王雅清,倪皓潔,李華韜,潘 童,楊仁迪,傅玲琳,王彥波

(浙江工商大學食品與生物工程學院,浙江食品質量安全工程研究院,浙江杭州 310018)

食物過敏已成為全球共同關注的焦點問題,它能引起急性或慢性疾病,危害人類健康。研究顯示,成人的食物過敏率約為5%,而兒童的食物過敏率接近于8%,并且數(shù)據(jù)表明,發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)均呈上升趨勢[1]。目前,國內外開發(fā)了多種食物過敏原檢測技術,常見的有酶聯(lián)免疫吸附技術、免疫印跡技術、質譜技術、生物傳感器技術等,這些檢測技術對于食物過敏的預防和控制具有重要的現(xiàn)實意義,取得了顯著的應用效果。鑒于此,本文結合國內外食物過敏原檢測技術研究現(xiàn)狀,分別從蛋白質與核酸兩個角度闡述食物過敏原檢測技術優(yōu)缺點,旨在為食物過敏引起的食品安全提供技術依托,最終保障消費者的健康。

1 基于蛋白質的食物過敏原檢測技術

1.1 免疫檢測技術

研究表明,食物過敏原在食物中含量極少,多以蛋白質為主。免疫檢測技術是目前檢測食物中過敏原蛋白的重要手段(表1),其工作原理基于抗原抗體發(fā)生的特異性結合,其中包括免疫吸附技術、免疫印跡技術、生物傳感器技術等。

表1 近三年食物過敏原免疫學檢測技術相關研究概述Table 1 Summary of studies on food allergen detection by immunology in recent three years

1.1.1 免疫吸附技術 在食物過敏原檢測方面,酶聯(lián)免疫吸附技術(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)應用最為廣泛。該法是基于酶標記抗體與抗原或特異性蛋白結合,并通過顯色反應程度進行定性定量檢測。實踐證明ELISA技術操作簡便,試劑方便易得,標準化自動化程度高,目前ELISA試劑盒也已成為一種商業(yè)化的產(chǎn)品。

常用的ELISA技術主要有競爭ELISA技術和夾心ELISA技術兩種,均具有特異性高、敏感性強、實用性強等優(yōu)點。Segura-Gil等[2]建立了間接競爭ELISA和夾心ELISA方法用于檢測加工食品中的大豆過敏原,檢測限分別為0.19、0.06 μg/g,夾心ELISA方法靈敏度優(yōu)于競爭ELISA方法。此外,夾心ELISA可檢測添加0.05%大豆飲料的UHT牛奶樣品和添加0.005%大豆種子的餅干中的大豆過敏原,回收率為87.2%～119.3%,變異系數(shù)低于7.2%,表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性。研究發(fā)現(xiàn),ELISA檢測的靈敏度與選用抗體的性質有關,選用親和力高的單克隆抗體有助于提高檢測靈敏度。Kiyota等[3]開發(fā)了一種基于單克隆抗體的ELISA檢測橙子及其加工食品中的主要過敏原Cit s 2的方法,定量范圍為2.5～40.0 ng/mL,變異系數(shù)低于10%,回收率為107%～132%,表明該方法具有高靈敏性和高重現(xiàn)性。Jeong等[4]利用基于重組Fag e 3產(chǎn)生的單克隆抗體建立雙位點ELISA法,定量檢測蕎麥提取物中的過敏原天然Fag e 3,實驗表明該單克隆抗體對天然Fag e 3具有良好的親和力,檢測限為0.8 μg/g。

在傳統(tǒng)ELISA基礎上還發(fā)展出了熒光酶聯(lián)免疫分析技術(Fluorometric enzyme immunoassay,FEIA)。基于熒光酶聯(lián)免疫分析原理建立的ImmunoCAP?系統(tǒng)已獲得國際臨床實驗室標準委員會的確認,被公認是體外診斷過敏性疾病的標準[5],它能準確量化特異性IgE。周艷君等[6]采用ImmunoCAP系統(tǒng)檢測蕎麥sIgE水平,結合免疫印跡結果推測蕎麥過敏原的重要致敏蛋白,為研究蕎麥致敏蛋白組分奠定基礎。

除具備操作簡單易標準化、特異性高、靈敏度高等優(yōu)點外,ELISA技術仍具有一定的局限性。部分商業(yè)化的ELISA試劑盒難以準確檢測痕量蛋白[7]。另外,受食物基質、實驗操作、交叉反應等因素影響易出現(xiàn)假陽性結果。目前國內外關于ELISA技術檢測食物中多種過敏原的文獻較少,該技術仍主要用于檢測食物中單一過敏原組分。

