黃雪龍 單敏 陳燁 劉玲俐 何晶 王小蘭 于圣青 羅廷榮 涂劍 李濤

摘要：【目的】確定鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因是否與四環(huán)素類耐藥相關(guān)，尋找出抗鴨疫里默氏桿菌藥物研發(fā)新靶點(diǎn)。【方法】克隆鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因，以大腸桿菌原核表達(dá)體系進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用生物信息學(xué)軟件分析原核表達(dá)蛋白的功能和特性，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)四環(huán)素和多西環(huán)素對(duì)鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因的調(diào)控作用?！窘Y(jié)果】從鴨疫里默氏桿菌基因組擴(kuò)增獲得的Tet（X）基因編碼框全長(zhǎng)1167 bp，編碼388個(gè)氨基酸，其編碼蛋白分子量約42.53 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為10.073，與AS87_09615（Yb2）、RIA_0369（YA-GD）、RAYM_08235（RA-YM）、G148_1777（RA-CH-2）、RIA_0365（YA-GD）、G148-1767（RA-CH-2）、B739_0035（RA-CH-1）和B739_0030（RA-CH-1）等8個(gè)來(lái)源于不同種鴨疫里默氏桿菌的蛋白具有較高同源性（96%～100%）。利用原核表達(dá)體系誘導(dǎo)表達(dá)獲得的Tet（X）融合蛋白分子量約45.40 kD，且主要以包涵體的形式表達(dá)。Tet（X）融合蛋白能有效提高宿主菌株對(duì)典型四環(huán)素類藥物（四環(huán)素和多西環(huán)素）的最小抑菌濃度（MIC）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，四環(huán)素和多西環(huán)素對(duì)鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因表達(dá)量的調(diào)控呈非線性。四環(huán)素濃度為0～4 mg/L時(shí)，Tet（X）基因相對(duì)表達(dá)量隨藥物濃度的增加而逐漸增加;濃度為4～12 mg/L時(shí)，Tet（X）基因相對(duì)表達(dá)量隨藥物濃度的增加而逐漸降低。多西環(huán)素藥物濃度為0～3 mg/L時(shí)，Tet（X）基因相對(duì)表達(dá)量隨藥物濃度的增加而逐漸增加;濃度為3～6 mg/L時(shí)，Tet（X）基因相對(duì)表達(dá)量隨藥物濃度的增加而逐漸降低?！窘Y(jié)論】Tet（X）可有效提高宿主菌株對(duì)四環(huán)素類藥物的耐受性，在一定的四環(huán)素類藥物劑量范圍內(nèi)可誘導(dǎo)Tet（X）基因表達(dá)。不同鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因具有不同來(lái)源，說(shuō)明Tet（X）可能存在基因水平轉(zhuǎn)移，且具有環(huán)境擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞： 鴨疫里默氏桿菌;Tet（X）基因;原核表達(dá);功能鑒定

中圖分類號(hào)： S858.32? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）04-0844-07

