張成龍 李冰 侯詒然 封功成 陶冶 朱健

摘要：【目的】通過在復(fù)合垂直潛流人工濕地系統(tǒng)中篩選高效的硝化細菌和反硝化細菌，以降低氮素污染對養(yǎng)殖水域生態(tài)系統(tǒng)的危害，為加強人工濕地氮素凈化功能提供科技支撐?！痉椒ā吭趶?fù)合垂直潛流人工濕地—池塘循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的不同運行階段采集樣品，利用選擇性培養(yǎng)基定向篩選，選擇一株高效硝化細菌和一株高效反硝化細菌，對其進行菌種鑒定，并分別研究對應(yīng)菌株的硝化特性或反硝化特性?！窘Y(jié)果】通過個體形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定及16S rDNA同源性比對分析，確定硝化菌株ZX2屬于不動桿菌屬（Acinetobacter），反硝化菌株ZF7屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）。在pH為7.0，溫度為30 ℃，亞硝酸鈉濃度為0.8 g/L的條件下硝化菌株ZX2的硝化能力最強，OD600可達0.80以上，硝化速率達68.4 mg/（L·d）。在pH為7.0，溫度為35 ℃，接種量為6%的條件下反硝化菌株ZF7的反硝化能力最強，OD600可達1.00以上，脫氮率達94.5%。【結(jié)論】篩選得到的硝化細菌和反硝化細菌具有很好的氮素凈化效果，可為下一步強化人工濕地氮素凈化功能提供備用菌株。

關(guān)鍵詞： 人工濕地;硝化細菌;反硝化細菌;氮素污染;含氮廢水凈化

中圖分類號： S182? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）04-0736-09

Abstract：【Objective】A high-efficiency nitrifying bacteria and denitrifying bacteria was screened in the integrated vertical subsurface flow constructed wetlands system to reduce the harm of nitrogen pollution to the aquaculture water ecosystem， and provided a theoretical basis for strengthening the nitrogen purification function of the constructed wetlands.【Method】Samples were collected at different operational stages of the integrated vertical subsurface flow constructed wetland-pond recirculating aquaculture system. A selective media was used for targeted screening，then a high-efficiency nitrifying bacteria and a highly efficient denitrifying bacteria were selected for strain identification and studying separately the nitrification or denitrification characteristics of the corresponding strain. 【Result】The nitrifying strain ZX2 was initially identified as Acinetobacter and the denitrifying strain ZF7 was Pseudomonas based on its morphological observation， physio-logical and biochemical tests as well as 16S rDNA phylogenetic analysis. The nitrification ability of nitrifying strain ZX2 was the highest under the conditions of pH 7.0， temperature 30 ℃，and sodium nitrite concentration 0.8 g/L. OD600 value could reach above 0.80，and the nitrification rate reached 68.4 mg/（L·d）. Under the conditions of pH 7， temperature 35 ℃， the inoculum amount 6%，the denitrification capacity of denitrifying strain ZF7 was the highest. OD600 value could reach above 1.00， and the denitrification rate reached 94.5%. 【Conclusion】The nitrifying bacteria and denitrifying bacteria screened in this study have good effect on nitrogen purification， and can provide a spare strain for further strengthening the nitrogen purification function of the constructed wetlands.

Key words： constructed wetland; nitrifying bacteria; denitrifying bacteria;nitrogen pollution; nitrogen-containing wastewater purification