1.1.2 免疫印跡技術 免疫印跡技術(Immunoblotting test,IBT),又稱為蛋白質印跡技術(Western blotting),綜合了高分辨率凝膠電泳與固相免疫分析,分析容量大、敏感度高、特異性強,但分析時間較長。該法是先利用凝膠電泳將樣品中抗原蛋白分離并轉移固定化基質膜上,再通過放射物質或者酶標記的抗體對膜進行檢測和分析。

免疫印跡技術廣泛應用于食物過敏原的鑒定與半定量分析。Babu等[8]利用聚丙烯凝膠電泳將茄子果皮濃縮物中的蛋白分離,通過免疫印跡法鑒定茄子中的多種過敏原,并首次將植物多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)鑒定為茄子中重要的過敏原。Satoh等[9]利用米糠過敏患者的血漿進行免疫印跡分析,研究了水稻谷粒中水稻過敏原的分布,并鑒定米糠過敏的潛在致病過敏原是52 kDa的球蛋白,為加強水稻產(chǎn)品中過敏原的控制,提高過敏癥診斷提供依據(jù)。近年來,雙向免疫印跡法與質譜聯(lián)用的組合已經(jīng)成為鑒定各種食物中潛在過敏原的有力工具。Lu等[10]對四名大豆過敏患者的血清和六名大豆致敏患者的血漿進行雙向免疫印跡分析,結合四極桿-飛行時間串聯(lián)質譜(QTOF-MS/MS)分析結果鑒定大豆主要的過敏原是β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白。De Silva等[11]用25名蛋白過敏患者的血清進行免疫印跡分析,證實大多數(shù)蛋白過敏患者具有針對蛋黃蛋白的特異性IgE,結合質譜提高了檢測靈敏度和準確性,結果顯示,VTG-1、VTG-2和Apo B的成熟蛋白片段具有顯著的IgE結合能力,證實了Gal d 6(YGP42)是蛋黃的重要過敏原。

1.1.3 生物傳感器技術 生物傳感器技術是近幾年研究的熱點,具有檢測快速性、高靈敏度、微型化、低成本等優(yōu)點[12]。檢測食物過敏原最常用的是免疫傳感器,它將分子識別元件與樣品發(fā)生特異性反應產(chǎn)生的物理、化學信號轉化為可以檢測的光、電信號。根據(jù)測定原理可分為表面等離子共振(Surface plasmon resonance,SPR)傳感器、場效應(Field effect transistor,FET)生物傳感器、電化學免疫傳感器等。

近幾年,SPR傳感器因其優(yōu)越的檢測性能成為目前的一個研究熱點,并已成功應用于食物過敏原檢測領域。例如Ashley等[13]開發(fā)了一種基于免疫分析的SPR傳感器,可直接檢測食品制造商的原位清洗系統(tǒng)(Clean in place,CIP)最終沖洗樣品中牛奶過敏原,檢測限為0.578 μg/g,靈敏度可達亞ppm級。該方法簡單、無需標記,檢測限低于市售的ELISA試劑盒(檢測限為2.5 μg/g)。具有最佳澄清性能的蛋制品可作為釀酒加工助劑,用于澄清或精制葡萄酒,但任何殘留在葡萄酒中的蛋清蛋白都可能對過敏的消費者構成風險。Pilolli等[14]先結合聚乙烯基聚吡咯烷酮純化和尺寸排阻色譜對樣品進行預處理,優(yōu)化后建立了一種基于SPR傳感器的快速檢測方法來量化葡萄酒中的雞蛋過敏原,檢測限低至0.2 μg/g,實驗證明生物傳感器是監(jiān)測葡萄酒殘留污染水平的有效工具。

