梁瓊 向旺 鄒佳 何玲 袁莉瑤 劉平安 張國(guó)民

〔摘要〕 目的 探究壯骨止痛膠囊含藥血清調(diào)控成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體（osterix， OSX）、骨橋蛋白（osteopontin， OPN）對(duì)去勢(shì)大鼠成骨細(xì)胞分化的機(jī)制。方法 50只3月齡雌性大鼠，隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、骨松寶組和壯骨止痛膠囊組，10只/組，除空白組及假手術(shù)組外，摘除雙側(cè)完整卵巢，然后各組分別予以相應(yīng)干預(yù)，獲取相應(yīng)血清;10只新生SD乳鼠提取原代成骨細(xì)胞，培養(yǎng)至第三代后添加上述分組相應(yīng)10%血清，銀染及堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）染色鑒定成骨細(xì)胞，免疫組化檢測(cè)OSX、OPN蛋白的表達(dá)。結(jié)果 各組中的成骨細(xì)胞銀染呈褐色、堿性磷酸酶染色呈藍(lán)紫色;免疫組化結(jié)果表明，骨松寶組、壯骨止痛膠囊組中細(xì)胞質(zhì)呈棕色;空白組和假手術(shù)組呈淺棕黃色;模型組幾乎不見(jiàn)棕黃色。與假手術(shù)組比，模型組OSX、OPN蛋白的表達(dá)率降低（P<0.05）;壯骨止痛方及骨松寶干預(yù)后OSX、OPN蛋白表達(dá)率較模型組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 壯骨止痛膠囊組含藥血清能促進(jìn)OSX、OPN蛋白分泌，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，發(fā)揮抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松作用。

〔關(guān)鍵詞〕 壯骨止痛膠囊;骨質(zhì)疏松癥;含藥血清;成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體;骨橋蛋白

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.03.006

Effect of Zhuanggu Zhitong Capsule on Osteoblast Differentiation in Ovariectomized Rats by Regulating Osterix and Osteopontin

LIANG Qiong1， XIANG Wang1， ZOU Jia1， HE Ling2， YUAN Liyao1， LIU Pingan1*， ZHANG Guomin1*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of University of South China， Hengyang， Hunan 421001， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of Zhuanggu Zhitong Capsule-containing serum on osteoblast differentiation in ovariectomized rats by regulating osterix （OSX） and osteopontin （OPN）. Methods Fifty three-month-old female rats were equally and randomly divided into blank group， sham-operation group， model group， Gusongbao group， and Zhuanggu Zhitong Capsule group. Both intact ovaries were taken for all rats except those in the blank group and the sham-operation group. And then each group was given the corresponding intervention to collect their serum. Ten neonatal Sprague-Dawley mice were used to isolate primary osteoblasts. When the primary osteoblasts were cultured to the third generation， the 10% serum from the above groups was added. Silver staining and alkaline phosphatase （ALP） staining were used to identify osteoblasts， and immunohistochemistry was used to determine the expression of OSX and OPN. Results The osteoblasts in each group were brown in silver staining assay and blue-violet in ALP staining assay. The immunohistochemical results showed that the cytoplasm was brown in the Gusongbao group and the Zhuanggu Zhitong Capsule group; the cytoplasm was light brownish yellow in the blank group and the sham-operation group; no brownish yellow was observed in the model group. Compared with the sham-operation group， the model group had significantly lower expression rates of OSX and OPN （P<0.05）. The Zhuanggu Zhitong Capsule group and the Gusongbao group had significantly higher expression rates of OSX and OPN than the model group （P<0.05）. Conclusion The Zhuanggu Zhitong Capsule-containing serum can promote the secretion of OSX and OPN to promote the proliferation and differentiation of osteoblasts， thus exerting anti-menopausal osteoporosis.

〔Keywords〕? Zhuanggu Zhitong Capsule; osteoporosis; serum drug containing; osterix; osteopontin

