魏明峰　張振旺

摘要：DNA條形編碼（DNAbarcoding）是一種快速、準(zhǔn)確的生物分類技術(shù)，它是分子生物學(xué)和生物信息學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物。昆蟲種類繁多，近似物種鑒定困難使該技術(shù)在昆蟲分類工作中得到了廣泛應(yīng)用。文章簡要綜述了DNA條形碼技術(shù)的概念、原理與操作步驟，詳細(xì)闡述了DNA條形碼技術(shù)在昆蟲分類研究中的具體應(yīng)用情況，對其在應(yīng)用過程中相比傳統(tǒng)形態(tài)分類方法的優(yōu)勢和存在問題予以論述，并探討了DNA條形碼技術(shù)今后在昆蟲分類中應(yīng)用的可行性與發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞：DNA條形碼;昆蟲分類學(xué);研究進(jìn)展

中圖分類號：Q969? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? 論文編號：cjas18050009

0引言

DNA條形碼技術(shù)（DNA Barcoding）由分類學(xué)家Paul Hebert在21世紀(jì)初首次提出，作為分類學(xué)中一項(xiàng)輔助技術(shù)，它代表了一個(gè)新的發(fā)展方向，該技術(shù)的提出引起了越來越多生物學(xué)家的關(guān)注。在昆蟲分類學(xué)發(fā)展史中，DNA條形碼是自林奈雙名法以來最為突出的變革，不僅促進(jìn)了昆蟲分類學(xué)和物種多樣性研究進(jìn)程的發(fā)展，而且對種群生態(tài)學(xué)、物種遺傳學(xué)和個(gè)體分子系統(tǒng)發(fā)育等交叉學(xué)科的研究也起到積極的助推作用。

1 ?DNA條形碼概念

生命DNA條形碼協(xié)會(huì)將DNA條形碼定義為可以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)鑒定物種的一小段DNA標(biāo)準(zhǔn)序列。該技術(shù)通過對一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分析，利用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞單位I（CO I）的特定標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域做模板進(jìn)行物種鑒定。概括地講，DNA條形碼核心技術(shù)是對已知的目標(biāo)基因片段進(jìn)行大范圍的掃描驗(yàn)證，進(jìn)而最終確定某個(gè)未知的物種或者發(fā)現(xiàn)新種。

2? DNA條形碼技術(shù)原理及操作過程

2.1? DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用原理

應(yīng)用DNA條形碼的3個(gè)基本條件：（1）能夠得到待定物種的DNA特定序列，即被鑒定物種的DNA標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域;（2）目標(biāo)DNA序列信息容易進(jìn)行鑒別分析;（3）目標(biāo)DNA序列位點(diǎn)信息可以成功鑒定分析相似物種。如同商品零售業(yè)使用的條形編碼，各物種的DNA序列都具備唯一性。在DNA序列的組成上，每個(gè)位點(diǎn)都有4種堿基可供選擇，盡管由于自然選擇的因素，個(gè)別位點(diǎn)上的堿基是固定的，會(huì)導(dǎo)致編碼組合數(shù)減少，此現(xiàn)象可通過針對相關(guān)蛋白編碼基因予以解決。由于在蛋白編碼基因里密碼子的簡并性，其中第3位堿基通常不受自然選擇的影響，而且物種間的遺傳差異遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過種內(nèi)變異，可采用基于CO I基因序列的DNA條形碼作為疑似昆蟲物種鑒定的有效手段。

2.2? DNA條形碼技術(shù)操作過程

通過PCR擴(kuò)增和測序技術(shù)，對源自不同生物個(gè)體的同源DNA特定片段序列進(jìn)行測序，然后對得到的DNA序列進(jìn)行多重序列比對和聚類分析，從而將待定物種準(zhǔn)確定位到一個(gè)己描述過的分類種群中。對某些物種來說，甚至可將其分布準(zhǔn)確到特定的地理種群，具體包括以下幾個(gè)操作步驟：（1）樣品的采集與預(yù)處理，（2）提取樣本DNA，（3）DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)目的基因的擴(kuò)增，（4）PCR產(chǎn)物的純化、序列測定以及分析。通過序列分析將所有序列進(jìn)行雙重比對并計(jì)算其差異值，根據(jù)差異值即可確定物種之間的近源關(guān)系。

