周 鳳，耿增超,2*，許晨陽，劉莉麗，張久成，李倩倩，陳樹蘭，王 咪，王慧玲

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西北植物營養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，陜西楊凌 712100；2 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西楊凌 712100；3 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境重點實驗室，北京 100081；4 漢中市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢驗中心，陜西漢中 723000）

土壤微生物作為生物圈中不可缺少的活性部分，參與動植物殘體降解、養(yǎng)分循環(huán)與平衡、土壤污染的生物修復(fù)等過程，能敏感地反映土壤生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生的微小變化[1]。土壤微生物量是指土壤中體積小于5 × 103μm3的生物總量[2](活的植物體如植物根系除外)，是反映土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化循環(huán)和能量流動的重要指標(biāo)[3]，而土壤微生物代謝活性一直是衡量土壤健康質(zhì)量和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要生物指標(biāo)[4]。生物炭的添加會直接或間接影響土壤微生物的生長代謝，提高或降低土壤微生物量，改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成，從而影響土壤環(huán)境中微生物主導(dǎo)的生物地球化學(xué)循環(huán)[5]，Zavalloni等[6]的短期試驗表明，添加易變有機碳含量低的生物炭對土壤微生物量無顯著影響；相反，張星等[7]的長期定位試驗顯示，添加生物炭顯著提高了微生物量碳、氮。陳偉等[8]的盆栽試驗發(fā)現(xiàn)，稻殼生物炭添加量分別為土重3%和6%時，均提高了供試褐土中微生物對碳源的利用能力；而武愛蓮等[9]在褐土中施用0、5、10、30、60 g/kg玉米秸稈生物炭的盆栽試驗結(jié)果顯示，高量生物炭的添加影響了土壤微生物利用碳源的能力，導(dǎo)致其碳源代謝活性降低。

目前，關(guān)于生物炭對土壤微生物影響的報道多集中在生物炭對農(nóng)田肥力相關(guān)菌群生長代謝影響的盆栽或短期田間試驗上，對土壤微生物生態(tài)功能長期效應(yīng)影響的研究還比較匱乏[5]。因此，本文通過長期田間試驗，研究了生物炭添加4～5年后，其添加量對冬小麥不同生育期土壤微生物量的動態(tài)變化及對土壤微生物碳源代謝活性的影響，以期為生物炭在陜西關(guān)中地區(qū)的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗于2015年10月到2016年6月在陜西省楊凌示范區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗田 (34°16′N，108°04′E，海拔458.6 m) 進行，其基本理化性質(zhì)為：有機質(zhì)12.6 g/kg、全氮0.71 g/kg、全磷0.43 g/kg、全鉀19.6 g/kg、硝態(tài)氮18.2 mg/kg、銨態(tài)氮15.9 mg/kg、速效磷12.4 mg/kg、速效鉀193 mg/kg、pH(水土比2.5∶1) 7.3、容重1.30 g/cm3。試驗區(qū)地勢平坦，屬于暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫11～13℃，年降水量500～700 mm，年均日照時數(shù)2196 h，無霜期210 d。試驗區(qū)土壤類型為褐土類，土亞類，紅油土屬，黃土母質(zhì)，系統(tǒng)分類為土墊旱耕人為土，屬石灰性土壤。2015—2016年冬小麥生長季的溫度和降水量如圖1所示。

圖 1 2015—2016年冬小麥生長季溫度和降水量Fig. 1 Temperature and monthly rainfall of winter wheat growing seasons during 2015 to 2016

1.2 試驗材料

供試生物炭是由廢棄果樹樹干、枝條在450℃裂解爐中、限氧條件下裂解所得，由陜西億鑫生物能源科技開發(fā)有限公司提供?；纠砘再|(zhì)為：C 72.38%、N 1.19%、O 23.81%、H 2.62%、灰分13.98%、硝態(tài)氮0.52 mg/kg、銨態(tài)氮1.86 mg/kg、易氧化有機碳73.59 g/kg、比表面積86.7 m2/g、pH (水土比10∶1) 10.43。