0 引言

【研究意義】發(fā)展高密度養(yǎng)殖和集約化管理是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展趨勢，高密度集約化養(yǎng)殖在促進漁業(yè)增效和漁民增收的同時，不可避免地帶來養(yǎng)殖水環(huán)境污染問題。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，魚類排泄物和未被消耗飼料的降解使得養(yǎng)殖水體中的氨氮劇增，氨氮和亞硝酸氮含量過高會對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物產(chǎn)生毒害作用，甚至導(dǎo)致大規(guī)模死亡現(xiàn)象發(fā)生;此外，未經(jīng)處理的養(yǎng)殖廢水排放到自然水體中也會造成富營養(yǎng)化，嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展（梁新雪，2011;劉國鋒等，2018）。因此，解決高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的凈化問題迫在眉睫。【前人研究進展】目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中氮素凈化應(yīng)用較廣泛的技術(shù)是微生物處理技術(shù)和生態(tài)處理技術(shù)。微生物處理技術(shù)是利用硝化或反硝化能力強的微生物對水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水進行凈化，具有氮素凈化作用的微生物主要有硝化細菌（王薇等，2007）、紅球菌屬（張艷等，2007）、產(chǎn)堿桿菌屬（王弘宇等，2009）、固氮弧菌屬（王小菊等，2013）、假單胞菌屬（楊浩鋒等，2014）、不動桿菌屬（顏薇芝等，2017）等，但該技術(shù)在處理效果、處理成本、推廣適用性等方面尚有待進一步探究。在生態(tài)處理技術(shù)方面，已有研究表明人工濕地中存在相當(dāng)數(shù)量與氮素凈化相關(guān)的菌種（雷旭等，2015），且硝化細菌和反硝化細菌分布狀況在一定程度上受濕地結(jié)構(gòu)和濕地植物的影響（王愛平等，2010）;研究顯示，表面流人工濕地（魯敏等，2012）、水平潛流人工濕地（李寶華等，2013）及垂直潛流人工濕地（董玉峰，2014）對水體中的氮磷、重金屬等有較穩(wěn)定的處理能力，但隨著使用年限的增長，人工濕地的凈化效率和穩(wěn)定性必然會下降（尹煒等，2004）?！颈狙芯壳腥朦c】復(fù)合垂直潛流人工濕地作為生態(tài)處理技術(shù)的一種典型應(yīng)用模式，其對于水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水氮素的去除效果明顯（董玉峰，2014）。微生物的硝化和反硝化作用是去除氮素的最主要途徑（張鴻等，1999），目前研究報道具有氮素凈化作用的微生物種類較多，但關(guān)于復(fù)合垂直潛流人工濕地中硝化和反硝化細菌的篩選、鑒定及其特性分析的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過特定生境下硝化及反硝化細菌的篩選、鑒定、分析及應(yīng)用，實現(xiàn)人工濕地氮素處理效率的提升，以期為加強人工濕地氮素凈化功能提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1. 1 試驗地點及概況

1. 1. 1 復(fù)合垂直潛流人工濕地—池塘循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu) 試驗地點位于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心大浦科研試驗基地。復(fù)合垂直潛流人工濕地主要由5個單元構(gòu)成，即沉淀池、上行垂直潛流濕地、下行垂直潛流濕地、預(yù)警池及清水池，面積約600 m2。濕地基質(zhì)為直徑8～10 cm大鵝卵石、4～6 cm小鵝卵石和2～4 cm生物陶粒。濕地植物為生長周期較長的梭魚草（Pontederia cordata）和再力花（Thalia dealbata），上行池主要種植再力花，下行池種植梭魚草，再力花株距60 cm，梭魚草株距40 cm，種植時間為5月初。池塘養(yǎng)殖鯽魚、團頭魴、鰱魚和鳙魚，密度依次為0.011、0.136、0.020和0.006 kg/m3，每天上午9：00—10：00和下午16：00—17：00投喂飼料。試驗于2017年濕地運行的6—10月進行。復(fù)合垂直潛流人工濕地—池塘循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1. 1. 2 復(fù)合垂直潛流人工濕地—池塘循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)基本數(shù)據(jù) 人工濕地水力負荷（HLR）和水力停留時間（HRT）根據(jù)公式計算得出。

式中，S為人工濕地主體面積（m2），W為污水設(shè)計流量（100 m3/d），γ為人工濕地孔隙度（%），h為人工濕地深度（m）。

復(fù)合垂直潛流人工濕地—池塘循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)基本數(shù)據(jù)見表1，不同時間段的人工濕地溫度、pH和溶氧量見表2。

1. 2 樣品采集及培養(yǎng)基制備

1. 2. 1 樣品采集 在濕地運行初期（6月底）、中期（8月底）和末期（10月底），采用三點取樣法在上行池和下行池進行采樣，分別采集濕地植物根系、根系附近基質(zhì)及植物附近水樣，每個取樣點選取3株相鄰植株進行平行取樣，裝入取樣袋，置于4 ℃環(huán)境中冷藏待用。

1. 2. 2 培養(yǎng)基制備 硝化液體富集培養(yǎng)基：亞硝酸鈉1.0 g、硫酸鎂0.5 g、碳酸鈉1.0 g和硫酸亞鐵0.4 g，加蒸餾水定容至l L。該培養(yǎng)液在滅菌前用氫氧化鈉調(diào)pH至7.5～8.0，再加0.5 g磷酸氫鉀（磷酸鹽單獨滅菌，且在培養(yǎng)液冷卻至室溫后加入）（王小菊等，2013）。

