邵秋雨 張芝元 董醇波 鄒曉 韓燕峰 梁宗琦

摘 要：裸囊菌科類(lèi)群是一類(lèi)重要的人和動(dòng)物皮膚病原真菌，尤其是小孢子菌屬，目前對(duì)其報(bào)道主要以臨床病例為主，對(duì)環(huán)境中如土壤和水源中的菌研究較少，為及早預(yù)防真菌感染的發(fā)生，對(duì)我國(guó)山西省和甘肅省土壤中的裸囊菌科真菌資源進(jìn)行調(diào)查。采集不同環(huán)境中的土壤樣品，利用雞毛和頭發(fā)對(duì)土壤樣品中的這類(lèi)資源進(jìn)行誘集，分離目標(biāo)菌株;基于形態(tài)特征和ITS rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析相結(jié)合的方法進(jìn)行菌株的鑒定。從土壤中分離發(fā)現(xiàn)3個(gè)裸囊菌科菌株：經(jīng)鑒定為布拉爾小孢子菌Microsporum boullardii，奇妙帕拉癬菌Paraphyton mirabile和彎奈尼茲皮菌Nannazzia incurvata。前兩個(gè)種為中國(guó)新記錄種，后一個(gè)為大陸新記錄種;這些存在于土壤中的裸囊菌科真菌為潛在人和動(dòng)物的致病菌，值得引起重視。

關(guān)鍵詞：分類(lèi)學(xué);系統(tǒng)發(fā)育;新記錄種

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）03-0016-06 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.03.004

Abstract：Arthrodermataceae was a group of important dermatopathic fungi for humans and animals，especially the genus Microsporum. At present，it is mainly reported in clinical cases，and? the environment such as soil and water source;most reports mainly paid attention to the clinical cases，and there are few studies on such fungi in the environment such as soil and water. In order to prevent fungal infection，Arthrodermataceae resources in soil samples from Shanxi and Gansu Province were investigated. Different soil samples were collected，and cultivated with the chicken feather and hairs by baiting technique，then the target strains were isolated and identified by the morphological characteristics and phylogeny based on ITS rDNA sequences. Three target strains of Arthrodermataceae were obtained and identified as Microsporum boullardii，Paraphyton mirabile and Nannizzia incurvata. The former two species are new to China，while the last one is new to mainland of China. Those fungi of Arthrodermataceae in the soils were potential pathogen of human and animals，which was worthy of attention.

Key words：taxonomy; phylogeny; new record species

人類(lèi)和動(dòng)物皮膚是抵御外界病原微生物侵入的重要屏障，此外，其還可起到防止水分丟失等作用。在不同的皮膚部位存在著不同的微生物群落，通常不具有致病性。但當(dāng)機(jī)體免疫力低下或外界環(huán)境條件的改變等因素打破皮膚上的微生物群落平衡時(shí)，皮膚有可能會(huì)因真菌感染而引起皮膚科疾病如皮膚癬?。ㄆつw癬菌Dermatophyte）、花斑糠疹（馬拉色菌Malassezia）和黏膜念珠菌病（念珠菌Candida）等[1]。常見(jiàn)的能引起淺部真菌病的真菌有毛癬菌Trichophyton、白念珠菌 Canidia albicans、小孢子菌Microsporum和馬拉色菌Malassezia等，其可引起成人和兒童的軀干、指甲、手部、頭部、陰囊等部位的真菌病[2]。這類(lèi)菌也能引起如貓、狗等動(dòng)物的皮膚病。研究表明，皮膚癬病的高低與當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境衛(wèi)生、生活習(xí)慣、生活用水和地區(qū)氣候等密切相關(guān)。目前多數(shù)報(bào)道主要關(guān)注臨床病例，對(duì)環(huán)境如土壤中這類(lèi)真菌的分布和存在報(bào)道不多。本課題組長(zhǎng)期對(duì)土壤中的這類(lèi)真菌物種進(jìn)行調(diào)查和正確的分類(lèi)鑒定，及時(shí)發(fā)現(xiàn)新的潛在感染物種，以期為預(yù)防人類(lèi)和動(dòng)物皮膚感染的發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。