研究影響傳感器性能的因素也尤為重要,Hideshima等[15]開發(fā)了一種FET傳感器檢測蕎麥過敏原,并通過引入陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)來實現(xiàn)FET傳感器檢測信號放大。利用SDS與樣品偶聯(lián),檢測效果提高,成功檢測出蕎麥中含量很低的過敏原蛋白,與靶蛋白偶聯(lián)的最佳SDS濃度為1%(w/w)。納米材料因其特異性、靈敏性、快速性等優(yōu)點逐漸被引入生物傳感器,可提高裝置檢測性能。Jiang等[16]成功將異硫氰酸熒光素融合在二氧化硅殼包覆的Fe3O4納米粒子的二氧化硅層內,開發(fā)了一種基于陽離子熒光納米磁珠的新型電化學大鼠嗜堿性白血病細胞傳感器,可用于檢測蝦過敏原蛋白和魚過敏原蛋白,檢測限分別為0.03 μg/g和0.16 ng/g。Alves等[17]采用基于金納米顆粒改性的絲網(wǎng)印刷碳電極的雙單克隆抗體夾心型電化學免疫傳感器檢測花生過敏原,檢測限低至3.8 ng/g。

目前,生物傳感器因其快速性、微型化等優(yōu)點逐漸應用于過敏原檢測,并具有較好的檢測靈敏度。由于對樣品預處理的高要求,一定程度上限制了生物傳感器簡便的應用與商業(yè)化的可能性[12]。研制新型的納米材料并將其應用于生物傳感器,實現(xiàn)樣品的快速優(yōu)化處理,得到更好的性能,是目前研究的趨勢。

1.2 質譜檢測技術

質譜技術(Mass spectrometry,MS)同樣發(fā)展迅速,已成為檢測食物過敏原的新趨勢(表2),應用時多與高效分離純化技術如液相色譜(Liquid chromatography,LC)、毛細管電泳(Capillary electrophoresis,CE)等相結合,具備了靈敏度高、準確性好、分離與鑒定同時進行等優(yōu)點。

表2 近三年食物過敏原質譜檢測技術相關研究概述Table 2 Summary of studies on food allergen detection by mass spectrometry in recent three years

液相色譜-質譜聯(lián)用法在鑒定過敏原蛋白及其亞型方面具有重要意義,Yu等[19]結合模擬胃液(Simulated gastric fluid,SGF)消解,采用基于質譜的蛋白質組學技術和序列同源性分析,高效鑒定了大黃魚中兩種潛在的過敏原——β-烯醇酸和原肌球蛋白α-1鏈,與已知的來自其他物種的蛋白質過敏原具有高度的序列相似性。該方法為高通量篩選潛在的過敏原提供了一個有效方案,在魚類過敏原控制方面具有廣闊的應用前景。Chen等[20]采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質譜(UPLC-QTOF-MS)法快速檢測復合食品中的蝦過敏原蛋白-原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)和精氨酸激酶(Arginine kinase,AK),檢測限分別為8、5 g/kg。在分析基于UniProt數(shù)據(jù)庫的肽質量指紋圖譜的基礎上,篩選出了兩個特異性熱穩(wěn)定肽作為標記肽,分別為TM的AsNaEGEVAALNR和AK的VSSTLSSLeLelk。

質譜法在復雜食品中過敏原的識別方面受到越來越多的關注,能同時對多種過敏原蛋白進行高通量的檢測,彌補了ELISA技術的不足。堅果和花生是常見的過敏原,并且堅果類過敏現(xiàn)象隨兒童年齡增長而消失的可能性較小,Sealey-Voyksner等[21]利用液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質譜(LC-QTOF-MS/MS)識別了堅果的特異性肽組,建立可在一次分析中篩選和定量檢測11種堅果過敏原和花生的方法,靈敏度可達到亞ppm級,特異性強。該研究的關鍵點在于找到合適的標記肽。質譜法對樣品要求較高,處理費時,針對這一問題,Pilolli等[22]對樣品采用基于超聲波輔助溶劑萃取和快速尺寸排阻色譜的兩步處理法,結合固相萃取(Solid-phase extraction,SPE)與反相液相串聯(lián)質譜(LC-MS/MS),建立了一種快速、靈敏的質譜選擇反應監(jiān)測方法(LC-SRM),有效簡化了分析工作流程。該方法可對人工污染的無過敏原餅干基質中的五種過敏原(雞蛋、牛奶、大豆、榛子和花生)同時進行分析,所分析的過敏原均能得到較低的檢測限。

質譜技術在食物過敏原蛋白組學分析中發(fā)揮越來越重要的作用,且在檢測復雜基質及加工食品中的多種過敏原具有優(yōu)越性。選擇合適的樣品預處理方式和穩(wěn)定的特征肽段,有助于提高質譜檢測的靈敏度與準確性,可為改善食物過敏現(xiàn)狀提供一定的技術支持。