反硝化液體富集培養(yǎng)基：硝酸鉀2.0 g、硫酸鎂0.2 g、磷酸氫鉀0.5 g和酒石酸鉀鈉20.0 g，加蒸餾水定容至1 L;pH 7.0～7.5（曾慶武等，2008）。

平板分離培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基中加入約1.8%瓊脂糖即可。

純化培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g和氯化鈉10.0 g，加水定容至1 L;氫氧化鈉調(diào)pH至7.0。

1. 3 試驗方法

1. 3. 1 細菌篩選 取濕地水樣10 mL、基質(zhì)若干及適量植物根系加入到含100 mL滅菌蒸餾水的250 mL三角燒瓶中，30 ℃下170 r/min振蕩30 min后，取10 mL上清液加入到含100 mL硝化液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，另取10 mL上清液加入到含100 mL反硝化液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中（夏輝和梁運祥，2006）;在30 ℃、170 r/min條件下，硝化培養(yǎng)液振蕩富集培養(yǎng)10 d（每2 d吸取適量硝化富集液，在白瓷板上與二苯胺試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，根據(jù)顯色反應(yīng)判斷液體培養(yǎng)基中亞硝酸根的減少和硝酸根的生成狀況）（胡朝松等，2009），反硝化培養(yǎng)液靜置密閉富集培養(yǎng)3 d。選取顏色變深的硝化培養(yǎng)液和富集培養(yǎng)3 d后的反硝化培養(yǎng)液按稀釋分離方法稀釋至10-2、10-3和10-4 3個稀釋度，分別在硝化細菌和反硝化細菌固體培養(yǎng)基上涂布分離，硝化固體培養(yǎng)基在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d左右，反硝化固體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d左右。挑選8株典型單菌落，經(jīng)溶菌肉湯（LB）培養(yǎng)基多次劃線純化，轉(zhuǎn)入斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3. 2 備用菌液培養(yǎng) 將上述分離得到且保存在斜面的單菌株分別接種到含20 mL LB液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，28 ℃下170 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，作為備用菌液。

1. 3. 3 脫氮率和硝化速率測定 將1.3.2獲得的備用硝化菌液按6%的接種量接種至含有硝化液體培養(yǎng)基的三角瓶中，反硝化菌液按2%的接種量接種至含有反硝化液體培養(yǎng)基的三角瓶中（其中1瓶不接種，作為對照），設(shè)3個平行，結(jié)果取其平均值。3 d后參照曾慶武等（2008）的方法檢測硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，并計算脫氮率，以硝酸鹽降解、亞硝酸鹽積累及脫氮率為反硝化細菌的篩選指標(biāo)，其中以脫氮率為主要指標(biāo)。

10 d后利用比色法（國家環(huán)境保護總局《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會，2002）測定亞硝酸根量。硝化速率以單位時間、單位體積培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化亞硝酸根的量（亞硝酸根的減少量）表示（王小菊等，2013）。

式中，C1為不接種樣品中亞硝酸根濃度（mg/L），C0為接種樣品中亞硝酸根濃度（mg/L），t為培養(yǎng)時間（d）。

1. 3. 4 菌種鑒定 選取工作效率最高的硝化和反硝化細菌，參照蔡妙英和東秀珠（2001）的方法進行菌株形態(tài)和生理生化鑒定;同時，測定16S rDNA序列和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 3. 5 菌種特性分析

1. 3. 5. 1 溫度對菌株特性的影響 硝化細菌按備用菌液6%的量接種至含有硝化培養(yǎng)液的三角瓶中（亞硝酸鈉濃度1.0 g/L），反硝化細菌按備用菌液2%的量接種至含有反硝化培養(yǎng)液的三角瓶中。初始pH控制在7.0，溫度依次設(shè)為10、20、30、35和40 ℃，以不加菌液的三角瓶為對照，每個試驗3次重復(fù)。硝化細菌每24 h測定一次OD600指示菌株的生長情況，5 d后檢測亞硝酸鹽含量，并計算硝化速率;反硝化細菌每6 h測定一次OD600，同時測定硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，并計算脫氮率。

1. 3. 5. 2 pH對菌株特性的影響 試驗設(shè)計同1.3.5.1，初始溫度控制在30 ℃，pH依次設(shè)為5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。

1. 3. 5. 3 亞硝酸鈉濃度對硝化特性的影響 試驗設(shè)計同1.3.5.1，初始溫度控制在30 ℃，pH控制在7.0，亞硝酸鈉濃度依次設(shè)為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 g/L。