1.3 試驗設(shè)計

本試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，根據(jù)前期室內(nèi)模擬試驗及前人研究文獻中生物炭的不同添加量[10-11]，共設(shè)置了生物炭添加量為0、20、40、60、80 t/hm2的5 個處理，代碼依次為 B0、B20、B40、B60、B80，每個處理3次重復(fù)，共15個小區(qū)，小區(qū)規(guī)格為1.35 m ×3.50 m，各個小區(qū)之間均設(shè)有0.5 m隔離保護帶。于2012年4月27日田間試驗開始前，將供試生物炭磨細(xì)過1 mm篩后一次性撒施于表層土壤，深翻使之與耕層土壤充分混勻，之后不再施用生物炭，到2015年10月，連續(xù)種植了7季作物，分別為玉米、小麥、玉米、小麥、玉米、辣椒、小麥。每季作物所需的氮、磷、鉀肥均作為基肥，于播種前施入，依據(jù)當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)進行除草、冬灌、防控病蟲等田間管理，具體施肥量見表1。

1.4 樣品的采集與分析

土壤樣品于2015—2016年度冬小麥的不同生育期 (分蘗期、越冬期、返青起身期、拔節(jié)孕穗期、灌漿成熟期)，采用對角線5點法采集0—20 cm土層的土壤。隨后將新鮮土壤樣品過2 mm篩后混合均勻，放入無菌袋中，于4℃冰箱中保存，測定其微生物量及微生物功能多樣性。

土壤微生物量碳、氮采用氯仿熏蒸—0.5 mol/L K2SO4直接浸提法測定[12-13]。首先將土壤樣品在25℃下密封培養(yǎng)7天，然后稱取6份預(yù)處理的新鮮土樣7.5 g放入鋁盒中，將其中3份置于真空干燥器 (底部放置有3個燒杯，其中一杯稀NaOH、一杯水和一杯去除乙醇的氯仿) 中，抽真空時，保持氯仿劇烈沸騰3～5 min，然后將真空干燥器移置在黑暗條件中熏蒸土壤24 h，熏蒸結(jié)束后，打開真空干燥器閥門，取出氯仿，在通風(fēng)櫥中使土壤中的氯仿完全散盡。將熏蒸好的土壤轉(zhuǎn)移到100 mL離心管中，加入0.5 mol/L K2SO4浸提液 (水土質(zhì)量比為4∶1)。另外3份未熏蒸土樣操作相同，同時做空白試驗。浸提液中的C采用TOC-VCHP有機碳分析儀測定，土壤微生物量N采用連續(xù)流動分析儀測定。

土壤微生物量磷采用氯仿熏蒸—0.5 mol/L NaHCO3浸提法測定。浸提液中的微生物量P采用鉬銻抗比色法測定[14-16]。

土壤微生物功能多樣性采用Biolog-Eco檢測法[17]測定，取相當(dāng)于5.0 g風(fēng)干土壤樣品的新鮮土壤樣品加入裝有45 mL無菌生理鹽水 (0.85%) 的三角瓶中，用無菌封口膜封口后在搖床 (轉(zhuǎn)速160 r/min) 上振蕩30 min，得到土壤樣品的微生物懸浮液。靜置片刻后吸取其上清液，在超凈工作臺上，采用10倍稀釋法，用無菌生理鹽水 (0.85%) 稀釋濃度至10-3倍，隨后用8通道加樣器將稀釋1000倍的土壤微生物懸浮液接種于Biolog-ECO微平板 (ECO Micro Plate，美國Marix Technologies Corporation) 上，每孔150 μL。將接種后的Biolog-ECO微平板放入28℃生化培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)240 h，每個土壤樣品均做3次重復(fù)，每24 h用Biolog微生物自動讀數(shù)裝置讀取Biolog-ECO微平板在590 nm波長下的吸光值。

表1 2012—2015年7季作物品種及施肥量Table 1 Fertilizer application rates and cultivars for different crop growing seasons during 2012 to 2015

1.5 試驗數(shù)據(jù)處理

土壤微生物量碳 (MBC)、氮 (MBN)、磷 (MBP)通過測定熏蒸、不熏蒸土壤浸提液中碳、氮、磷的增加量來計算，公式[18]如下：

MBC = (熏蒸土壤有機碳 - 未熏蒸土壤有機碳)/0.45

MBN = (熏蒸土壤微生物量氮 - 未熏蒸土壤微生物量氮)/0.25

MBP = (熏蒸土壤浸提的磷量 - 未熏蒸土壤浸提的磷量)/(0.4 ×R)