Abstract：【Objective】This study was conducted to determine whether the Riemerella anatipestifer Tet（X） gene was associated with tetracycline resistance， and to find new targets of drug development against R. anatipestifer. 【Method】R. anatipestifer Tet（X） gene was cloned， and induced by prokaryotic expression in Escherichia coli. Its prokaryotic expression protein function and characters were analyzed by the bioinformatics software. The regulation effects of tetracycline and doxycycline on R. anatipestifer Tet（X） gene were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The full length of the Tet（X） gene obtained from the genome amplification of R. anatipestifer was 1167 bp， encoding 388 amino acids. The molecular weight of the encoded protein was about 42.53 kD， and the theoretical isoelectric point （pI） was 10.073. It had high homology（96%-100%） with eight proteins from different strains of R. anatipestifer， including AS87_09615（Yb2）， RIA_0369（YA-GD）， RAYM_08235 （RA-YM）， G148_1777（RA-CH-2）， RIA_0365（YA-GD）， G148-1767（RA-CH-2）， B739_0035（RA-CH-1） and B739_0030 （RA-CH-1）. The molecular weight of the fusion protein of Tet（X） obtained by prokaryotic expression induction was 45.40 kD， and mainly expressed as inclusion body in prokaryotic expression system. The Tet（X） fusion protein could effectively increase the minimal inhibitory concentration（MIC） of the host strain against typical tetracyclines（tetracycline and doxycycline）. The results of real-time quantitative fluorescence PCR showed that a non-linear effect of the etracycline and doxycycline on the expression of Tet（X） gene. When tetracycline concentration was 0-4 mg/L， the relative expression of Tet（X） gene increased with the increase of drug concentration. At concentrations ranging from 4 to 12 mg/L， the relative expression of Tet（X） gene decreased with increasing drug concentration. When doxycycline concentration was 0-3 mg/L， the relative expression of Tet（X） gene increased with the increase of drug concentration. At concentrations of 3 to 6 mg/L， the relative expression of Tet（X） gene decreased with increasing drug concentration. 【Conclusion】Tet（X） gene can enhance the tetracycline resistance of host bacteria， and its expression level can be induced by tetracycline drugs within a certain dose range. The gene Tet（X） of R. anatipestifer has different origins， suggesting that Tet（X） may have horizontal gene transfer and risk of environmental spread.

Key words： Riemerella anatipestifer; Tet（X） gene; prokaryotic expression; function analysis