1. 3. 5. 4 接種量對反硝化特性的影響 初始溫度30 ℃，pH 7.0，接種量依次設(shè)為2%、4%、6%和8%。每6 h測定一次OD600，48 h后測定硝酸鹽和亞硝酸鹽含量，并計算脫氮率。

1. 3. 6 數(shù)據(jù)測定方法 硝酸鹽含量采用紫外分光光度法測定;亞硝酸鹽含量采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法測定;菌株的生長情況使用可見分光光度法測定。

16S rDNA序列測定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，所得測序拼接結(jié)果提交GenBank進行BLAST比對分析，獲得同源性最高種屬的16S rDNA序列，采用MEGA 5.2的鄰位相連法（Neighbor-joining method）進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，以確定菌株分類地位。

1. 4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0進行單因素方差分析（One-way ANVOA），并進行Duncan’s多重比較。在數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析前，試驗數(shù)據(jù)需進行正態(tài)性和方差齊性檢驗（Zar，1999）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 硝化和反硝化細菌的篩選鑒定結(jié)果

由表3可知，濕地運行不同階段菌株的工作效率有所不同。選擇硝化速率最高的菌株，即濕地運行初期從再力花根基樣品中篩選出的硝化細菌，命名為ZX2;選擇反硝化速率最高的菌株，即濕地運行末期從再力花根基樣品中篩選出的反硝化細菌，命名為ZF7。

硝化菌株ZX2的菌落生態(tài)特征及生理生化特征：菌體呈淺褐色球狀，不透明，革蘭氏染色陰性;葡萄糖氧化呈陽性，V-P試驗及甲基紅試驗呈陽性，不能水解淀粉，不利用檸檬酸，不產(chǎn)H2S，不具運動性，過氧化氫試驗、吲哚試驗和氧化酶試驗均呈陰性。根據(jù)菌株生態(tài)及生理生化特征，結(jié)合《伯杰氏細菌鑒定手冊》（布坎南和吉本斯，1984）及16S rDNA序列鑒定結(jié)果，可確定ZX2菌株為不動桿菌屬（Acinetobacter）。對菌株ZX2進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，結(jié)果（圖2-A）表明，該菌株與不動桿菌屬中的約氏不動桿菌（A. johnsonii）的遺傳進化距離最近。

反硝化菌株ZF7的菌落生態(tài)特征及生理生化特征：菌體呈黃白色圓形，半透明，表面光滑，邊緣整齊，革蘭氏染色陰性;氧化酶試驗呈陽性，精氨酸雙水解酶和硝酸鹽還原陽性，甲基紅和V-P試驗呈陰性，不液化明膠，不水解淀粉。根據(jù)菌株生態(tài)及生理生化特征，結(jié)合《伯杰氏細菌鑒定手冊》（布坎南和吉本斯，1984）及16S rDNA序列鑒定結(jié)果，可確定ZF7菌株為假單胞菌屬（Pseudomonas）。對菌株ZF7進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，結(jié)果（圖2-B）表明，該菌株與惡臭假單胞菌（P. putida）的遺傳進化距離最近。

2. 2 菌種特性分析結(jié)果

2. 2. 1 溫度的影響 將菌株ZX2按照一定量接入硝化細菌培養(yǎng)液中，不同溫度下菌株ZX2的硝化速率變化如圖3所示。不同溫度對硝化速率有顯著影響（P<0.05，下同），在10～30 ℃范圍內(nèi)硝化速率隨溫度的升高呈顯著上升趨勢，但溫度超過30 ℃后，硝化速率隨溫度的持續(xù)升高而呈下降趨勢。該菌株最適宜的硝化溫度為30 ℃，硝化速率達62.9 mg/（L·d）。

溫度對菌株ZF7反硝化作用脫氮率的影響如圖4所示，不同溫度條件下，菌株ZF7的脫氮率隨培養(yǎng)時間的延長總體上呈逐步上升后趨于穩(wěn)定的變化趨勢;48 h內(nèi)菌株ZF7在35 ℃下反硝化能力最強，脫氮效果最佳，最高脫氮率達93.9%，溫度過高或過低均會影響菌株反硝化作用的效率。

通過定時測定培養(yǎng)液OD600的變化來反映菌株的生長狀態(tài)，菌株ZX2在不同溫度下的生長變化如圖5-A所示，不同溫度條件下菌株ZX2的OD600隨培養(yǎng)時間的延長總體呈先上升后趨于穩(wěn)定的變化趨勢，該菌株在30 ℃下細菌濃度最大（0.87），生長狀態(tài)最佳;圖5-B反映溫度對菌株ZF7生長的影響情況，菌株ZF7在35 ℃下生長狀態(tài)最佳，利用硝酸鹽的能力最強，同時在30和35 ℃條件下，培養(yǎng)48 h OD600均可達1.00以上。