3? DNA條形碼技術(shù)在昆蟲分類學(xué)中的應(yīng)用

DNA條形碼在昆蟲分類中的應(yīng)用技術(shù)是建立在傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)和現(xiàn)代分子技術(shù)基礎(chǔ)上的交叉學(xué)科應(yīng)用范疇，體現(xiàn)在先通過傳統(tǒng)分類手段對物種個(gè)體有效特征進(jìn)行形態(tài)上的識別和描述，而后隨著分子技術(shù)的應(yīng)用，個(gè)體特征識別又得以補(bǔ)充和完善。Tautz等最先提出把DNA序列作為主要平臺(tái)應(yīng)用于生物物種分類系統(tǒng)中，即DNA分類學(xué)（DNA Taxonomy）建立的雛形。Hebert等最先提出利用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶I亞基（mtCO I）這一特定基因區(qū)段作為DNA條形編碼的基礎(chǔ)，對除刺胞動(dòng)物門以外所有的動(dòng)物界門，包括11個(gè)門13320個(gè)物種的CO I基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)此特定基因區(qū)段差異能夠很好地對被研究物種加以區(qū)分識別，故認(rèn)為mtCO I是動(dòng)物界中較為合適的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因。昆蟲種類繁多，近似物種鑒定困難，DNA條形碼技術(shù)在昆蟲分類中已得到廣泛應(yīng)用，截至2018年5月，BOLD數(shù)據(jù)庫已經(jīng)有超過400萬涉及昆蟲的條形碼記錄，超過整個(gè)動(dòng)物界的70%以上，包括了183513個(gè)具體物種，其中已公開的有137048種（http：//www.barcodinglife.org）。DNA條形碼技術(shù)在分類研究中，最先在鱗翅目昆蟲中得到應(yīng)用，Hebert等選取CO I基因的一段序列對200多個(gè)鱗翅目昆蟲種類進(jìn)行識別，鑒定結(jié)果認(rèn)為CO I基因的特定序列可以成功鑒定每個(gè)昆蟲個(gè)體。隨后，Hebert等又對2500多只哥斯達(dá)黎加普通蝴蝶（Astraptes fulgerator）進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蝴蝶的DNA條形編碼清楚地進(jìn)入10個(gè)不同的組中，表明該復(fù)合體至少有10個(gè)隱存種，而在此之前這些蝴蝶被簡單地歸為一種，所以說單靠形態(tài)學(xué)特征不能對這些蝴蝶進(jìn)行區(qū)分，也進(jìn)一步證明DNA條形碼對發(fā)現(xiàn)隱存分類單元有極大幫助。Brown等結(jié)合形態(tài)分類學(xué)和DNA條形編碼技術(shù)，報(bào)道了巴布亞新幾內(nèi)亞的鱗翅目新種Xenothictis gnetivora。Hajibabaei等應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對源自熱帶區(qū)域的多種鱗翅目昆蟲進(jìn)行了識別。半翅目昆蟲中蚜蟲類應(yīng)用較多，蚜蟲類昆蟲有超過4400種，而且轉(zhuǎn)主危害也增加了分類工作的難度。Favret和Voegtlin用小片段CO I基因序列鑒定形態(tài)學(xué)上難以鑒別的五節(jié)根蚜族蚜蟲的次生寄主型，結(jié)果表明這些不同寄主型也能被準(zhǔn)確識別鑒定。Foottit等研究認(rèn)為DNA條形編碼可以對寄居在不同宿主、不同生活周期的蚜蟲進(jìn)行有效的物種鑒定，并且還揭示了蚜蟲的多樣性與蚜蟲生命周期具有一定相關(guān)性。煙粉虱是一種世界范圍災(zāi)害性害蟲，各國紛紛對煙粉虱的生物型以及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行深入研究，研究證實(shí)，基于線粒體細(xì)胞色素氧化酶I（mtCO I）基因的差異能有效反映煙粉虱生物型的地理模式。另外，DNA條形碼技術(shù)在等翅目、彈尾目等昆蟲分類中均有應(yīng)用。Ball和Hebert應(yīng)用630 bp CO I基因序列對蜉蝣目昆蟲進(jìn)行研究，結(jié)果顯示種內(nèi)和種間序列平均差異分別為1%和18%，證明DNA條形碼可以有效區(qū)分蜉蝣目昆蟲。在鞘翅目方面，Monaghan等在對馬達(dá)加斯加熱帶水生甲蟲的研究中，應(yīng)用DNA序列在鑒定已記述種的同時(shí)發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)隱存種。