2 基于核酸的食物過敏原檢測技術

基于蛋白質的檢測方法雖然直接,但是易受食品基質的影響,造成檢測誤差。基于核酸的檢測方法是間接檢測分析,檢測過敏原蛋白或其他基因的DNA,目前主要用于一些含量很低或者成分復雜食品中過敏原的檢測(表3)。

表3 近三年基于核酸的食物過敏原檢測相關研究概述Table 3 Summary of studies on food allergen detection based on nucleic acid in recent three years

2.1 聚合酶鏈式反應技術

聚合酶鏈式反應技術(Polymerase chain reation,PCR)是一種在體外模擬體內DNA復制的核酸擴增技術,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。由于其簡便易行、靈敏度高等特點,已逐漸成為一種標準化的檢測方法。Eischeid等[24]采用實時定量聚合酶鏈反應(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技術檢測復雜食物基質中甲殼類貝類過敏原。Fernandes等[25]做了類似研究,利用同種技術檢測作為潛在過敏原的蝦甲殼類動物,檢測限為1 mg/kg。兩者均證實了qRT-PCR可以準確檢測和量化食品中的甲殼類過敏原。前者試驗對螃蟹具有特異性,成功地檢測出摻入復雜食品基質中的幾種螃蟹。后者試驗針對甲殼類動物設計了靶向16S rRNA基因的通用引物,可以準確檢測和量化食品中的蝦。傳統(tǒng)的PCR技術以定性檢測為主,而qRT-PCR技術實現(xiàn)了從定性到定量檢測的飛躍。Pierboni等[26]首次報道了數(shù)字聚合酶鏈反應(Digital PCR,dPCR)用于檢測食品中過敏原的評估,提出dPCR是一種適用于檢測食品中花生和大豆過敏原的新技術,除了具有Real-time PCR的優(yōu)勢外,還能夠識別非特異性靶標,如Gly m 5-MGB,可以降低對抑制劑的敏感性,節(jié)省時間和成本。

2.2 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一門新興的基因擴增技術,由Notomi等人在2000年首次報道[27]。其采用特異識別靶序列上6個位點的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶,在等溫條件下進行核酸擴增[28]。因其操作簡單、產(chǎn)物易檢測,反應時間短,故LAMP在食品微生物檢測、轉基因成分檢測、過敏原成分檢測等方面被廣泛應用。Garrido-Maestu等[29]在比較qPCR和實時環(huán)介導等溫擴增(Real-time loop-mediated isothermal amplification,qLAMP)檢測面筋效果的研究中,發(fā)現(xiàn)兩種方法都適用于谷蛋白谷物,但qPCR更敏感。這是第一項描述基于qLAMP檢測谷蛋白的特定方法的研究,盡管qLAMP方法不適合種子,但仍為其余樣品提供了最快的結果。Sheu等[30]開發(fā)了一種用于檢測花生的高特異性LAMP引物,其檢測限比PCR更敏感,證實LAMP技術可以鑒定生花生和含有花生的商業(yè)食品。

Kim等[31]開發(fā)了直接雙重環(huán)介導等溫擴增(Direct Duplex real-time loop-mediated isothermal amplification)測定法用于同時檢測牛奶和山羊奶,在30 min內可以檢測到在山羊奶中高達2%的牛奶含量,亦可在同一時間范圍內檢測到在牛奶中高達2%的山牛奶含量。雖然雙重LAMP檢測的靈敏度比單重LAMP檢測低10倍,但是當比較10 pg的奶牛和1 pg的山羊時,其靈敏度顯示更高或相同。因此可以確定該技術的靈敏度足以在單一反應中同時檢測兩種目標物質。該測定無需DNA提取,適合于快速現(xiàn)場檢測,可同時監(jiān)測商業(yè)牛奶和酸奶產(chǎn)品中牛和山羊DNA的存在,防止牛奶和牛奶產(chǎn)品中的欺詐性物種標記。

與傳統(tǒng)變溫核酸擴增技術相比,LAMP技術無需昂貴的實驗室設備,如熱循環(huán)儀,其反應結果可直接通過肉眼觀察是否具有白色焦磷酸鎂沉淀從而進行判斷,或通過添加羥基酚藍、鈣黃綠素等熒光染料實現(xiàn)顯色觀察[32],適于快速檢測和現(xiàn)場檢測,在食品檢測領域具有廣闊的應用前景。

