趙永偉,崔 韜,牛 玉,何進(jìn)田,王 超,張婧菲,張莉莉,鐘 翔,肖 瀟,王 恬

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation,IUGR)通常指哺乳動(dòng)物的胚胎或其器官在母體子宮內(nèi)受到各種因素的影響,如營養(yǎng)不良、胎盤功能障礙、外界應(yīng)激等,從而導(dǎo)致生長發(fā)育緩慢。IUGR具體表現(xiàn)為生長沒有達(dá)到遺傳學(xué)水平、初生重低、組織器官發(fā)育不完善,導(dǎo)致新生動(dòng)物發(fā)病率和死亡率高等[1-2]。大量的研究表明,IUGR會(huì)破壞機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡,對機(jī)體或器官造成一定的損傷[3]。同時(shí)IUGR動(dòng)物的脂肪沉積增加,會(huì)造成肌肉發(fā)生氧化損傷,進(jìn)而影響動(dòng)物肉品質(zhì)。Liu等[4]研究發(fā)現(xiàn),與正常豬相比,IUGR豬在宰后45 min時(shí)背最長肌的pH顯著下降,并且亮度值顯著升高。在宰后24 h,IUGR豬肌肉的pH無明顯變化,但亮度值與正常豬相比顯著升高[5]。這些研究初步表明,IUGR會(huì)導(dǎo)致瘦肉率降低、肉品質(zhì)下降,對畜牧生產(chǎn)造成了不利的影響[6]。并且,在屠宰上市過程中,肌肉糖原大量分解產(chǎn)生的乳酸使其pH降低,引起IUGR動(dòng)物的肉品質(zhì)問題[7],而這對食品安全和人類健康是十分不利的。因此,尋求有效的營養(yǎng)調(diào)控手段來緩解IUGR引起的肌肉氧化還原失衡和抑制糖原大量分解等問題,已成為提高食品質(zhì)量和安全的研究難點(diǎn)之一。

姜黃素作為天然抗氧化劑,具有安全、高效的特點(diǎn)。姜黃素作為一種從中藥姜黃中提取的酚性色素,常作為調(diào)味品使用。在20世紀(jì)70年代,姜黃素就被WHO、日本、美國等組織或國家列為準(zhǔn)許使用的食品添加劑之一。研究表明,姜黃素可促進(jìn)動(dòng)物生長、提高動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量、預(yù)防和控制疾病的發(fā)生。姜黃素能夠通過上調(diào)Nrf2因子的核轉(zhuǎn)位和蛋白質(zhì)表達(dá),并且下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB),甚至阻斷NF-κB信號通路,從而起到抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡的作用[8]。姜黃素的抗氧化功能還體現(xiàn)在其能通過清除體內(nèi)參與過氧化反應(yīng)的活性自由基,從而抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng),以及通過誘導(dǎo)抗氧化酶活化及還原性物質(zhì)的生成,起到抗氧化、減輕氧化應(yīng)激損傷的作用[9]。并且,姜黃素還具有降低肌肉中胴體糖酵解(glycolytic potential,GP)的功能[10]。

目前,有關(guān)姜黃素在IUGR動(dòng)物上的研究仍十分缺乏。因此,本研究通過母體孕期營養(yǎng)限制來構(gòu)建IUGR大鼠模型,初步觀察IUGR對肌肉組織中氧化-抗氧化平衡以及糖代謝的影響;并通過在IUGR鼠日糧中添加姜黃素,來探討姜黃素對IUGR鼠抗氧化以及糖代謝關(guān)鍵酶活性和關(guān)鍵基因表達(dá)的影響,為姜黃素作為一種食品添加劑奠定理論基礎(chǔ),同時(shí)為預(yù)防和治療人類IUGR提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SD母鼠 南京青龍山試驗(yàn)動(dòng)物研究所,為SPF級;AIN-93日糧 南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所;姜黃素 廣東科虎生物技術(shù)研究開發(fā)中心;羥自由基(OH-)、總抗氧化能力(total antioxidative capacity,T-AOC)、總超氧化物歧化酶(otal superoxide dismutase,T-SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)、糖原(glycogen,GLY)、乳酸(lactic acid,LC)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)和琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase,SDH) 南京建成生物工程研究所;Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTM定量試劑盒 日本TaKaRa生物科技股份有限公司。