隨著國際上DNA條形碼技術(shù)在昆蟲分類中的廣泛應(yīng)用，國內(nèi)分類學(xué)者也開始關(guān)注該技術(shù)，肖金花等、王鑫等、王劍峰等、李青青等、池宇等、張媛等分別對DNA條形碼技術(shù)及其在相關(guān)學(xué)科中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。諸立新等基于CO I基因約640 bp片段序列的遺傳距離分析，對尾鳳蝶屬（Bhutanitis）4種蝴蝶的20個(gè)標(biāo)本進(jìn)行了鑒定。潘程瑩等以7種常見的斑腿蝗科（Catantopidae）蝗蟲為對象測定了CO I基因序列，探討了CO I基因作為DNA條形碼在鑒別蝗蟲物種的可行性。游中華等通過應(yīng)用CO I基因，對生物入侵種西花薊馬（Frankliniella occidentalis）及其他8種常見薊馬進(jìn)行了鑒定。李敏等通過擴(kuò)增中國普緣蝽屬（Plinachtus）4個(gè)已知種的CO I（1338 bp）序列，計(jì)算了種間/種內(nèi)的遺傳距離。羅晨等利用mtDNACO I基因序列鑒定了國內(nèi)煙粉虱（Bemisia tabac）的生物型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個(gè)煙粉虱實(shí)驗(yàn)種群的生物型與Texas-B型和Arizona-B型種群為同一生物型“B”。褚棟等利用CO I基因片段對國內(nèi)外12個(gè)地理種群煙粉虱的生物型進(jìn)行了鑒定，并對地理種群來源進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國主要省市發(fā)生的煙粉虱與國外的B型煙粉虱具有99.8%?100%的同源性，從而確定了在中國大多數(shù)地區(qū)暴發(fā)成災(zāi)的煙粉虱生物型為“B”型。截至2013年8月，BOLD數(shù)據(jù)庫已有煙粉虱標(biāo)本記錄1557個(gè)，DNA條形碼記錄1427個(gè)，其中CO I>500 bp的記錄有945個(gè)。楊立等通過對隸屬3科10屬12種的嗜尸性蒼蠅線粒體DNA上細(xì)胞色素氧化酶亞單位I（mtCO I）中278 bp基因序列進(jìn)行檢測，證實(shí)了mtDNA上CO I中278 bp基因序列能準(zhǔn)確地對嗜尸性蒼蠅進(jìn)行種類鑒定。范京安等選用雙翅目實(shí)蠅科（Tephritidae）12屬36種55個(gè)樣本為材料，將其DNA條形碼（648 bp）與微型DNA條形碼（50?200 bp）數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，探討微型DNA條形碼對果實(shí)蠅物種鑒定的可行性，虛擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示微型DNA條形碼與DNA條形碼鑒定結(jié)果一致，兩者均可作為實(shí)蠅物種鑒定的可靠依據(jù)。

4? DNA條形碼技術(shù)在應(yīng)用中的優(yōu)點(diǎn)及存在問題

與傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法相比，DNA條形碼技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）準(zhǔn)確性高，親緣較近的不同物種外形極其相似，而形態(tài)鑒別容易導(dǎo)致鑒定誤差，利用堿基序列通過數(shù)字化進(jìn)行物種鑒別，能夠準(zhǔn)確區(qū)分相似物種;（2）快速迅捷，目前世界上已定名的昆蟲僅占一小部分，今后分類學(xué)家可參考DNA條形碼數(shù)據(jù)庫來鑒別或發(fā)現(xiàn)新種，使大量繁瑣的鑒定工作變得更加快捷;（3）非專業(yè)鑒定，由于該技術(shù)是一套機(jī)械程序，即使無分類學(xué)專業(yè)知識的研究人員也可以準(zhǔn)確地進(jìn)行物種辨認(rèn);（4）適用昆蟲的不同生長階段，相比需要成蟲為對象的傳統(tǒng)鑒定方法擴(kuò)大了樣本范圍;（5）不需要特定的組織材料，因?yàn)橥粋€(gè)體或同種昆蟲不同個(gè)體的同源DNA序列是高度一致的。