式中：0.45為浸提液中的有機碳增量換算成MBC的轉(zhuǎn)化系數(shù) (kEc)；0.25為微生物體氮的礦化系數(shù)，即礦化出來的微生物體氮僅為微生物體總氮的0.25倍；0.4為浸提液中MBP占總MBP的比例；R為加入無機磷的回收率，R= (土壤加入K2HPO4溶液后再浸提所得的磷量-未熏蒸土壤浸提的磷量)/25 × 100%，其中，25為浸提前加入的磷量。

土壤微生物代謝活性采用反應(yīng)孔顏色的平均變化率 (average well color development，AWCD) 表示，代表可培養(yǎng)微生物對不同底物 (碳源) 的利用能力，計算公式[19]如下：

式中：AWCD為反應(yīng)孔顏色的平均變化率；Ci為各反應(yīng)孔在590 nm下的吸光值；R為Biolog-ECO微平板對照孔A1的吸光值；Ci-R＜ 0的反應(yīng)孔，計算中默認(rèn)為零，即Ci-R≥ 0。

土壤微生物群落豐富度指數(shù) (richness index，S)采用反應(yīng)孔 (吸光值 ＞ 0.25，則代表該孔的C源被利用，該孔為反應(yīng)孔) 的數(shù)目表示[20]。

土壤微生物群落Shannon-Wiener指數(shù) (H)，代表微生物群落物種和個體分布的均勻程度。

式中：H為土壤微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)；Pi為第i個生物量占總生物量的比率，其中Pi= (Ci-表示C源孔與對照孔A1的吸光值之差與整板總差的比值。

土壤微生物群落均勻度指數(shù) (evenness index，E)采用微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)與生物量總量對數(shù)的比值表示[21]。

式中：E為土壤微生物群落均勻度指數(shù)；H為土壤微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)；S為生物量總量，即豐富度指數(shù)。

土壤微生物群落Simpson指數(shù) (D)，又稱為優(yōu)勢度指數(shù)，用于評估某些最常見種的優(yōu)勢度[22]。

式中：D為土壤微生物群落Simpson指數(shù)；Pi為第i個生物量占總生物量的比率。

主成分分析 (principal component analysis，PCA)是利用降維的思想，在損失較少信息的前提下，將多個變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合變量的方法，采用土壤培養(yǎng)168 h吸光值的平均數(shù)進行微生物功能多樣性的主成分分析。數(shù)據(jù)矩陣包括20行、31列，分別代表試驗設(shè)計中5個處理的4個生育期、Biolog-Eco微平板上的31種碳源。

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013、SPSS 20.0(采用Duncan多重比較檢驗法分析不同處理之間各指標(biāo)的顯著性差異，顯著性水平設(shè)定為α = 0.05) 整理分析，圖形采用Origin 9.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生育期土壤微生物量碳的動態(tài)變化

圖2-A顯示，冬小麥整個生育期，B20、B40、B60、B80處理的MBC變化趨勢基本一致，均表現(xiàn)為上升—下降—上升的規(guī)律，具有明顯的季節(jié)性；B0處理則一直呈現(xiàn)上升趨勢。

與B0處理相比，分蘗期B20、B40、B60、B80處理的MBC分別增加了28.2%、75.4%、184.3%、51.8%，均達到顯著水平；越冬期B20、B40、B60、B80處理的MBC分別增加了18.9%、19.0%、79.3%、65.4%，其中B60、B80與B0處理的差異達到顯著水平；返青起身期B20、B40、B60、B80處理的MBC分別降低了16.8%、7.50%、40.1%、13.6%，其中僅B60與B0的差異達到顯著水平；拔節(jié)孕穗期B20、B40、B60、B80處理的MBC分別增加了8.25%、15.3%、8.58%、2.35%，不同處理間的差異均未達到顯著水平；灌漿成熟期B20、B40、B60、B80處理的MBC分別增加了40.5%、55.9%、44.3%、8.70%，其中B20、B40、B60與B0處理的差異達到顯著水平。

隨著生物炭添加量的增加，分蘗期、越冬期、拔節(jié)孕穗期、灌漿成熟期MBC的增幅呈現(xiàn)先上升后下降的單峰曲線，分蘗期、越冬期的MBC均在生物炭添加量為60 t/hm2時達到峰值；拔節(jié)孕穗期、灌漿成熟期的MBC均在生物炭添加量為40 t/hm2時達到峰值；返青起身期的MBC在生物炭添加量為60 t/hm2時降到最低，其降幅沒有明顯的變化規(guī)律。