Bio-Gen Series PRO 200勻漿機(jī) 美國PRO Scientific公司;5804R臺式高速冷凍離心機(jī) 德國eppendorf公司;HH-4數(shù)顯電子恒溫循環(huán)水浴鍋 常州國華電器有限公司;DW-25L262醫(yī)用低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司;QuantStudio? 5Real-Time PCR儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組 選擇體重接近、同期發(fā)情配種的SD母鼠為對象,在妊娠期第10 d,將妊娠母鼠隨機(jī)分為正常組和日糧限飼組,正常組進(jìn)行正常飼喂,日糧限飼組母鼠的采食量為同孕齡正常組母鼠單位體重采食量的50%[11]。正常組和日糧限飼組母鼠分娩分別得正常小鼠(normal birth weight,NBW)和宮內(nèi)發(fā)育遲緩小鼠(IUGR)[12],母鼠哺乳期間均自由采食。本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)成果表明,IUGR大鼠的后代比正常大鼠的后代出生小,正常為6.314±0.358 g,IUGR組為5.546±0.264 g,二者差異極顯著(p=0.005),造模成功[13]。仔鼠21 d時(shí)進(jìn)行斷奶分組,接著進(jìn)行為期1周的斷奶適應(yīng)期,6周齡時(shí)選擇體重接近的NBW小鼠隨機(jī)均分為NBW組和NC組,按相同方法將IUGR小鼠分為IUGR組和IC組,每組6只。NBW組和IUGR組均采食正常日糧,NC組和IC組飼喂姜黃素日糧(基礎(chǔ)日糧+400 mg/kg姜黃素),基礎(chǔ)日糧為AIN-93日糧[14],飼喂至12周齡。

1.2.2 飼養(yǎng)管理 所有試驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)衛(wèi)崗校區(qū)動(dòng)物房內(nèi),按照自由采食和飲水的模式飼養(yǎng)。每天對鼠房進(jìn)行清掃,將鼠房溫度控制在22±2 ℃,保持通風(fēng)。飼養(yǎng)管理嚴(yán)格執(zhí)行衛(wèi)生防疫制度。

1.2.3 樣品采集 試驗(yàn)結(jié)束時(shí),全部屠宰,先采用乙醚麻醉,再采用斷頸法處死試驗(yàn)大鼠。迅速取每只鼠同側(cè)腿部腓腸肌,立即置于液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱保存供后期指標(biāo)測定。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 肌肉組織抗氧化相關(guān)指標(biāo)測定 將肌肉組織按質(zhì)量比1∶9 (w/v)加入預(yù)冷的生理鹽水,冰水浴條件下勻漿破碎,3000 r/min離心10 min,取上清液分裝于-20 ℃冰箱中保存待測。勻漿上清中總蛋白含量采用BCA法測定,肌肉中OH-、T-AOC、T-SOD、CAT、GSH-Px、GSH和T-GSH采用試劑盒中的方法進(jìn)行測定。

1.3.2 肌肉組織中糖代謝相關(guān)指標(biāo)測定 取上述制備好的肌肉組織勻漿液,肌肉中GLY、LC、LDH、CK和SDH采用試劑盒中的方法進(jìn)行測定。糖酵解潛值(glycolytic potential,GP)計(jì)算公式:GP=2×糖原的含量(mg/g tissue)+乳酸的含量(mmol/g prot)。

1.3.3 肌肉組織中目的基因mRNA表達(dá)量測定 測定肌肉中核因子NF-E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)、GSH-Px、CAT、SOD1、腺苷一磷酸依賴的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinaseα1,AMPKα1)、糖原合成酶(glycogen synthase,GS)、M-型6磷酸果糖激酶(phosphofructokinase M,PFKM)的mRNA表達(dá)量的變化。取50 mg肌肉組織樣品加入1 mLTrizol,按照說明書的步驟進(jìn)行RNA提取。使用NanoDrop1000 測定所提取的RNA的純度和濃度,RNA的完整性通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。按照PrimeScriptTM說明書要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后,其產(chǎn)物cDNA于-20 ℃保存。使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。特異性引物見表1 。PCR程序?yàn)?95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 31 s,40 個(gè)循環(huán)。目的基因的相對表達(dá)含量以GAPDH為內(nèi)參,采用比較2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in quantitative real time PCR assays