0 引言

【研究意義】我國(guó)是家禽養(yǎng)殖大國(guó)，養(yǎng)鴨業(yè)在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位，但隨著養(yǎng)鴨業(yè)集約化和規(guī)模化的發(fā)展，細(xì)菌性疾病日趨嚴(yán)重并制約著其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。鴨疫里默氏桿菌（Riemerella ana-tipestifer，RA）隸屬于黃桿菌科（Flavobacteriaceae）不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），為水禽類主要接觸性感染病原菌之一，在全球水禽類養(yǎng)殖場(chǎng)廣泛存在，主要感染雛鴨，是引起鴨傳染性漿膜炎的主要病原（程龍飛等，2018）。鴨傳染性漿膜炎又名鴨敗血癥、新鴨病、鴨疫綜合癥和鴨疫巴氏桿菌病等（劉洪明，2017）。雛鴨感染鴨疫里默氏桿菌后主要表現(xiàn)為肝周炎、心包炎、氣囊炎和腦膜炎等（Chu et al.，2015），由于鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，現(xiàn)有疫苗對(duì)不同血清型鴨疫里默氏桿菌的交叉保護(hù)力較弱，因此現(xiàn)階段對(duì)于鴨疫里默氏桿菌的防治仍以抗生素治療為主（Li et al.，2017）。但隨著抗生素的大量超范圍使用，鴨疫里默氏桿菌臨床分離株耐藥率越來(lái)越高，促使養(yǎng)殖戶持續(xù)增加用藥劑量，既提高養(yǎng)殖成本，又增加藥物殘留風(fēng)險(xiǎn)。因此，鑒定鴨疫里默氏桿菌耐藥基因及了解其耐藥產(chǎn)生機(jī)制，尋找潛在的抗鴨疫里默氏桿菌藥物研發(fā)新靶點(diǎn)已迫在眉睫。【前人研究進(jìn)展】不同時(shí)段鴨疫里默氏桿菌臨床分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，早期多數(shù)鴨疫里默氏桿菌分離株對(duì)阿莫西林、新生霉素、螺旋霉素、氯霉素、四環(huán)素和林可霉素均表現(xiàn)出高度敏感，但由于抗生素藥物在養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用甚至濫用，導(dǎo)致鴨疫里默氏桿菌耐藥性明顯增強(qiáng)，耐藥譜不斷擴(kuò)大（程增青等，2009;雍燕等，2017）。Chen等（2012）對(duì)2011—2012年收集于韓國(guó)的33株鴨疫里默氏桿菌臨床分離株進(jìn)行藥物敏感性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鴨疫里默氏桿菌分離株對(duì)卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、新霉素等的耐藥率分別為100%、94%、91%和88%。Yang等（2012）對(duì)2005—2011年間我國(guó)不同地區(qū)鴨疫里默氏桿菌分離株的氨基糖苷類抗性基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明95.43%菌株攜帶2～3種氨基糖苷類抗性基因，且核苷酸序列相似性高達(dá)95.8%～100.0%。葉勝?gòu)?qiáng)等（2013）通過(guò)分析2013年以來(lái)我國(guó)各地鴨疫里默氏桿菌分離株對(duì)常用抗菌藥物的敏感率和耐藥率，發(fā)現(xiàn)鴨疫里默氏桿菌分離株已對(duì)我國(guó)鴨場(chǎng)一線主力藥物產(chǎn)生不同程度的耐藥性，二重以上的多重耐藥占耐藥菌株的63%，且隨時(shí)間的變化，耐藥率逐年提高，耐藥譜也呈一定的差異性。雍燕等（2017）對(duì)從廣東云浮、廣東開平和浙江常山3個(gè)地區(qū)分離獲得的16株鴨疫里默氏桿菌分離株進(jìn)行藥物敏感性分析，結(jié)果顯示3個(gè)地區(qū)的鴨疫里默氏桿菌分離株均對(duì)頭孢類和氟苯尼考藥物高度敏感，對(duì)多西環(huán)素和大觀霉素較敏感，但對(duì)恩諾沙星和新霉素等其他藥物已產(chǎn)生不同程度的耐藥性。任曉梅等（2018）從廣東、山東和江蘇等地區(qū)鴨場(chǎng)病料中分離鑒定出46株鴨疫里默氏桿菌，其藥敏結(jié)果顯示這些分離株普遍對(duì)林可霉素、多粘菌素和諾氟沙星耐藥?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于鴨疫里默氏桿菌耐藥性的研究多集中于流行病學(xué)調(diào)查，很少涉及耐藥基因功能分析，特別是四環(huán)素類藥物作為我國(guó)畜牧用藥主力藥物，在家禽養(yǎng)殖場(chǎng)常年大量超范圍使用，導(dǎo)致鴨疫里默氏桿菌四環(huán)素耐藥菌株越來(lái)越多（王良等，2017）。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鴨疫里默氏桿菌M949_0459基因編碼的蛋白具有四環(huán)素滅活酶Tet（X）功能保守區(qū)，將其命名為Tet（X）蛋白。Tet（X）蛋白屬于單加氧酶，在有氧氣和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）存在的情況下，可對(duì)四環(huán)素類藥物進(jìn)行修飾，從而導(dǎo)致四環(huán)素類藥物失活（van Berkel et al.，2006;Santajit and Indrawattana，2016）。針對(duì)Tet（X）蛋白的研究主要集中于人源重要致病菌，如鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌等（Aminov，2009;Leski et al.，2013;Deng et al.，2014），至今未見Tet（X）蛋白在動(dòng)物源致病菌四環(huán)素耐藥性方面的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】對(duì)鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因進(jìn)行克隆及原核表達(dá)，確定其是否與四環(huán)素類藥物耐藥性相關(guān)，尋找出抗鴨疫里默氏桿菌藥物研發(fā)新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