裸囊菌科Arthrodermataceae是重要的人類(lèi)和動(dòng)物皮膚病原菌，大多嗜角蛋白，可于富角蛋白基質(zhì)的土壤中腐生，或與脊椎動(dòng)物的皮膚病及其他感染相關(guān)。以往的研究多集中于病原株的分離、致病性、區(qū)域性調(diào)查等，關(guān)于該科的系統(tǒng)發(fā)育研究剛剛起步。de Hoog et al.基于多基因系統(tǒng)學(xué)研究將裸囊菌科劃分為9屬[3]，即Arthroderma，Ctenomyces，Epidermophyton，Guarromyces，Lophophyton，Microsporum，Nannizzia，Paraphyton和Trichophyton。Wijayawardene等[4]報(bào)道該科有6個(gè)屬，Arthroderma Curr. & Berk.，Ctenomyces Eidam，Epidermophyton Sabour.，Microsporum Gruby，Shanorella R. K. Benj.，Trichophyton Malmsten。因此，該科的系統(tǒng)分類(lèi)值得進(jìn)一步研究。其中重要類(lèi)群小孢子菌屬M(fèi)icrosporum Gruby于1843年以M. audouinii Gruby為模式種建立[5]。之后一些學(xué)者如Emmons 和Ajello等[6-7]對(duì)該屬進(jìn)行了重新整理，國(guó)內(nèi)外發(fā)表了一些新分類(lèi)單元豐富了該屬成員[8-16]。近年來(lái)，國(guó)際上采用“一個(gè)真菌一個(gè)名稱”，有些小孢子菌屬成員被移入奈尼茲皮菌屬Nannizzia中，例如M. incurvatum更名為Nannizzia incurvata;有些小孢子菌屬成員被移入新建屬帕拉癬菌屬Paraphyton中，如M. cookie和M. mirabile分別更名為P. cookie 和 P. mirabile。國(guó)內(nèi)對(duì)該科類(lèi)群還未見(jiàn)有系統(tǒng)研究，但發(fā)現(xiàn)一些種的分布[17-18]，大部分是從動(dòng)物不同部位發(fā)現(xiàn)的，也從土壤中報(bào)道一新分類(lèi)單元[11]。本研究對(duì)山西省和甘肅省兩省50余份土壤中的裸囊菌科類(lèi)群進(jìn)行調(diào)查研究，以期豐富我國(guó)的真菌物種多樣性。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離

從我國(guó)山西省和甘肅省采集的土壤樣品經(jīng)雞毛和頭發(fā)段誘集，挑出目標(biāo)菌株L19.3，K82.3和L6.7至PDA培養(yǎng)基中，25°C下培養(yǎng)7 d或14 d，透明膠帶制片進(jìn)行形態(tài)學(xué)描述、顯微拍照和制作形態(tài)圖。所有活菌株現(xiàn)保存于貴州大學(xué)真菌資源研究所（GZUIFR），其干培養(yǎng)物保存于中國(guó)科學(xué)院菌物標(biāo)本館（HMAS）。

1.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增

將研究菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，25°C恒溫培養(yǎng)14 d，刮取產(chǎn)孢菌絲，經(jīng)液氮研磨后，按照真菌DNA提取試劑盒的流程進(jìn)行DNA的提取。參照張芝元等[11]的操作方法，采用通用引物物ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）和ITS5（5-GGTGAGAGATTTCTGTGC-3）對(duì)ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。25 μL 反應(yīng)體系包括引物ITS4 1 μL，ITS5 1 μL，2 × Master Mix 12.5 μL，模板2 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足25 μL。PCR 條件為：94°C 3 min;94°C 30 s，55°C 30 s，72°C 1 min，30 個(gè)循環(huán);72°C 5 min。將獲得的PCR 產(chǎn)物交北京諾賽公司進(jìn)行測(cè)序，得到的序列經(jīng)校正后提交GenBank（MH577288—MH577290）。