1.3.4 姜黃素、IUGR對各指標(biāo)的影響 采用2×2雙因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),通過顯著性檢驗(yàn),探究主因素姜黃素、IUGR及兩者的交互作用對各項(xiàng)指標(biāo)的影響。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013初步處理后,采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)采用單因素方差分析Duncan氏法和雙因素方差分析中的Tukey法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。以p<0.05和p<0.01作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧添加姜黃素對IUGR大鼠肌肉抗氧化系統(tǒng)的影響

由表2可以看出,與NBW組相比,IUGR組大鼠肌肉中CAT活性、GSH-PX活性和T-GSH含量顯著降低(p<0.05)。日糧中添加姜黃素可顯著提高IUGR大鼠肌肉T-SOD和CAT活性(p<0.05),并且T-AOC水平具有一定的升高趨勢(p>0.05)。

表2 日糧添加姜黃素對IUGR大鼠肌肉抗氧化功能的影響Table 2 Effect of curcumin on the antioxidant function in the muscle of NBW and IUGR rats

妊娠期母體營養(yǎng)不足是引起IUGR的常見原因之一,進(jìn)而導(dǎo)致胎兒攝取營養(yǎng)不足和生長發(fā)育受阻[15]。受IUGR影響,機(jī)體內(nèi)會(huì)有大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生,由于IUGR會(huì)破壞機(jī)體內(nèi)的氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡,導(dǎo)致多余的ROS不能被及時(shí)清除,這使得ROS攻擊組織細(xì)胞造成氧化損傷[16]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),IUGR大鼠肌肉GSH-Px活性、CAT活性、T-GSH含量顯著下降(p<0.05),說明其抗氧化功能可能受到了一定的影響。CAT是重要的自由基清除酶,可以清除超氧陰離子自由基,其活性的高低反映了機(jī)體清除自由基的能力[17]。

GSH-Px是機(jī)體內(nèi)一種重要的過氧化物分解酶,負(fù)責(zé)清除有機(jī)氫過氧化物和過氧化氫[18]。何進(jìn)田等[19]研究發(fā)現(xiàn),IUGR會(huì)導(dǎo)致哺乳仔豬肝臟SOD與GSH-Px活力降低。另有研究也表明,IUGR導(dǎo)致了仔豬T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性顯著下降[20-21]。這些結(jié)果都與本試驗(yàn)相似。由此可見,IUGR能引起機(jī)體器官或組織抗氧化酶活力的下降。

研究表明,姜黃素能清除體內(nèi)參與過氧化反應(yīng)的活性自由基,抑制脂過氧化反應(yīng)[22]。在本試驗(yàn)中,姜黃素顯著提高了IUGR鼠肌肉的T-SOD和CAT的活性(p<0.05),并且T-AOC具有一定的升高趨勢。狄建斌等[9]試驗(yàn)也證實(shí),姜黃素的抗氧化功能體現(xiàn)在提高各種抗氧化酶的活性。這些結(jié)果初步表明,IUGR鼠肌肉的抗氧化能力會(huì)出現(xiàn)下降,而姜黃素對IUGR鼠肌肉的抗氧化能力有一定的提高作用,然而具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待研究。

2.2 日糧添加姜黃素對IUGR大鼠肌肉糖原、乳酸含量及糖酵解潛值的影響

從表3中可以看出,與NBW組相比,IUGR組大鼠肌肉中乳酸含量和糖酵解潛值顯著升高(p<0.05);日糧中添加姜黃素可使糖原含量和糖酵解潛值顯著升高(p<0.05)。另外IUGR和姜黃素對大鼠肌肉中乳酸含量的影響存在極顯著交互作用(p<0.01)。

表3 日糧添加姜黃素對IUGR大鼠肌肉糖原、乳酸含量及糖酵解潛值的影響Table 3 Effect of curcumin on contents of glycogen,lactic acid(LC)and glycolytic potential(GP)in the muscle of NBW and IUGR rats