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis， POP）指由絕經(jīng)引起的骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP），亦稱Ⅰ型骨質(zhì)疏松癥[1]。POP是以單位體積內(nèi)骨量絕對(duì)減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化、骨密度降低及骨強(qiáng)度減弱為特征，以致骨脆性增高及骨折危險(xiǎn)性增加的一種全身代謝性骨病，嚴(yán)重威脅絕經(jīng)后婦女的身體健康和生活質(zhì)量[2]。POP主要發(fā)病原因?yàn)轶w內(nèi)雌激素水平的降低，用雌激素替代療法療效顯著，但長(zhǎng)期使用雌激素存在副反應(yīng)及停藥后反跳現(xiàn)象[3]。目前研究認(rèn)為Hedgehog信號(hào)通路可以通過(guò)上調(diào)下游靶基因成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體（osterix，OSX）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，進(jìn)而抗骨質(zhì)疏松癥[4]。本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的雌性大鼠去卵巢制備絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理模型，術(shù)后連續(xù)給藥13周，提取含藥血清100 mL。于新生SD乳鼠顱骨中提取原代成骨細(xì)胞，通過(guò)雌性大鼠去卵巢造模后制備含藥血清干預(yù)調(diào)控新生SD乳鼠成骨細(xì)胞增殖分化，結(jié)合成骨細(xì)胞一般形態(tài)學(xué)、免疫組化染色及OSX、OPN蛋白的表達(dá)率等指標(biāo)觀察檢測(cè)結(jié)果，初步探討壯骨止痛膠囊治療骨質(zhì)疏松癥的療效及可能機(jī)制。

1 材料

1.1? 動(dòng)物

3月齡雌性SPF級(jí)SD大鼠50只，體質(zhì)量（200±10）g;24 h內(nèi)新生SD乳鼠10只，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004;均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2? 藥物制備

壯骨止痛膠囊（購(gòu)自四川美大康藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：201709113）;骨松寶顆粒（購(gòu)自貴州富華藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：201711125）。藥物用蒸餾水溶解后灌胃，2 mL/次，1次/d，藥物于-20 ℃冷藏備用。

1.3? 試劑

1%戊巴比妥鈉;DMEM低糖培養(yǎng)液、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、抗青霉素抗體、抗鏈霉素抗體均由上海立菲生物科技公司提供，胎牛血清由浙江天杭生物科技有限公司提供;硝酸銀溶液由progema生物科技公司提供;堿性磷酸酶染色試劑盒、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、OSX、OPN一抗試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。

1.4? 儀器

RKI-100-BC0超凈工作臺(tái)（北京實(shí)驗(yàn)儀器廠）、2培養(yǎng)箱（日本池本理化工業(yè)株式會(huì)社）、OlympusCK40倒置相差顯微鏡（奧林巴斯有限公司）、JY3002電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、超低溫冰箱（美國(guó)REVCO公司）、LEICA DM LB2雙目顯微鏡（德國(guó)LEICA公司）、MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（北航公司）、Motic B5顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司）。

2 方法

2.1? 動(dòng)物分組及造模

50只3月齡SD雌性大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表方法隨機(jī)分為5組，分別為空白組、假手術(shù)組、模型組、骨松寶組、壯骨止痛膠囊組，每組10只，稱質(zhì)量并記錄。造模方法：用1%戊巴比妥鈉（0.4 mL/100 g）腹腔內(nèi)注射麻醉后，將模型組、骨松寶組、壯骨止痛膠囊組摘除大鼠雙側(cè)完整卵巢;假手術(shù)組僅切除卵巢周圍相應(yīng)體積的脂肪組織，空白組不做任何處理。

2.2? 含藥血清的制備

按人-大鼠體表面積比值換算成人臨床等效給藥劑量，壯骨止痛膠囊：給藥劑量為0.486 g/（kg·d），200 g的大鼠每只灌胃2 mL;骨松寶顆粒：給藥劑量1.35 g/（kg·d），200 g大鼠每只灌胃2 mL;其他組給予相同體積的生理鹽水;藥物劑量每周按體質(zhì)量校正1次。各組動(dòng)物造模術(shù)后開(kāi)始干預(yù)連續(xù)13周，1次/d，末次給藥1 h后，腹主動(dòng)脈取血2 mL/只;所取血液以3 000 r/min速度離心，取上層血清，56 ℃水浴滅活30 min，經(jīng)0.22 μm一次性濾膜抽濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3? 成骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

24 h內(nèi)新生SD乳鼠，放入75%的乙醇浸泡2 min，取其顱骨，刮除顱骨周圍的結(jié)締組織，用眼科剪將骨組織剪碎至1 mm×1 mm，0.25%胰酶37 ℃水浴30 min（中間振蕩1次），1 000 r/min速度離心10 min，將骨片移入0.1%Ⅱ型膠原酶中，37 ℃水浴60 min（中間振蕩1次）;再以1 000 r/min速度離心10 min，棄上清液，加入適量DMEM培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)瓶;于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2天換1次液，待細(xì)胞貼壁接近90%，用0.25%胰酶消化，從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1∶2轉(zhuǎn)移到另外2個(gè)培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，直至第3代[5]。