1.3 數(shù)據(jù)處理和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

經(jīng)GenBank中Blast后，下載小孢子菌屬及其相關(guān)種的序列共33條，以合川戴氏霉Taifanglania hechuanensis為外群，經(jīng)MAFFT v7.03b[19]進(jìn)行序列比對(duì)及手工校正后，保存為FASTA 格式（具體信息見(jiàn)表1）。使用MrBayes 3.2 進(jìn)行貝葉斯推理法（Bayesian inference，BI）分析[20]，經(jīng)Modeltest 3.7[21]檢驗(yàn)獲得最佳替換模型為K80+G。位點(diǎn)間差異比率采用分布比率差異（gamma-distributed rate variation），其中部分為不變位點(diǎn)（aproportion of invariant sites），其余參數(shù)為默認(rèn)值;采用Metropolis-coupled Markov Chain Monte Carlo（MCMCMC）法運(yùn)算10 000 000 代，每500 代取樣1 次，從得到的樣本中舍棄25 000 個(gè)老化樣本后總結(jié)得到一致樹(shù)，用TreeView（Page 1996）查看。同時(shí)在軟件MEGA 6中采用最大簡(jiǎn)約法（MP）和鄰接法（NJ）經(jīng)1 000 次bootstrap 驗(yàn)證構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)描述

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

構(gòu)建的裸囊菌科三個(gè)主要類(lèi)群的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）明顯表明，采用最大簡(jiǎn)約法、鄰接法和貝葉斯推理法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。該系統(tǒng)樹(shù)分為I、II、III和IV四支。分支I包含了9種14個(gè)小孢子菌菌株，其中本研究菌株布拉爾小孢子菌Microsporum boullardii MH57288（菌株號(hào)L19.3，干培養(yǎng)物HMAS 255405）與報(bào)道的菌株以82/87/0.89的支持率聚在一起;分支II包含彎奈尼茲皮菌Nannizzia incurvata，本研究菌株MH577289（菌株號(hào)K82.3，干培養(yǎng)物HMAS 255403）與其余三個(gè)彎奈尼茲皮菌以高支持率99/100/1聚在一起;分支III包含了5種9個(gè)小孢子菌Microsporum菌株，這些菌均分離自染病動(dòng)物上;分支IV 包含了3種6個(gè)帕拉癬菌屬Paraphyton菌株，其中本研究菌株MH577290（菌株號(hào)L6.7，干培養(yǎng)物HMAS 255404）與本種另外三個(gè)菌株以較好的支持率90/99/0.99聚在一起。因此，系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果支持了本研究三個(gè)菌株的分類(lèi)地位。

3 結(jié)論與討論

裸囊菌科Arthrodermataceae常見(jiàn)類(lèi)群主要是小孢子菌屬M(fèi)icrosporum及其相關(guān)屬帕拉癬菌屬Paraphyton、奈尼茲皮菌屬Nannizzia和毛癬菌屬Trichophyton，具有親土性、親動(dòng)物性和親人性等特點(diǎn)，可引起人和動(dòng)物發(fā)生頭癬、體癬等感染病害[16]。有研究表明，武漢及其周邊地區(qū)近年來(lái)的頭癬主要由親人性的毛癬菌Trichophyton和小孢子菌Microsporum引起[23];昆明和蘭州地區(qū)的兒童淺部真菌病以皮膚癬菌Dermatophyte病最多，男孩的發(fā)病率高于女孩，致病菌種以犬小孢子菌Microsporum canis位居第一[2]。這可能與接觸小動(dòng)物有關(guān)。黃夢(mèng)雅等[24]研究結(jié)果表明重慶地區(qū)的足癬也是常見(jiàn)病，致病菌種以紅色毛癬菌Trichophyton rubrum，可能與該地區(qū)溫暖潮濕的環(huán)境適宜該真菌的生長(zhǎng)有關(guān)。