B20、B40、B60、B80處理的MBC在冬小麥整個生育期的平均值與B0處理相比，分別增加了15.2%、27.9%、38.2%、16.9%，當(dāng)生物炭添加量為40～60 t/hm2時達到顯著水平，且增幅隨添加量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，說明添加生物炭有助于提高MBC，但添加量超過閾值后，效果反而下降。

2.2 不同生育期土壤微生物量氮的動態(tài)變化

冬小麥整個生育期，B0、B40、B60處理的MBN變化趨勢基本一致，均表現(xiàn)為先上升后下降的單峰曲線；B20、B80處理則呈現(xiàn)上升—下降—上升的變化趨勢。B20、B40、B60、B80處理的MBN均在返青起身期達到峰值，與B0處理相比，均達到顯著水平；B0處理則在拔節(jié)孕穗期達到峰值。越冬期、拔節(jié)孕穗期、灌漿成熟期B20、B40、B60、B80處理的MBN與B0處理的差異均未達到顯著水平，分蘗期僅B40、B60處理的MBN與B0處理的差異達到了顯著水平 (圖 2-B)。

與B0處理相比，B20、B40、B60處理的MBN在冬小麥整個生育期的平均值分別增加了12.7%、5.23%、8.43%，B80處理則減少了2.93%，均未達到顯著水平，說明MBN對生物炭的添加并不敏感，生物炭的添加量過高易產(chǎn)生反作用，這可能是因為生物炭主要屬于穩(wěn)定的碳源，添加生物炭4～5年后，不能給土壤微生物提供較多的氮源[23]或生物炭中的惰性碳固持了土壤氮素，而高量生物炭的添加又會引起作物根系與土壤微生物對養(yǎng)分吸收競爭的激化，從而導(dǎo)致MBN降低，這與Zhang等[24]在華北平原連續(xù)四年施用生物炭的田間試驗結(jié)果相似。

2.3 不同生育期土壤微生物量磷的動態(tài)變化

圖2-C表明，B0、B40、B60、B80處理的MBP隨不同生育期的變化均表現(xiàn)為下降-上升-下降的趨勢，最高值均出現(xiàn)在分蘗期，與B0處理的差異均未達到顯著水平；B20處理則沒有明顯的變化規(guī)律，最高值出現(xiàn)在越冬期，與B0處理的差異也未達到顯著水平。

與B0處理相比，返青起身期B20、B60、B80處理的MBP分別增加了23.1%、0.63%、98.4%，B40降低了8.63%，其中僅B80與B0處理的差異達到顯著水平；拔節(jié)孕穗期B20、B40、B60、B80處理的MBP分別降低了24.7%、42.1%、36.8%、18.4%，其中B40、B60與B0處理的差異均達到顯著水平；灌漿成熟期B20、B40、B60、B80處理的MBP分別增加了185.4%、96.2%、95.1%、42.6%，其中B20、B40、B60與B0處理的差異均達到顯著水平。

圖 2 不同生育期土壤微生物量碳、氮、磷、碳/氮的動態(tài)變化Fig. 2 Dynamic changes of soil microbial biomass carbon, nitrogen, phosphorus and carbon/nitrogen ratio at different growth periods of winter wheat

隨著生物炭添加量的增加，土壤MBP在冬小麥整個生育期的平均值呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢，與B0處理相比，B20、B40、B60處理的MBP分別減少了5.57%、14.4%、11.4%，即當(dāng)生物炭添加量為40 t/hm2時，降到最低；B80處理則增加了10.0%，不同處理間均未達到顯著水平，說明添加生物炭后，隨著作物根系[25]與土壤微生物競爭的激化，有效磷被耗竭時，微生物磷被迫釋放出來，從而降低了MBP，當(dāng)添加量為80 t/hm2時，MBP反而增加的原因可能是此時氮素的缺乏限制了作物根系與土壤微生物的競爭，保留了前期固持的MBP。

2.4 不同生育期土壤微生物量碳氮比的動態(tài)變化

圖 2-D顯示，B20、B40、B60、B80處理的MBC/MBN隨不同生育期的變化均表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢，在返青起身期降到最低，B0基本沒有變化，始終維持在5.02～6.26之間。