2.4? 含藥血清的添加

將培養(yǎng)至第三代的成骨細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶2 mL消化，以800 r/min速度離心10 min，棄上清液，加入適量DMEM培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液;用細(xì)胞計(jì)數(shù)板將其調(diào)整為5×105/mL的濃度，接種至24孔板培養(yǎng)，24 h細(xì)胞貼壁后換成10%的含藥血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，每組12孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后備用。

2.5? 細(xì)胞鑒定

2.5.1? 成骨細(xì)胞一般形態(tài)學(xué)觀察? 將“2.3”細(xì)胞培養(yǎng)瓶放于倒置顯微鏡鏡下觀察，確定成骨細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)方式，拍照并記錄[6]。

2.5.2? 銀染? 取“2.3”細(xì)胞培養(yǎng)瓶中細(xì)胞在1%硝酸銀溶液及紫外線照射下染色30 min，蒸餾水反復(fù)漂洗后用5%硫代硫酸鈉還原，再用1%中性紅復(fù)染;鏡下觀察成骨細(xì)胞是否有鈣化結(jié)節(jié)的形成[6]。

2.5.3? 堿性磷酸酶染色? 取第3代細(xì)胞，6×103/L細(xì)胞濃度接種于24孔板上，細(xì)胞貼壁后開(kāi)始試驗(yàn)，培養(yǎng)第7天棄培養(yǎng)液，按堿性磷酸酶試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行偶氮偶聯(lián)法對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行染色，測(cè)定其堿性磷酸酶活性。

2.6? 免疫組化法檢測(cè)OSX和OPN蛋白

將添加了含藥血清的成骨細(xì)胞按通用型SABC試劑盒說(shuō)明書操作，分別滴加OSX和OPN一抗抗體，37 ℃ 80 min，PBS沖洗3次，每次2 min;添加二抗，37 ℃ 20 min，PBS沖洗3次，每次2 min;滴加SABC，37 ℃ 20 min，PBS沖洗4次，每次5 min;添加DAB顯色劑，顯色后染成棕黃色為陽(yáng)性結(jié)果。200倍光鏡下用顯微攝像系統(tǒng)隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，通過(guò)圖像分析系統(tǒng)，選取陽(yáng)性面積來(lái)評(píng)估陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞面積占總細(xì)胞面積的百分比，最后取五個(gè)視野的平均值，即為OSX和OPN蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率。

2.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析袁實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“x±s”表示，各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，如方差齊，組間差異采用單因素方差分析;如方差不齊，用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 成骨細(xì)胞的鑒定

3.1.1? 成骨細(xì)胞的一般形態(tài)學(xué)觀察? 倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形、有突起，單核呈卵圓形。生長(zhǎng)狀態(tài)好的細(xì)胞，由于細(xì)胞間相互促進(jìn)作用，可呈鋪路石狀，形成不透光礦化結(jié)節(jié)。尚未傳代細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞從骨片爬出現(xiàn)象，而傳代細(xì)胞多為梭形，較透亮。見(jiàn)圖1。

3.1.2? 銀染? 鏡下見(jiàn)細(xì)胞聚集，大量鈣化結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)中央呈黑色，周邊呈褐色，周圍顏色逐漸變淡。見(jiàn)圖2。

3.1.3? 堿性磷酸酶染色? 堿性磷酸酶染色鏡下見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)染成藍(lán)色，細(xì)胞核染成綠色，細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)。見(jiàn)圖3。

3.2? 免疫組化

3.2.1? OSX蛋白表達(dá)? 成骨細(xì)胞中蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，即為細(xì)胞膜和胞漿被染成棕黃色。模型組較空白組和假手術(shù)組的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少，而壯骨止痛膠囊組和骨松寶組較模型組明顯增加，見(jiàn)圖4。

3.2.2? OPN蛋白表達(dá)? 成骨細(xì)胞中蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，即為細(xì)胞膜和胞漿被染成棕黃色，模型組較空白組和假手術(shù)組的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少，而壯骨止痛膠囊組和骨松寶組較模型組明顯增加，見(jiàn)圖5。

3.2.3? OSX、OPN蛋白表達(dá)率? 與空白組比較，假手術(shù)組大鼠血清OSX、OPN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組大鼠血清OSX、OPN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，骨松寶組和壯骨止痛膠囊組大鼠血清OSX、OPN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表1。

