韋玲雙 陸麗婷

【摘 ?要】食品微生物與我們的生活的息息相關(guān)，近來(lái)年我們對(duì)于食品微生物的利用、檢測(cè)和防治也越來(lái)越重視。LAMP也稱環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，是近年來(lái)新興微生物檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)較其他檢測(cè)技術(shù)相比具有更高的靈敏性，并且能夠節(jié)約時(shí)間和成本、操作和結(jié)果判定相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，因此能夠快速應(yīng)用于食物中的細(xì)菌、霉菌、病毒等微生物的檢測(cè)。本文通過(guò)對(duì)LAMP技術(shù)在細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)、支原體等病菌中的檢測(cè)進(jìn)行分析，以期為食品高質(zhì)量快速檢測(cè)提供參考。

【關(guān)鍵詞】LAMP方法;食品微生物;檢測(cè);食品安全

一、前言

食品微生物伴隨這人類的產(chǎn)生，對(duì)我們的生活有利有弊，但食源性致病菌以及實(shí)物變質(zhì)產(chǎn)生的病菌不斷的威脅著人們的健康，甚至不斷威脅著我們的生命。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，各種微生物檢測(cè)方法不斷被研究，而快速、高效、低成本的檢測(cè)方法也越來(lái)越得到人們的重視，其中環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和特異性被廣泛應(yīng)用于食品快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中，為我們進(jìn)行快速的食品檢測(cè)提供了可靠依據(jù)。

二、LAMP技術(shù)原理及檢測(cè)方法發(fā)展

LAMP技術(shù)是由Notomi等人于2000年提出的一種高效的鏈取代核酸技術(shù)，其特殊的靈敏性和特異性立即被應(yīng)用于各種診斷而備受矚目。

1.LAMP基本原理

LAMP是針對(duì)靶序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特殊的引物，然后利用Bst DNA聚合酶在恒溫條件下保溫進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增后觀察副產(chǎn)物焦癖酸鎊的沉淀情況。LAMP不僅僅可以對(duì)DNA和RNA都可以擴(kuò)增，所有的操作過(guò)程只需要用到水浴鍋既可。

2.LAMP的終點(diǎn)檢測(cè)方法

① 我們根據(jù)可以LAMP在將DNA擴(kuò)增后產(chǎn)生的焦磷酸根離子能與鎂離子生成白色的沉淀這一的特性來(lái)判斷LAMP反應(yīng)是否發(fā)生;

② 通過(guò)向在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入熒光染料后顏色的變化來(lái)辨別;

③ 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察分離后行成的梯形狀條帶來(lái)確定。

三、LAMP在臨床微生物檢測(cè)中應(yīng)用及進(jìn)展

①對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)

沙門(mén)氏菌是一種常見(jiàn)的病原菌，多見(jiàn)于禽肉類食品當(dāng)中，往往可以引起人們的食物中毒。自使用LAMP法對(duì)沙門(mén)氏菌檢測(cè)以來(lái)，大大節(jié)約了檢測(cè)該病菌的時(shí)間和成本，將以往檢測(cè)的時(shí)間由2-3天縮短到一個(gè)小時(shí)內(nèi)。且傳統(tǒng)的檢測(cè)方法對(duì)儀器的要求嚴(yán)格，而LAMP法則針對(duì)沙氏門(mén)菌中的STN、fimY或者?invA設(shè)計(jì)引物，然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳法分離，最后通過(guò)肉眼就能觀察出結(jié)果，以此來(lái)檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的存在。曾有人利用該方法檢測(cè)出?7 種不同的沙門(mén)氏菌，可見(jiàn)該方法在食品檢測(cè)方面的靈活性與特異性。

②對(duì)中阪崎腸桿菌的檢測(cè)

阪崎腸桿菌多見(jiàn)于嬰兒食品中，為革蘭氏陰性菌常可致使嬰兒患敗血癥、腦膜炎、菌血癥等疾病，因此對(duì)于阪崎腸桿菌的檢測(cè)相當(dāng)重要。我們根據(jù)阪崎腸桿菌的16S-23S rRNA或者OmpA作為靶序列設(shè)計(jì)引物，利用聚合酶緩沖液恒溫?cái)U(kuò)增并結(jié)合熒光染料監(jiān)測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)且直觀的分析，顯示檢測(cè)結(jié)果的陰陽(yáng)性，且耗時(shí)短，是常規(guī)PCR技術(shù)的100倍。

③對(duì)單增李斯特菌的檢測(cè)

單增李斯特菌是一種人畜共患病原菌和食源性病原菌，可引發(fā)嘔吐、腹痛甚至骨髓炎、心肌炎等疾病。檢測(cè)中我們針對(duì)單增李斯特菌的hlyA基因設(shè)計(jì)引物在Bst DNA聚合酶作用下63℃反應(yīng)45 min，然后采用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行確定最終的檢測(cè)結(jié)果。楊愛(ài)華等利用DNA提取試劑盒，采用Primer 4.0軟件對(duì)單增生性李斯特菌的hlyA基因設(shè)計(jì)了4條具有特異性的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增引物，

并對(duì)引物濃度、反應(yīng)溫度和Mg2+濃度優(yōu)化，在63℃恒溫下反應(yīng)和80℃加熱后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和顯色反應(yīng)鑒定出單增李斯特菌最低檢測(cè)限為3 CFU/mL。

④對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)

金黃色葡萄球菌很容易污染食品，甚至能夠?qū)е氯藗兪澄镏卸荆瑱z測(cè)中我們根據(jù)金黃色葡萄球菌的nuc基因作為靶序列，然后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，最后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。張濤濤也利用改良的LAMP技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定了金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且基因組DNA的提取方法為改良的SDS法，從而得出LAMP法的最佳溫度為60℃，時(shí)間為45 min，并證明出LAMP技術(shù)的靈敏度要比PCR高出100倍。

四、總結(jié)

食品中微生物檢測(cè)是食品安全檢測(cè)的重要部分，食品的安全額也是人們健康與否的關(guān)鍵，傳統(tǒng)方法的食品微生物檢測(cè)的局限性和弊端日漸突出，甚至不能檢測(cè)出食品中的有害物質(zhì)，大大的影響著食品的安全性。LAMP技術(shù)作為新型的快速、安全的檢測(cè)方法，也在不斷的被改進(jìn)和研究，目前它不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)單樣品多種不同靶基因的同時(shí)檢測(cè)，也能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多種樣品的高通量檢測(cè)。

LAMP技術(shù)的實(shí)施與不斷改進(jìn)不但在食品微生物方面有突出的表現(xiàn)，在檢測(cè)食品過(guò)敏原成分和食品動(dòng)物源成分方面也有重要的應(yīng)用，從而對(duì)尋找和檢測(cè)過(guò)敏原和肉類食品檢測(cè)方面大大提高了檢測(cè)的效率，為預(yù)防和治療多種疾病提高了時(shí)效和安全保證。此外LAMP技術(shù)能夠轉(zhuǎn)基因食品的改良上也有突出的表現(xiàn)，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品實(shí)現(xiàn)了快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

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（作者單位：1.廣西中知國(guó)華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司;2.廣西中知科創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司）