與B0處理相比，分蘗期B20、B40、B60、B80處理的MBC/MBN分別增加了22.5%、25.4%、75.2%、69.8%，其中B60、B80與B0處理的差異達到顯著水平；越冬期B20、B40、B60、B80處理的MBC/MBN分別增加了25.6%、25.3%、52.1%、61.5%，與B0處理的差異均達到顯著水平；返青起身期B20、B40、B60、B80處理的MBC/MBN分別降低了37.3%、27.4%、49.8%、34.2%，與B0處理的差異均達到顯著水平；拔節(jié)孕穗期B40、B60、B80處理的MBC/MBN分別增加了17.3%、15.2%、27.8%，而B20處理的MBC/MBN則降低了3.88%，不同處理間的差異均未達到顯著水平；灌漿成熟期B20、B40、B60、B80處理的MBC/MBN分別增加了25.9%、126%、95.9%、30.9%，其中B40、B60與B0處理的差異達到顯著水平。

隨著生物炭添加量的增加，分蘗期的MBC/MBN在生物炭添加量為60 t/hm2時達到峰值，灌漿成熟期的MBC/MBN則在生物炭添加量為40 t/hm2時達到峰值，其增幅均呈現(xiàn)先上升后下降的單峰曲線；越冬期、拔節(jié)孕穗期的MBC/MBN均在生物炭添加量為80 t/hm2時達到峰值，其增幅呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢；返青起身期的MBC/MBN在生物炭添加量為60 t/hm2時降到最低，其降幅沒有明顯的變化規(guī)律。

B20、B40、B60、B80處理在冬小麥整個生育期MBC/MBN的平均值與B0處理相比，分別增加了3.75%、23.7%、25.1%、25.5%，當(dāng)生物炭添加量 ≥40 t/hm2時，達到顯著水平，說明生物炭的添加有助于提高MBC/MBN。

2.5 MBC、MBN、MBP及MBC/MBN的季節(jié)變異程度

由表2可知，冬小麥整個生育期，土壤微生物量表現(xiàn)出明顯的季節(jié)波動，與B0處理相比，當(dāng)生物炭添加量為20 t/hm2時，顯著增加了MBC的季節(jié)波動，添加量為40～60 t/hm2時，顯著增加了MBC/MBN的季節(jié)波動，添加量為20～60 t/hm2時，顯著降低了MBP的季節(jié)波動，而添加生物炭對MBN的季節(jié)波動沒有顯著影響，表明添加生物炭可以增加或減少土壤微生物量的季節(jié)變化程度，降低或提高土壤環(huán)境的穩(wěn)定性，這與其添加量息息相關(guān)。

表2 不同處理下土壤微生物量的變異系數(shù) (%)Table 2 Variation coefficients of soil microbial biomass in different treatments

2.6 不同生育期土壤微生物碳源代謝活性的動態(tài)分析

隨著培養(yǎng)時間的延長，各個生育期土壤微生物的AWCD值逐漸上升，表明其碳源代謝活性逐漸增加，24 h內(nèi)各處理的AWCD值無明顯變化，24 h后快速上升，直至168 h后變化基本趨于平緩，表明土壤微生物生長減慢且步入了穩(wěn)定期 (圖3)。因此，可以確定培養(yǎng)時間168 h是所研究土壤微生物生長對數(shù)期和穩(wěn)定期的臨界值[26]，因此，采用此時的AWCD值進行土壤微生物碳源代謝活性分析。

與B0處理相比，越冬期B20處理增加了9.62%，B40、B60、B80處理則分別減小了6.20%、17.2%、2.95%，差異均未達到顯著水平 (圖3-A)；返青起身期 B20、B40、B60、B80處理分別減小了15.9%、20.8%、26.6%、34.1%，其中B40、B60、B80與B0處理的差異均達到顯著水平 (圖3-B)；拔節(jié)孕穗期B20、B60處理分別增加了8.23%、7.37%，而B40、B80處理分別減小了0.92%、20.9%，其中B80與B0的差異達到顯著水平 (圖3-C)；灌漿成熟期B20、B40、B80處理分別增加了5.94%、12.6%、34.5%，而B60處理則減小了2.47%，其中B60、B80與B0處理的差異達到顯著水平 (圖3-D)。