3 食物過敏原檢測技術優(yōu)缺點對比

食物過敏原的檢測方法雖多,但仍然有不同的特征。酶聯(lián)免疫吸附技術運用較廣泛,其特異性強和靈敏度高尤為顯著,但容易因發(fā)生交叉反應而出現(xiàn)假陽性結果。免疫印跡技術因其操作快速簡單且高效而廣泛使用,但分析時間很長且易受影響。生物傳感器技術因微型化、高靈敏度、檢測快速的特點而受到關注且大量研究,逐漸應用于實際檢測,但儀器制備的高要求使此方法還未被廣泛應用。質譜技術兼具高靈敏度和準確度,可檢測多重過敏原但樣品的處理對結果影響很大。聚合酶鏈式反應技術不僅靈敏度高、特異性強,同時適合定量分析復雜食品過敏原,但是該方法對操作者的要求很高,對于同一批的樣品提取的核酸會經(jīng)常出現(xiàn)假陽性和污染現(xiàn)象。環(huán)介導等溫擴增技術較PCR方法靈敏度高了2～5個數(shù)量級且操作簡單,但在引物設計上要求很高,樣品易形成氣溶膠污染。

4 結論與展望

近年來,食物過敏現(xiàn)象在全球范圍內廣泛出現(xiàn),備受各國政府的高度關注。許多國家致力于分析食物過敏原蛋白并完善標志食物過敏原制度,迫切需要不斷發(fā)展快速、高效的食物過敏原檢測技術。根據(jù)表4可知,每種檢測方法兼具其優(yōu)勢與局限性。目前,ELISA是食品工業(yè)中過敏原檢測和定量的最常用方法之一,檢測方便快捷。部分商業(yè)化的ELISA試劑盒被廣泛使用,并被認為是檢測許多常見食物過敏原的可靠方法,但仍存在不能準確檢測痕量蛋白、易發(fā)生交叉反應得到假陽性結果的局限性。結合新技術開發(fā)高特異性、高精密度、高準確度的試劑盒是目前的研究趨勢。與ELISA相比,PCR技術可以通過優(yōu)化引物等來克服交叉反應的影響。然而傳統(tǒng)的PCR技術是直接測定過敏原蛋白基因,無法證實食物真正的過敏性,容易出現(xiàn)假陽性結果,且操作過程較為繁瑣,時間較長,對于儀器設備具有較高的要求,不能夠在臨床快速檢測中使用。目前,我國已經(jīng)具有基于環(huán)介導等溫擴增技術的食品檢測標準。該技術具有較強的特異性和較高的靈敏度,不需要昂貴儀器,能夠實現(xiàn)單一樣品多種靶基因的同時檢測。LAMP技術還可以通過多種LAMP設計、與芯片技術結合等手段進一步完善及優(yōu)化,從而實現(xiàn)靈敏、特異、快速及高通量的目的,可被廣泛應用到衛(wèi)生防疫、食品安全檢測等領域,具有廣闊的前景。質譜技術因能檢測多重過敏原和能與其他高性能技術聯(lián)合的特性受到食品工業(yè)的青睞。但質譜技術存在操作耗時、儀器昂貴、成本高等缺點,使其無法滿足市場商業(yè)化的需求。生物傳感器技術被認為是傳統(tǒng)免疫測定方法的有效的替代方法,可實現(xiàn)同時檢測多種食物過敏原,檢測快速、靈敏度高、成本低、可微型化,具有廣闊的應用前景。由于對樣品的高要求,樣品預處理相對復雜,一定程度上限制生物傳感器商業(yè)流通化。結合新型納米技術等,實現(xiàn)樣本處理的快速簡便化,建立可商業(yè)化的生物傳感器,使真正發(fā)揮生物傳感器技術的潛在優(yōu)勢。

表4 食物過敏原檢測技術比較[1,35]Table 4 Comparison of food allergen detection technology[1,35]

總之,隨著科學技術的不斷進步,多種學科交叉的檢測技術也不斷涌現(xiàn)。質譜、生物傳感器等技術的應用,為檢測深加工食品中痕量過敏原或復雜過敏原做出了貢獻。開發(fā)高效高通量、快速經(jīng)濟的多種食物過敏原檢測技術是目前的大方向。新興檢測技術不斷出現(xiàn),傳統(tǒng)檢測技術突破創(chuàng)新,將多種檢測技術聯(lián)合優(yōu)化應用于食物過敏原檢測,推動我國食品安全的發(fā)展,進而保障人民的健康生活。