鴨疫里默氏桿菌CH3株（血清I型）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所保存提供;pET-28a載體、Ligation Mix和限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司;大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、異丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）及普通質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和膠回收試劑盒購(gòu)自Fermentas公司;His標(biāo)簽純化磁珠購(gòu)自Biotool公司;四環(huán)素和多西環(huán)素購(gòu)自Sigma公司，諾氟沙星（NOR）、頭孢曲松（CRO）、慶大霉素（GEN）、卡那霉素（KAN）和氨芐西林（AMP）等藥敏片購(gòu)自杭州微生物試劑公司。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank中Tet（X）基因序列，運(yùn)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，在引物兩端分別添加EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，目的條帶大小約1182 bp。上游引物EFS：5'-ACTGAATTCATGACAATG CGAATAGATACAGAC-3';下游引物EFR：5'-AGC CTCGAGGAATTTAACTCCTAAACCTACTTGG-3'（下劃線為酶切位點(diǎn)）。引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1. 3 目的基因擴(kuò)增

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取CH3株基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：2×Taq Mix 25.0 μL，DNA模板2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 70 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后切膠，回收目的片段。

1. 4 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

Tet（X）基因全長(zhǎng)片段及pET-28a載體分別使用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切，然后進(jìn)行連接，將連接好的重組質(zhì)粒pET-28a-Tet（X）轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日挑取單菌落，經(jīng)PCR篩選鑒定后，將重組質(zhì)粒送至上海華津生物科技有限公司測(cè)序。同時(shí)以重組質(zhì)粒pET-28a-Tet（X）轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，第2 d挑取單菌落進(jìn)行PCR篩選鑒定。

1. 5 融合蛋白原核表達(dá)

按1∶100比例將測(cè)序正確的陽(yáng)性重組菌株接種到100 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u床（200 r/min）振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，加入IPTG至終濃度1 mol/L，18 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)24 h，收集菌體，經(jīng)高壓破碎、離心后采用SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況。

1. 6 藥敏試驗(yàn)

四環(huán)素和多西環(huán)素的最小抑菌濃度（MIC）參照葉鳳梅（2015）的方法進(jìn)行測(cè)量，具體步驟如下：挑取陽(yáng)性重組菌株的單菌落接種于Mueller-Hinton（MH）肉湯中，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用MH培養(yǎng)基將菌液稀釋至1×l06 CFU/mL;在96孔板中，每孔加入100.0 μL MH肉湯，然后在第1孔加入待測(cè)藥物溶液100.0 μL，混勻，吸取100.0 μL至第2孔混勻，依次連續(xù)倍比稀釋至第10孔，并從第10孔中吸取100.0 μL棄去。在前11孔內(nèi)各加入制備好的細(xì)菌混懸液100.0 μL;第11孔為不加藥物的空白細(xì)菌組，第12孔為不加藥物的空白MH培養(yǎng)基組。將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h;每個(gè)待測(cè)藥物建立3組平行，陽(yáng)性對(duì)照藥物為環(huán)丙沙星，藥物MIC為其抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度。諾氟沙星、頭孢曲松、慶大霉素、卡那霉素和氨芐青霉素的敏感性則采用紙片法進(jìn)行測(cè)量（范忠軍等，2017;雍燕等，2017）。

1. 7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

將待測(cè)菌株分別加入含不同濃度四環(huán)素或多西環(huán)素的TSB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600約1.0，各取1 mL（約2.5×109 CFU）菌液，4 ℃下12000 r/min離心 2 min，收集沉淀。加入1 mL TRIzol吹吸混勻，根據(jù)TRIzol說(shuō)明提取細(xì)菌總RNA，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，當(dāng)RNA的OD260/OD280與OD260/OD230均位于1.8～2.0時(shí)方可用于反轉(zhuǎn)錄。采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，上游引物QFS：5'-TTGCTTCCTGTCCCGAATCC-3'，下游引物QFR： 5'-TGGACCCGTTGGACTGACTA-3';以16s基因?yàn)閮?nèi)參基因（5'-CAACCATGCAGCACCTTGAAAA-3'和5'-GACGAAAGCGTGGGGAGCGAAC-3'）。所有引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。反應(yīng)體系25.0 μL：2×Power SYBR Green Master 12.5 μL，上、下游引物各0.1 μL，cDNA模板0.2 μL，以去核酸水補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)，通過(guò)2-??Ct法換算Tet（X）基因的相對(duì)表達(dá)量，并以SAS 8.0中的Student’s-Test對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因擴(kuò)增結(jié)果