Hoog GS等[3]基于ITS，LSU，TUB 和60S L10構(gòu)建了裸囊菌科相關(guān)屬的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，將該科分為9個(gè)屬[3]，其中對(duì)小孢子菌屬M(fèi)icrosporum采用了3種32條序列進(jìn)行了研究，結(jié)果表明不同來(lái)源如人、狗、猴子、兔子等皮膚的同種不同菌株均有一定差異，但三個(gè)種的所有菌株都能分別較好地聚在一起。張芝元等[11]在發(fā)表該屬一新種時(shí)，采用了ITS rDNA進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明ITS能將本屬不同種很好地分類(lèi)，與Hoog GS等[3]多基因的結(jié)果一致。表明ITS可以作為該屬的DNA條碼標(biāo)記進(jìn)行分種鑒定，但對(duì)于屬級(jí)以上階元的分類(lèi)采用多基因?yàn)楹谩?/p>

本研究從土壤中分離獲得的奇妙帕拉癬菌Paraphyton mirabile L6.7菌株能分別與本種其他三個(gè)菌株以較好的支持率（90/99/0.99）聚在一起，而且與其模式標(biāo)本描述基本一致[14];本研究L19.3菌株的描述特征與原始描述基本一致，其在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，與GenBank上布拉爾小孢子菌M.boullardii唯一的一條序列僅以82/87/0.89的支持率聚在一起，支持率不高可能由于種內(nèi)不同菌株的差異引起，正如本系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的P.mirabile中的兩個(gè)菌株HQ825144和MH577290的支持率也僅為76/95/0.83，但與同種其他菌株能較好的聚為一支，同樣的現(xiàn)象在本研究的N.incurvata三個(gè)菌株中也存在，因此，綜合系統(tǒng)發(fā)育與形態(tài)特征，將其鑒定為布拉爾小孢子菌M.boullardii。這兩個(gè)種在我國(guó)未見(jiàn)報(bào)道，是中國(guó)新記錄種。彎奈尼茲皮菌Nannizzia incurvata Stockdale，曾被移入小孢子菌屬中命名為M.incurvatum。早前認(rèn)為石膏樣小孢子菌M.gypseum是N.incurvata的無(wú)性型，但基于ITS rDNA聚類(lèi)分析，雖然這兩個(gè)無(wú)性型形態(tài)非常相似，但它們并不聚在一支，因此N.incurvata是獨(dú)立的一個(gè)種[10]。該菌在臺(tái)灣報(bào)道發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)分離自我國(guó)甘肅省土壤，是大陸新記錄種。它們?cè)谖覈?guó)還未有病例報(bào)道，但這些潛在致病菌的存在和分布也值得重視。

土壤是真菌生活的大本營(yíng)，這些產(chǎn)孢真菌的孢子可長(zhǎng)期潛伏于土壤中，當(dāng)有適宜的環(huán)境條件就會(huì)大量繁殖生長(zhǎng)，尤其接觸到人類(lèi)和動(dòng)物毛發(fā)更易大量富集。沈鑫等[25]研究表明土壤中加入雞毛可明顯促進(jìn)人類(lèi)致病菌如石膏樣小孢子菌Microsporum gypseum的生長(zhǎng)。近年來(lái)隨著飼養(yǎng)貓、狗等寵物的增多，親動(dòng)物性的癬病發(fā)病率有上升趨勢(shì)。有些癬病治療時(shí)間長(zhǎng)，病情易反復(fù)，不易根治。這些結(jié)果提示我們要做好疾病預(yù)防措施，養(yǎng)成講衛(wèi)生的良好習(xí)慣，對(duì)于易出汗的人群，要及時(shí)擦干;另外家里盡量不養(yǎng)寵物，在外也避免接觸小動(dòng)物。若發(fā)現(xiàn)癥狀，及時(shí)就醫(yī)，切忌亂用藥。

致謝：感謝中國(guó)科學(xué)院微生物研究所孫炳達(dá)老師和楊柳老師在菌株和干模保藏方面提供的幫助。

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