不同生育期土壤培養(yǎng)168 h時，隨著生物炭添加量的增加，土壤微生物AWCD的平均值呈現(xiàn)增加-降低-增加的變化趨勢，但不同處理間沒有顯著差異。當(dāng)生物炭添加量為20 t/hm2時，土壤微生物的AWCD值最高，而生物炭添加量 ≥ 40 t/hm2時，土壤微生物的AWCD值均低于B0處理，表明添加生物炭有助于提高土壤微生物的碳源代謝活性，但要嚴(yán)格控制其添加量，高量生物炭的添加有降低土壤微生物整體代謝活性的趨勢。

圖 3 不同生育期土壤微生物平均顏色變化率(AWCD)Fig. 3 Changes of average well color development(AWCD) at different growth periods of winter wheat

2.7 土壤微生物功能多樣性指數(shù)分析

采用不同生育期的土壤培養(yǎng)168 h吸光值的平均值進行土壤微生物功能多樣性指數(shù)的計算（表3）。表3表明，隨著生物炭添加量的增加，土壤豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)均呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢，均在生物炭添加量為0 t/hm2時最高，60 t/hm2時降到最低，表明生物炭的添加降低了土壤微生物群落的復(fù)雜程度；土壤均勻度指數(shù)則呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，在生物炭添加量為60 t/hm2時升到最高，0 t/hm2時最低，表明生物炭的添加增加了土壤微生物群落物種分布的均勻程度。當(dāng)生物炭添加量為60 t/hm2時，顯著降低了土壤豐富度指數(shù)，顯著提高了均勻度指數(shù)；當(dāng)生物炭添加量 ≥ 60 t/hm2時，顯著降低了Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)。

表3 土壤微生物功能多樣性指數(shù)Table 3 Functional diversity indices of soil microbial community

2.8 土壤微生物的碳源代謝類型分析

根據(jù)Biolog-ECO微平板上碳源官能團的不同將其分為6大類：其中糖類10種、氨基酸類6種、羧酸類7種、多聚物類4種、多酚化合物類2種、多胺類2種[27]。通過對6大類碳源吸光值的計算，可以明確土壤微生物對不同碳源的利用率。采用不同生育期的土壤培養(yǎng)168 h吸光值的平均值進行土壤微生物碳源代謝類型分析。

由表4可知，B0、B20、B40、B80處理的土壤微生物對六大類碳源的利用率由大到小依次為氨基酸類 ＞ 糖類 ＞ 羧酸類 ＞ 多聚物類 ＞ 多胺類 ＞ 多酚化合物類；而B60的土壤微生物對六大類碳源的利用率由大到小則為氨基酸類 ＞ 糖類 ＞ 多聚物類 ＞ 羧酸類 ＞多胺類 ＞ 多酚化合物類，表明氨基酸類、糖類是土中微生物利用率較高的碳源，這與本課題組前期的研究結(jié)果[28]相同。

添加生物炭對土壤微生物利用糖類、氨基酸類、多聚物類、多酚化合物類、多胺類碳源的利用率沒有顯著影響，當(dāng)生物炭添加量為60 t/hm2時，土壤微生物顯著降低了對羧酸類碳源的利用率，說明外源生物炭的添加可以改變土壤微生物的碳源代謝類型。

2.9 土壤微生物功能多樣性主成分分析

對土壤微生物碳源代謝情況進行主成分分析，提取主成分相對應(yīng)特征值大于1的前8個主成分，累積貢獻率為84.9%。其中第1主成分 (PC1) 的特征根和貢獻率分別為13.2和42.4%，第2主成分 (PC2)的特征根和貢獻率分別為2.88和9.30%，第3～8主成分的特征根和貢獻率較小，分別為1.29～2.44和4.16%～7.87%，其中對PC1貢獻較大的碳源有14種，分別為糖類4種 (D,L-α-磷酸甘油、D-纖維二糖、N-乙酰-D葡萄糖氨、D-甘露醇)、羧酸類4種 (D-蘋果酸、衣康酸、γ-羥丁酸、L-苯丙氨酸)、氨基酸類2種 (L-精氨酸、L-天門冬酰胺)、多胺類2種 (苯乙胺、腐胺)、多酚化合物類1種 (2-羥基苯甲酸)、多聚物類1種 (吐溫40)，對PC2貢獻較大的碳源有2種，分別為多聚物類1種 (肝糖)、羧酸類1種 (丙酮酸甲酯)，主要C源的利用類型為糖類、羧酸類、氨基酸類，表明糖類、羧酸類、氨基酸類碳源是土中微生物比較偏好的碳源，這與土壤微生物的碳源代謝類型分析結(jié)果相似 (表5)。