糖酵解是糖代謝中一條重要的途徑。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IUGR大鼠肌肉乳酸含量顯著升高(p<0.05)。這同Wadley等[24]的試驗(yàn)結(jié)果相似。過高的乳酸含量會(huì)影響IUGR鼠肌肉的健康。李博等[25]研究也發(fā)現(xiàn),IUGR豬背最長肌糖原含量顯著下降,乳酸含量顯著升高。動(dòng)物屠宰后,糖原發(fā)生酵解反應(yīng),產(chǎn)生乳酸,而乳酸會(huì)影響宰后肌肉pH[26]。因此,糖酵解潛值一定程度上與肉品質(zhì)的優(yōu)劣有著緊密的聯(lián)系。本試驗(yàn)中IUGR大鼠肌肉GP含量顯著升高(p<0.05),這和李博等[25]、Thorn等[27]研究一致。由此可見,IUGR大鼠肌肉糖原分解,使糖酵解潛值著提高,乳酸含量升高,這些可能是導(dǎo)致肌肉品質(zhì)下降的原因之一。在日糧中添加姜黃素后,糖原含量顯著升高(p<0.05)。姜黃素的分解產(chǎn)物香蘭醛、阿魏酸等,是具有β-二酮結(jié)構(gòu)的多酚化合物,能增強(qiáng)谷胱甘肽過氧化物酶活力[28]。而谷胱甘肽過氧化物酶活力增強(qiáng)能抑制糖分解過程中磷酸戊糖途徑的氧化階段反應(yīng),這可能是姜黃素降低糖原分解的原因之一。由此可見,姜黃素延緩了IUGR動(dòng)物肌糖原的分解,對促進(jìn)肌肉健康有一定的作用。

2.3 日糧添加姜黃素對IUGR大鼠肌肉糖代謝酶活性的影響

從表4可以看出,與NBW組相比,IUGR組大鼠肌肉中SDH、LDH和CK的酶活性變化不顯著;日糧中添加姜黃素可使IUGR組大鼠SDH酶活性顯著升高(p<0.05),使LDH酶活性顯著降低(p<0.05),對CK酶活性變化不顯著(p>0.05)。另外IUGR和姜黃素對大鼠肌肉中SDH和LDH酶活性的影響存在極顯著交互作用(p<0.01)。

表4 日糧添加姜黃素對IUGR大鼠肌肉糖代謝酶活性的影響Table 4 Effect of curcumin on contents of glucose metabolism enzymes activity in the muscle of NBW and IUGR rats

LDH是糖酵解中的關(guān)鍵限速酶,對糖原分解有重要作用。SDH是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一,其活性一般可作為評價(jià)三羧酸循環(huán)運(yùn)行程度的指標(biāo)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IUGR大鼠LDH和SDH酶活性沒有顯著改變。但在添加姜黃素后,LDH活性顯著降低(p<0.05),同時(shí)SDH酶活性顯著提高(p<0.05)。因此,姜黃素對糖酵解速率的降低作用可能與其降低LDH活性有關(guān)。

三羧酸循環(huán)是糖有氧代謝的核心途徑,SDH活性的提高說明了姜黃素可能加強(qiáng)了三羧酸循環(huán),從而減少了糖原的分解[29]。由此可見,姜黃素可能是通過升高SDH活性和降低LDH活性,來緩解肌肉中糖原的分解,改善由IUGR帶來的不良影響。

2.4 日糧添加姜黃素對IUGR大鼠肌肉抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響

從圖1中可以看出,與正常大鼠相比,IUGR使大鼠肌肉Nrf2和SOD1表達(dá)量顯著降低(p<0.05),使GSH-PX和CAT表達(dá)量有降低趨勢。日糧中添加姜黃素能夠顯著提高IUGR組大鼠肌肉Nrf2和SOD1表達(dá)量(p<0.05),并使GSH-Px和CAT表達(dá)量有升高趨勢。并且,IUGR和姜黃素對SOD1表達(dá)量的影響存在顯著交互作用(p<0.05)。

圖1 日糧添加姜黃素對IUGR 大鼠肌肉抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.1 Effect of curcumin on mRNA expression of antioxidant in the muscle of NBW and IUGR rats