4 討論

骨質(zhì)疏松癥的字義是“多孔的骨頭”，是一種鈣質(zhì)由骨骼往血液凈移動(dòng)造成礦物質(zhì)的流失，骨質(zhì)量減少，骨骼內(nèi)孔隙增大，呈現(xiàn)中空疏松的現(xiàn)象。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥主要是由于體內(nèi)雌激素下降，成骨細(xì)胞上相應(yīng)雌激素受體減少，從而導(dǎo)致骨吸收明顯加快，骨礦物質(zhì)含量丟失的同時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)骨小梁的退行性病變，即骨小梁變細(xì)、穿孔或消失，骨小梁數(shù)目減少，骨體積下降[7]。OP是多因素介導(dǎo)的復(fù)雜疾病，其流行病學(xué)研究表明老年婦女骨質(zhì)疏松患病率相對(duì)較高，年齡、絕經(jīng)年齡及體質(zhì)量指數(shù)（body mass index， BMI）等是OP患病率的主要影響因素[8]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松主要見(jiàn)于絕經(jīng)后婦女，隨著我國(guó)人口老齡化的進(jìn)程，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的防治和治療顯得尤其重要。

研究表明[9]Hedgehog信號(hào)通路參與了間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖分化、軟骨細(xì)胞形成、成骨細(xì)胞形成及軟骨骨化等一系列過(guò)程，此通路涉及RUNT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、OSX、OPN、Smads等轉(zhuǎn)錄因子;此外，Hedgehog通路可以通過(guò)上調(diào)Runx2來(lái)上調(diào)OSX、OPN的表達(dá)[10]。Runx2屬于Runt結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族，是骨發(fā)育過(guò)程中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化和成骨細(xì)胞成熟的重要轉(zhuǎn)錄和調(diào)控因子，Runx2過(guò)表達(dá)在成骨早起能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，但在成骨晚期可能抑制成骨細(xì)胞的分化。在動(dòng)脈粥樣硬化的形成過(guò)程中，可能與血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)Runx2的增加，使血管內(nèi)皮細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞從而導(dǎo)致血管的鈣化有關(guān)[11]。OSX是一種具有鋅指基序結(jié)構(gòu)域的可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，且為成骨前體細(xì)胞進(jìn)一步分化為成熟的成骨細(xì)胞的作用靶點(diǎn)。OSX過(guò)表達(dá)后能增強(qiáng)ALP活性，提高成骨基因;若OSX表達(dá)缺失，細(xì)胞則向軟骨細(xì)胞分化。另一方面，OSX位于Runx2的下游，避免了Runx2抑制成骨細(xì)胞的晚期分化的問(wèn)題[12]。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎時(shí)期骨骺生長(zhǎng)板中的成骨細(xì)胞存在OPN的表達(dá)[13]。成骨細(xì)胞可以分泌OPN，在骨基質(zhì)的礦化過(guò)程中有重要作用。OPN分子中有富含天冬氨酸的區(qū)域，通過(guò)這區(qū)域OPN可以與組織中的輕磷灰石結(jié)合而發(fā)揮作用[14]，組建骨礦質(zhì)，在骨骼內(nèi)含量豐富并且參與骨折愈合過(guò)程。因此通過(guò)上調(diào)OSX、OPN蛋白的表達(dá)，對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化、軟骨細(xì)胞成熟、骨基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生以及骨發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用，對(duì)防治骨質(zhì)疏松癥意義重大。

壯骨止痛方是湖南省中醫(yī)藥大學(xué)莫新民教授經(jīng)驗(yàn)方，已獲得國(guó)家新藥證書（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20050125），此方是在古方補(bǔ)骨脂丸的基礎(chǔ)上結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗(yàn)研制而成，由補(bǔ)骨脂、淫羊藿、枸杞、骨碎補(bǔ)、丹參等組成，具有補(bǔ)益肝腎、壯骨止痛之功，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用，已證實(shí)其對(duì)骨質(zhì)疏松癥有良好的療效[15]，但具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)雌性大鼠去卵巢造模后制備含藥血清干預(yù)調(diào)控新生SD乳鼠成骨細(xì)胞增殖分化，對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)后通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞銀染、堿性磷酸酶染色，確定了培養(yǎng)的細(xì)胞為成骨細(xì)胞。再進(jìn)行免疫組化染色觀察、成骨細(xì)胞OSX、OPN蛋白的表達(dá)率等檢測(cè)，與模型組相比，假手術(shù)組和空白組OSX、OPN蛋白的表達(dá)率升高，壯骨止痛方及骨松寶干預(yù)后OSX、OPN蛋白表達(dá)率較模型組顯著升高。依據(jù)本研究結(jié)果分析可得，壯骨止痛膠囊抗骨質(zhì)疏松的作用可能與上調(diào)OSX、OPN蛋白促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化，從而促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收，使得骨量增加有關(guān)。

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