選取前兩個主成分進行繪圖，以PC1為橫坐標(biāo)(x軸)，PC2為縱坐標(biāo) (y軸)，將不同處理在2個主成分上的得分值為坐標(biāo)繪制而成土壤微生物功能多樣性的主成分分析圖。

PC1、PC2軸將不同處理分為2類，B0、B20分布在第一象限，B40、B60、B80分布在第三象限，說明B0和B20處理，B40、B60、B80處理的土壤微生物C源代謝模式或功能具有相似性，這也揭示了生物炭的不同添加量對土壤微生物群落多樣性具有不同的生態(tài)效應(yīng) (圖4)。

3 討論

3.1 生物炭對土壤微生物量的影響

研究結(jié)果表明，添加生物炭對土壤微生物量C、N有促進作用，其原因有以下兩點：1) 生物炭對土壤理化特性的改善[28-30]間接影響了土壤微生物的生長環(huán)境，提高了土壤微生物量C、N的含量。2) 添加生物炭增加了冬小麥根系總根長和總表面積[25]，其還田部分為土壤微生物生長提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，增強了土壤微生物量C、N的含量。返青起身期天氣逐漸回暖，土壤微生物活動增強，但生物炭的添加延緩了土壤的增溫速度[30]，因此，返青起身期B20、B40、B60、B80處理的微生物量碳均低于B0；但添加生物炭后，土壤微生物量氮的峰值提前，均集中于返青起身期，這可能是由于土壤氮素主要集中在耕層，其中93.0%～97.0%以有機氮的形式存在[31]，此時土壤微生物因回溫緩慢活性下降導(dǎo)致礦化速度減慢，因此，返青起身期B20、B40、B60、B80處理的微生物量氮均高于B0處理。

表4 土壤微生物對不同碳源的利用率Table 4 Use efficiencies of different carbon sources by soil microbial community

表5 主要碳源與第一、第二主成分 (PC1和PC2) 的相關(guān)系數(shù) (r)Table 5 Correlation coefficient r of main carbon sources with the 1st and the 2nd principle components (PC1 and PC2)

圖 4 土壤微生物功能多樣性主成分分析Fig. 4 Principal component analysis (PCA) of functional diversity of soil microorganisms

由于種植冬小麥前施入了磷肥，土壤有效磷隨之增加，土壤微生物與作物根系并未形成競爭關(guān)系，更多的無機磷被同化結(jié)合到土壤微生物體內(nèi)[31]，因此，B0、B40、B60、B80處理的微生物量磷最高值出現(xiàn)在分蘗期；而B20處理的微生物量磷最高值出現(xiàn)在越冬期，可能是因為B20處理土溫適宜、代謝弱，土壤微生物能在較低能量供給下生存，從而固持了較多的土壤微生物量磷。

土壤微生物量碳氮比 (C/N) 可表征微生物群落的結(jié)構(gòu)特征[23]，前人研究結(jié)果表明，細(xì)菌的微生物量C/N的范圍為3～6，而真菌的范圍則在7～12[31-34]。當(dāng)添加量 ≥ 40 t/hm2時，土壤微生物量C/N大于7，表明添加生物炭后，試驗地土壤的微生物群落可能就由以細(xì)菌為主變?yōu)榱艘哉婢鸀橹鱗35,36]，因為真菌比細(xì)菌更容易降解生物炭中的頑固性碳，能更好地在生物炭的孔隙中生長以及利用額外的資源[37]。一般認(rèn)為在C/N高的土壤中真菌占優(yōu)勢，因為真菌比細(xì)菌對碳源的利用效率高，每單位生物量真菌比細(xì)菌需要的氮少[38-42]，這也可能是B0處理和B20、B40、B60、B80處理的土壤微生物碳源代謝模式或功能具有相似性的原因，對此還需要通過分子生物學(xué)的方法進一步驗證。