為了進(jìn)一步研究其相關(guān)機(jī)制,本試驗(yàn)對抗氧化相關(guān)基因mRNA表達(dá)量進(jìn)行了測定。Nrf2是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子,Nrf2激活后會(huì)與抗氧化反應(yīng)原件結(jié)合,從而啟動(dòng)抗氧化酶基因的表達(dá),促進(jìn)一系列抗氧化酶的合成[30]。本研究發(fā)現(xiàn),IUGR使肌肉Nrf2和SOD1 mRNA表達(dá)量顯著降低(p<0.05),同時(shí)GSH-PX和CAT mRNA表達(dá)量有降低的趨勢(p>0.05)。Yin等[31]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),氧化損傷會(huì)激活Nrf2信號途徑,引發(fā)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)以及抗氧化酶的釋放,如GSH、GSH-Px、SOD等。這些結(jié)果表明,IUGR鼠肌肉可能發(fā)生了氧化應(yīng)激,相似研究也在IUGR斷奶仔豬上得到了證實(shí)[32]。而在添加姜黃素之后,Nrf2和SOD1 mRNA表達(dá)量顯著升高(p<0.05),并使GSH-Px、CAT mRNA表達(dá)量有升高趨勢(p>0.05)。何惠君等[33]研究發(fā)現(xiàn),姜黃素具有增強(qiáng)Nrf2系統(tǒng)信號的功效,能通過促進(jìn)抗氧化酶SOD1和CAT基因的表達(dá),來緩解肝臟氧化損傷[34]。因此,本試驗(yàn)結(jié)果提示,姜黃素對IUGR肌肉的抗氧化能力提高可能是通過激活Nrf2-ARE信號通路、增強(qiáng)抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

2.5 日糧添加姜黃素對IUGR大鼠肌肉糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

從圖2中可以看出,與正常大鼠相比,IUGR使大鼠肌肉中AMPKα1表達(dá)量有升高的趨勢,且GS表達(dá)量有降低的趨勢;日糧中添加姜黃素使IUGR組大鼠肌肉AMPKα1和GS表達(dá)量顯著降低(p<0.05),同時(shí)IUGR和姜黃素對AMPKα1表達(dá)量的影響存在顯著交互作用(p<0.05)。

圖2 日糧添加姜黃素對IUGR 大鼠肌肉糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effect of curcumin on mRNA expression of glucose metabolism in the muscle of NBW and IUGR rats

為了進(jìn)一步研究糖酵解的相關(guān)機(jī)制,本試驗(yàn)對其關(guān)鍵酶的mRNA表達(dá)量進(jìn)行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),IUGR大鼠肌肉AMPKα1表達(dá)量有升高的趨勢,而GS表達(dá)量有降低的趨勢。在添加姜黃素后,AMPKα1表達(dá)量顯著降低(p<0.05)。只有當(dāng)機(jī)體處于缺氧、應(yīng)激以及能量消耗等狀態(tài)時(shí),AMPK才會(huì)被激活[35],而GS催化的反應(yīng)是糖原合成的限速反應(yīng)。李澤等[36]研究表明,宰后羊肉糖酵解速度可能受到AMPK活性大小的影響,肌肉的AMPK活性較大時(shí)糖酵解速度也較快,反之較慢。因此,姜黃素對IUGR肌肉糖酵解的緩解可能是通過抑制AMPK活性來實(shí)現(xiàn)的。

3 結(jié)論

IUGR顯著降低了(p<0.05)肌肉中GSH-PX、CAT活性,T-GSH的含量以及Nrf2、SOD1基因表達(dá)量,同時(shí)顯著升高了(p<0.05)肌肉中乳酸含量和糖酵解潛值。在日糧中添加400 mg/kg姜黃素后,上述指標(biāo)均能得到一定程度的改善,與正常組基本無差異。另外,IUGR和姜黃素對大鼠肌肉中SDH和LDH酶活性,AMPKα1和SOD1表達(dá)量以及乳酸含量存在顯著交互作用(p<0.05)。結(jié)果表明,姜黃素可能具有通過提高肌肉抗氧化能力、調(diào)節(jié)肌肉糖代謝來緩解氧化應(yīng)激的重要作用。