/cm3。

2.1.1? 粗木醋液的成分分析? 粗木醋液的GC-MS共檢出71種物質(zhì)，占整個(gè)出峰面積的17.51%，其中有機(jī)酸類有7種，占總含量的9.10%，在所有單一化合物中乙酸的含量最高，達(dá)到8.78%。酚類有14種，占總含量的1.18%。酮類有16種，占總含量的2.08%。醇類有8種，占總含量的2.80%。其他物質(zhì)包含胺、脂、醛等，占總含量的0.86%。粗木醋液中有機(jī)酸、酚類、酮類、醇類的含量都很高。

2.1.2? 精制木醋液的成分分析? 精制木醋液的GC-MS共檢出21種物質(zhì)，占整個(gè)出峰面積的22.35%，其中有機(jī)酸類有6種，占總含量的11.44%。酚類有3種，占總含量的0.88%。酮類有2種，占總含量的0.56%。醇類有2種，占總含量的0.28%。呋喃1種，占總含量的0.47%。烯烴類1種，占總含量的0.64%。胺類有4種，占總含量的0.44%。酯類有2種，占總含量的7.64%。其中乙酸在所有單一化合物中的含量最高，達(dá)到9.40%。

對(duì)比成分分析結(jié)果可知，精制木醋液的有機(jī)酸含量比粗木醋液的有機(jī)酸含量高，酚類、酮類、醇類物質(zhì)的含量均有下降，且酮類、醇類物質(zhì)的含量下降幅度較大，精制木醋液中無醛類、丙基肼、1，4，5，6-四氫吡啶-3-腈、1-甲基-2-乙烯基-1H-咪唑等有害物質(zhì)。

2.2? 木醋液對(duì)霉菌的有效抑菌時(shí)間和抑菌效果對(duì)比

由圖1可知，粗木醋液和精制木醋液對(duì)霉菌的抑制趨勢(shì)相近，青霉菌、米曲霉菌在42 h前生長(zhǎng)緩慢，僅憑肉眼看不到明顯的菌落，也無抑菌圈，48 h后開始大量生長(zhǎng)，長(zhǎng)出肉眼可見的菌落，出現(xiàn)非常明顯的抑菌圈，然后隨著時(shí)間的增加抑菌圈一直在小范圍縮小，基本對(duì)抑菌圈的直徑改變不大，一直持續(xù)到60 h后基本不變。因此，有效抑菌時(shí)間為48 h左右。

由圖2可知，粗木醋液處理過的抑菌圈要比精制木醋液處理過的抑菌圈直徑大1 mm左右，結(jié)合顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)精制木醋液的抑菌圈雖稍小但其形狀規(guī)則光滑，結(jié)合成分分析精制木醋液不含無用和有害的成分，更安全可控，后續(xù)試驗(yàn)中選擇精制木醋液用于開展抑菌試驗(yàn)。

2.3? 再處理木醋液對(duì)霉菌抑制效果的影響

2.3.1? 梯度調(diào)節(jié)木醋液pH的抑菌效果? 由圖3可知，精制木醋液抑菌效果與pH呈負(fù)相關(guān)，pH為4時(shí)的抑菌效果最優(yōu)，pH為中性時(shí)無抑制米曲霉菌效果，pH大于6時(shí)，無抑制青霉菌效果。這與尉芹等[16]結(jié)論一致，說明木醋液中的酸性物質(zhì)對(duì)木醋液的抑菌能力起主導(dǎo)作用，是多種有效成分參與的綜合作用。

2.3.2? 梯度稀釋木醋液對(duì)霉菌的最低抑菌濃度? 由圖4可知，精制木醋液稀釋后對(duì)霉菌的抑制效果與稀釋濃度呈負(fù)相關(guān)。木醋液對(duì)霉菌的最低抑菌濃度為V精制木醋液∶V滅菌水=1∶20時(shí)，實(shí)際應(yīng)用中建議采用體積比為1∶10以上的稀釋木醋液以保證抑菌效果。

2.3.3? 減壓蒸餾木醋液抑制霉菌效果比較? 由圖5、圖6、圖7可知，殘留液的抑菌效果優(yōu)于餾出液。不同溫度下殘留液的抑菌效果從強(qiáng)到弱依次為60、85、50、40、35 ℃。60 ℃的殘留液稀釋到80倍以內(nèi)，均有抑菌效果。

2.3.4? 萃取劑萃取木醋液抑制霉菌效果比較? 由圖8可知，經(jīng)萃取劑萃取過的木醋液的抑菌圈直徑要遠(yuǎn)大于水層與精制木醋液，其抑菌圈直徑大小表現(xiàn)為萃取層木醋液>精制木醋液>水層木醋液，且乙酸乙酯>乙醚>二氯甲烷。顯微鏡觀察萃取層的抑菌圈雖大但其邊緣不光滑，形狀接近于圓。

由表1可知，有機(jī)酸含量表現(xiàn)為乙酸乙酯>乙醚>二氯甲烷，其與抑菌效果表現(xiàn)相符。結(jié)合其萃取層的抑菌效果與有機(jī)酸含量可知，萃取層木醋液含有木醋液中絕大多數(shù)有效抑菌成分酸類、酚類，且乙酸乙酯為最佳萃取劑。

3? 小結(jié)與討論

木醋液的直觀感受呈黑褐色，伴有木焦味、煙熏味，pH為2.20～3.35，相對(duì)密度為0.9 g/cm3。粗木醋液與精制木醋液相比，粗木醋液中主要成分按含量從多到少為酸類、醇類、酮類、酚類，而精制木醋液從多到少為酸類、酚類、酮類、醇類。木醋液對(duì)霉菌的有效抑菌時(shí)間是48 h，其中酸性物質(zhì)起主導(dǎo)作用，但也是所有有效抑菌成分的綜合作用。

木醋液對(duì)霉菌的最低抑菌濃度為V精制木醋液∶V滅菌水=1∶20時(shí)，實(shí)際應(yīng)用中建議采用體積比為1∶10以上的稀釋木醋液。減壓蒸餾處理后殘留液的抑菌效果比較好，且60 ℃的減壓蒸餾木醋液抑菌效果最好。經(jīng)萃取劑萃取過的木醋液的抑菌效果最好的是萃取層，最佳萃取劑是乙酸乙酯。

不同的精制方法和不同的處理方法可以使木醋液更好地應(yīng)用于各個(gè)行業(yè)，既能提高在各行業(yè)應(yīng)用中的效果又能避免浪費(fèi)。目前木醋液在農(nóng)林業(yè)、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣，期待將來木醋液會(huì)得到更深度的開發(fā)應(yīng)用。

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