冬小麥整個生育期，土壤微生物量表現(xiàn)出明顯的季節(jié)波動，說明其受降水、溫度、濕度等季節(jié)性變化因素的影響[43]。當(dāng)生物炭添加量為20 t/hm2時，顯著增加了MBC的季節(jié)波動；當(dāng)生物炭添加量為40～60 t/hm2時，顯著增加了MBC/MBN的季節(jié)波動。這與張星等[7]和Chan等[11]的研究結(jié)果不同，原因有兩點：一是所種植作物種類、生物炭類型及添加量不同導(dǎo)致的；二是添加生物炭影響了土壤中碳、氮的分解，改變了土壤微生物的組成和數(shù)量，從而增加了土壤微生物量碳及碳氮比的季節(jié)波動。

3.2 生物炭對土壤微生物碳源代謝活性的影響

當(dāng)生物炭添加量大于40 t/hm2時，土壤微生物的整體代謝活性，土壤微生物對糖類、氨基酸類、多胺類碳源的利用率呈現(xiàn)降低的趨勢，原因有以下兩點：1) 從微生物量C、N、C/N的增長幅度來看，土壤微生物量碳的增長幅度明顯大于微生物量氮，C/N增大，氮素缺乏可能是限制土壤中微生物活性的主要原因；2) 添加生物炭導(dǎo)致土壤群落組成發(fā)生變化[44]，進而改變了土壤微生物利用碳源的種類。

土壤微生物群落酶鏈反應(yīng)速度和最終能達到的程度與群落內(nèi)能利用單一碳源微生物的數(shù)目和種類相關(guān)[45]。本研究中，添加生物炭能夠降低土壤微生物的豐富度指數(shù)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)，增加均勻度指數(shù)，這與前面討論的外源生物炭的添加顯著提高了土壤的C/N，有利于真菌菌落的生長相吻合，與武愛蓮等[9]的試驗結(jié)果一致，說明添加生物炭可以導(dǎo)致土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)趨于簡單，從而降低土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，且生物炭在環(huán)境介質(zhì)中的自然衰減過程可長達世紀(jì)之久[46]，因此，實際應(yīng)用中要嚴(yán)格控制生物炭的添加量，避免對土壤產(chǎn)生不良影響。

相關(guān)分析結(jié)果 (表6)表明，MBN與POC、NO3--N呈顯著負(fù)相關(guān) (P＜ 0.05)，與WSOC呈極顯著負(fù)相關(guān)(P＜ 0.01)，MBC、MBP與有機碳及其易變組分、土壤速效養(yǎng)分之間并無顯著相關(guān)關(guān)系；AWCD (168 h)與AOC呈顯著負(fù)相關(guān) (P＜ 0.05)，與NO3--N呈極顯著負(fù)相關(guān) (P＜ 0.01)，而與 SOC、POC、WSOC、AP之間并無顯著相關(guān)關(guān)系。說明土壤微生物量、土壤微生物碳源代謝活性受土壤有機碳及其易變組分、土壤速效養(yǎng)分的綜合影響。

表6 土壤微生物量、微生物碳源代謝活性及化學(xué)性質(zhì)之間的相關(guān)性Table 6 Correlation among soil microbial biomass, microbial carbon metabolic activities and chemical properties

注（Note）：MBC—微生物量碳 Microbial biomass carbon；MBN—微生物量氮 Microbial biomass nitrogen；MBP—微生物量磷Microbial biomass phosphorus；SOC—有機碳 Soil organic carbon；POC—顆粒有機碳 Particulate organic carbon；AOC—易氧化有機碳 Active organic carbon；WSOC—水溶性有機碳 Water-soluble organic carbon；AP—速效磷 Available phosphorus；AWCD (168 h) —不同生育期 168 h土壤微生物 AWCD 的平均值 Average values of AWCD for soil microorganisms in different growth periods within 168 h；*—P＜ 0.05；**—P＜0.01.

4 結(jié)論

生物炭添加4～5年后，在第7季作物冬小麥生育期內(nèi)，生物炭不同添加量對土壤微生物量及微生物功能多樣性的影響依然有顯著的差異。當(dāng)生物炭添加量為40 t/hm2時，不僅可以顯著提高土壤微生物量碳和C/N，顯著降低土壤微生物量磷的季節(jié)波動，且能維持土壤微生物功能多樣性不顯著降低?？梢姡?0 t/hm2是供試土保持土壤穩(wěn)定性效果最佳的添加量，鑒于Biolog-ECO檢測法僅能檢測可培養(yǎng)的微生物，不能全面反映土壤微生物的多樣性，仍需要對其內(nèi)在的作用機制進行長期、深入的研究。