以CH3株基因組DNA為模板、EFS和EFR為特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在1180 bp附近出現(xiàn)單一的明亮條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

2. 2 鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因生物信息學(xué)分析結(jié)果

鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因編碼框全長(zhǎng)1167 bp，編碼388個(gè)氨基酸，其編碼蛋白分子量約42.53 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為10.073，其中包含44個(gè)帶正電荷的氨基酸和6個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸。BLAST比對(duì)分析結(jié)果表明，鴨疫里默氏桿菌CH3株Tet（X）蛋白序列與AS87_09615（Yb2）、RIA_0369（YA-GD）、RAYM_08235（RA-YM）、G148_1777（RA-CH-2）、RIA_0365（YA-GD）、G148-1767（RA-CH-2）、B739_0035（RA-CH-1）和B739_0030（RA-CH-1）等8個(gè)來(lái)源于不同種鴨疫里默氏桿菌的蛋白具有較高同源性（96%～100%）。此外，通過(guò)分析這9個(gè)蛋白上游非編碼核酸序列的同一性，可將其分為兩組：一組為CH3、RA-YM和YA-GD，另一組包含RA-CH-1、Yb2和RA-CH-2（圖2），表明不同鴨疫里默氏桿菌中的Tet（X）同源蛋白可能存在不同來(lái)源。

2. 3 重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

挑選單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明，采用EFS和EFR特異性引物可從轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果相符的目的條帶（圖3）。經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，PCR擴(kuò)增獲得的目的條帶序列正確，說(shuō)明Tet（X）基因已成功插入pET-28a載體。

2. 4 融合蛋白檢測(cè)結(jié)果

挑選陽(yáng)性重組質(zhì)粒菌株進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)高壓破碎、離心后采用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，原核表達(dá)的Tet（X）融合蛋白分子量約45.40 kD（圖4），與預(yù)測(cè)的蛋白分子量相符;且Tet（X）融合蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。

2. 5 Tet（X）表達(dá)菌株對(duì)不同抗生素的MIC

利用微量肉湯稀釋法或紙片法檢測(cè)Tet（X）表達(dá)菌株對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素及其他常見抗生素的敏感性。由表1可看出，原核表達(dá)的Tet（X）融合蛋白能有效提高宿主菌株對(duì)四環(huán)素和多西環(huán)素的MIC，但并未改變宿主菌株對(duì)其他種類抗生素的敏感性。

2. 6 四環(huán)素和多西環(huán)素對(duì)鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因的調(diào)控作用

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同濃度四環(huán)素和多西環(huán)素對(duì)鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因的調(diào)控作用，結(jié)果顯示，四環(huán)素和多西環(huán)素對(duì)鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因的誘導(dǎo)作用均為非線性。四環(huán)素濃度為1～4 mg/L時(shí)，Tet（X）基因相對(duì)表達(dá)量隨藥物濃度的增加而逐漸增加;濃度為4～12 mg/L時(shí)，Tet（X）基因相對(duì)表達(dá)量隨藥物濃度的增加而逐漸降低（圖4-A）。多西環(huán)素濃度為0～3 mg/L時(shí)，Tet（X）基因相對(duì)表達(dá)量隨藥物濃度的增加而逐漸增加;濃度為3～6 mg/L時(shí)，Tet（X）基因相對(duì)表達(dá)量隨藥物濃度的增加而逐漸降低（圖4-B）。