盡管DNA條形碼技術(shù)具有上述優(yōu)勢，但單一位點(diǎn)特定序列鑒定的特點(diǎn)使其略顯不足，依目前的技術(shù)手段還不能完全取代傳統(tǒng)形態(tài)分類地位。一個(gè)新物種的命名和描述不是僅提供一個(gè)條形碼就可以完成，對于地球上節(jié)肢動(dòng)物的多樣性，除了依賴DNA條形碼，對于昆蟲的寄主類型、危害特征、形態(tài)描述、地理分布以及行為特征的描述都是非常必要的。其存在問題表現(xiàn)在以下方面：（1）需根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的大小設(shè)計(jì)相應(yīng)PCR條件，研究者應(yīng)對條形碼使用的基因區(qū)域足夠了解，而且應(yīng)分層次（屬、種等）尋找適合的條形碼;（2）不同物種間線粒體基因水平轉(zhuǎn)移、近緣物種共享線粒體表現(xiàn)出的多態(tài)性都會(huì)給鑒定增加困難，同屬物種間的差異不顯著以及DNA序列突變也給物種鑒定工作帶來困擾;（3）對物種進(jìn)行地理種群和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析時(shí)經(jīng)常會(huì)得到結(jié)論有時(shí)會(huì)與形態(tài)學(xué)研究結(jié)果有所偏差，如何界定物種分化水平一直是動(dòng)物分類學(xué)家爭論的焦點(diǎn)，鑒于物種的界定在一定程度上受人為影響，線粒體DNA在生物系統(tǒng)地理學(xué)研究中的局限性將是今后研究人員面臨的關(guān)鍵問題;（4）參與研究單位少和研究領(lǐng)域不集中，數(shù)據(jù)共享不足;（5）利用DNA條形碼代價(jià)高，要建立條形編碼數(shù)據(jù)庫需要獲取到DNA樣品，一方面破壞模式標(biāo)本提取DNA在一定角度上不可取，另一方面用新模標(biāo)本替代原有模式標(biāo)本雖然可行，但又面臨新新模標(biāo)本的采集和鑒定等問題。

5? DNA條形碼技術(shù)的研究展望

目前，DNA條形碼技術(shù)研究方向及應(yīng)用主要包括DNA提取方法和測序技術(shù)的優(yōu)化、探究微型條形碼鑒定技術(shù)、利用條形碼信息設(shè)計(jì)相應(yīng)芯片、基于條形碼技術(shù)設(shè)計(jì)生產(chǎn)便攜式鑒定分析掃描儀，而作為精準(zhǔn)的分類手段和工具不能局限于現(xiàn)行通用的分子標(biāo)記，應(yīng)該大膽嘗試和發(fā)現(xiàn)一些新的有可能解決疑難問題的關(guān)鍵功能基因。隨著此技術(shù)的快速發(fā)展，DNA條形編碼對昆蟲多樣性研究將起到越來越重要的作用，包括種類的區(qū)別和鑒定，發(fā)現(xiàn)新種和隱存種，重建物種和高級階元的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等。

全世界的昆蟲可能有1000萬種，而目前世界上已定名的僅有100萬種，所以說在昆蟲分類研究中，DNA條形碼技術(shù)將有長足的發(fā)展和應(yīng)用空間。而且隨著測序技術(shù)的更新和大數(shù)據(jù)時(shí)代海量數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，通過構(gòu)建包含所有發(fā)現(xiàn)物種DNA信息的條形碼序列數(shù)據(jù)庫，DNA條形碼技術(shù)鑒定成本低、速度快、結(jié)果精確，必將成為生物分類學(xué)最實(shí)效的技術(shù)手段、直接的信息資源及鑒定依據(jù)。例如在農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)中針對外來入侵種的檢疫，如能構(gòu)建一套涉及所有有害物種的DNA條形碼芯片系統(tǒng)，并且有從各物種及生命狀態(tài)中提取DNA的相應(yīng)方法，可最大限度提高鑒定準(zhǔn)確率，并加快進(jìn)出口部門對有害生物的鑒定過程，避免檢疫對象的蔓延和發(fā)生危害。在傳統(tǒng)分類學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)分類學(xué)和生物技術(shù)的有機(jī)結(jié)合勢必帶動(dòng)生命科學(xué)的多元化發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)快速準(zhǔn)確的鑒定物種將成為昆蟲分類學(xué)研究的必然趨勢。

綜上所述，作為一種標(biāo)準(zhǔn)的物種鑒定方法，DNA條形碼技術(shù)可靠、快速、簡便等優(yōu)勢使其在生物分類學(xué)、生物多樣性研究等領(lǐng)域具備了巨大的研究及應(yīng)用潛力。隨著DNA條形碼技術(shù)的不斷更新和完善，將形成并建立各物種便捷的標(biāo)準(zhǔn)化測序系統(tǒng)，進(jìn)而構(gòu)建DNA條形碼序列數(shù)據(jù)庫，為物種鑒別提供可靠的信息資源及鑒定依據(jù)。

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