3 討論

鴨疫里默氏桿菌廣泛存在于自然界，給世界各地的水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害，由于商業(yè)化疫苗交叉保護(hù)力弱，現(xiàn)階段針對(duì)該菌的防治手段仍為抗生素治療。隨著抗生素的長(zhǎng)期大量使用，致使多數(shù)鴨疫里默氏桿菌分離株呈現(xiàn)出對(duì)多種抗生素具有耐藥性的現(xiàn)象（Gyuris et al.，2017），但目前針對(duì)鴨疫里默氏桿菌的耐藥性研究主要集中在藥物敏感性方面，而鮮見耐藥基因的分離、鑒定及其功能研究（Li et al.，2017;單敏，2017）。四環(huán)素類藥物由于價(jià)格低廉、抗菌譜廣，已廣泛應(yīng)用于家禽養(yǎng)殖業(yè)，也因此造成四環(huán)素耐藥菌株普遍存在于我國(guó)養(yǎng)殖場(chǎng)中（閆琦等，2018）。細(xì)菌對(duì)四環(huán)素的耐受機(jī)制主要有以下3種：（1）外排泵基因過(guò)量表達(dá);（2）Tet（X）滅活酶對(duì)藥物的水解滅活作用;（3）核糖體保護(hù)基因的表達(dá)（陳陽(yáng)等，2018）。Tet（X）是一種核黃素依賴的加單氧酶，最早分離自專性厭氧的擬桿菌屬（Reid et al.，2007），隨后在好氧菌中發(fā)現(xiàn)有Tet（X）同源蛋白。至今，在陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、食酸戴爾福特菌、睪丸酮叢毛單胞菌及部分假單胞菌基因組中均檢測(cè)到Tet（X）同源基因的存在（Andrasevic and Dowzicky，2012;Hua et al.，2012;Rumbo et al.，2013）。

本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，鴨疫里默氏桿菌CH3株基因組M949_0459編碼的假定蛋白含有四環(huán)素滅活酶Tet（X）保守區(qū)域，但尚未對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)至今已公布了33株鴨疫里默氏桿菌全基因組序列，基因組比對(duì)分析結(jié)果顯示，Tet（X）同源蛋白僅存在于6株鴨疫里默氏桿菌基因組中，根據(jù)Tet（X）基因上游非編碼區(qū)核酸序列，可將這6種Tet（X）同源蛋白分為兩組。本研究的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，原核表達(dá)的鴨疫里默氏桿菌Tet（X）蛋白可有效降低宿主菌株對(duì)四環(huán)素和多西環(huán)素等典型四環(huán)素類藥物的敏感性，但并未改變宿主菌株對(duì)其他種類抗生素的敏感性，說(shuō)明Tet（X）在鴨疫里默氏桿菌的四環(huán)素耐藥機(jī)制中發(fā)揮一定作用，且具有藥物專一性;進(jìn)一步的藥物誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果表明，四環(huán)素和多西環(huán)素對(duì)于鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因表達(dá)量的調(diào)控呈非線性，表現(xiàn)為Tet（X）基因相對(duì)表達(dá)量隨藥物濃度的增加呈先增加后減少的變化趨勢(shì)，說(shuō)明鴨疫里默氏桿菌對(duì)四環(huán)素類藥物的抵抗不僅依賴于Tet（X），還存在其他四環(huán)素耐藥機(jī)制。該結(jié)論為防治鴨疫里默氏桿菌病提供了新的藥物研發(fā)靶點(diǎn)。此外，雖然鴨疫里默氏桿菌屬于動(dòng)物專屬致病菌，但Tet（X）同源蛋白是否能發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移，通過(guò)環(huán)境生態(tài)鏈擴(kuò)散至人畜共患菌甚至人源專屬細(xì)菌，而影響人類四環(huán)素類藥物臨床治療效果，尚有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

Tet（X）蛋白可有效提高宿主菌株對(duì)四環(huán)素類藥物的耐受性，在一定的四環(huán)素類藥物劑量范圍內(nèi)可誘導(dǎo)Tet（X）基因表達(dá)。不同鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因具有不同來(lái)源，說(shuō)明Tet（X）可能存在基因水平轉(zhuǎn)移，且具有環(huán)境擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）