2. 2. 2 pH的影響 在不同pH條件下，菌株ZX2的硝化速率和細菌濃度呈先上升后下降的變化趨勢，且pH為7.0時，菌株ZX2所表現(xiàn)的硝化速率和細菌濃度均最高，分別為68.4 mg/（L·d）和0.72（圖6）。圖7顯示，在不同pH條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株ZF7的脫氮率和細菌濃度呈先上升后趨于穩(wěn)定的變化趨勢，pH為7.0時，菌株ZF7表現(xiàn)的脫氮率和細菌濃度均最高（分別為94.4%和1.39），培養(yǎng)至48 h，pH 6.0～8.0的脫氮率可維持在80.0%以上，且OD600大于0.80。

2. 2. 3 亞硝酸鈉濃度對菌株ZX2硝化特性的影響 將菌株ZX2按照一定量接種至硝化細菌培養(yǎng)液中，在不同亞硝酸鈉濃度下培養(yǎng)，硝化速率和細菌濃度OD600如圖8所示，隨著亞硝酸鈉濃度的升高，硝化速率和細菌濃度總體呈先上升后下降的變化趨勢;菌株ZX2在亞硝酸鈉濃度為0.8 g/L時的生長狀態(tài)最佳，硝化速率最高[65.6 mg/（L·d）]，當(dāng)亞硝酸濃度高于1.2 g/L后，硝化速率和細菌濃度均迅速下降。

2. 2. 4 接種量對菌株ZF7反硝化特性的影響 圖9顯示，在48 h培養(yǎng)時間內(nèi)，菌株ZF7在接種量為6%的條件下OD600始終最高，生長狀態(tài)最佳（圖9-A）;接種量對脫氮率的影響較小，4個接種量在培養(yǎng)48 h后脫氮率均達80.0%以上，其中6%接種量的脫氮率最高（94.5%），顯著高于4%接種量，與2%和8%接種量的脫氮率差異不顯著（P>0.05）（圖9-B）。

3 討論

3. 1 關(guān)于菌種鑒定結(jié)果

通過個體形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定及16S rDNA同源性比對分析，表明篩選的反硝化細菌屬于假單胞菌屬，硝化細菌屬于不動桿菌屬。目前，已報道假單胞菌屬中具有反硝化功能的細菌包括產(chǎn)堿假單胞菌（P. pseudoalcaligenes）（楊基先等，2008）、惡臭假單胞菌（王弘宇等，2009）、施氏假單胞菌（P. stutzeri）（胡國元等，2012）及熒光假單胞菌（P. fluorescens）（連紅民等，2015）。本研究得到反硝化菌株初步鑒定為假單胞菌屬的惡臭假單胞菌。本研究對惡臭假單胞菌的反硝化特性進行分析，發(fā)現(xiàn)菌株ZF7具備很強的反硝化脫氮能力，在pH為7.0、溫度為35 ℃，接種量為6%的條件下，其脫氮率可達94.5%，一定程度上加深了對惡臭假單胞菌在氮素凈化特性的認識。

國內(nèi)外對于具備硝化功能不動桿菌屬的研究較少，但近幾年不動桿菌屬的異養(yǎng)硝化和好氧反硝化特點引起學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前，已報道不動桿菌屬中具有氮凈化功能的細菌包括鮑曼不動桿菌（A. baumannii）（孔慶鑫，2004）、溶血不動桿菌（A. haemolyticus）（劉玉香，2012）、約氏不動桿菌（劉小英等，2016）和瓊氏不動桿菌（A. junii）（顏薇芝等，2017）。金少鋒（2018）在池塘底部篩選的1株不動桿菌對氨氮和硝酸鹽氮具有很好的去除能力，好氧反硝化能力處于較高水平。本研究篩選獲得的硝化細菌初步鑒定為約氏不動桿菌，該菌株在適宜條件下去除氮素的效率可達68.4 mg/（L·d），120 h內(nèi)對硝氮去除率可達49.2%，去除效率處于較高水平。劉小英等（2016）篩選的約氏不動桿菌在120 h內(nèi)對硝氮去除率為56.9%，表明約氏不動桿菌有較強的硝化去氮能力，本研究結(jié)果與其相吻合。

3. 2 關(guān)于菌株ZF7反硝化特性

本研究結(jié)果表明，不同接種量下細菌濃度OD600在培養(yǎng)48 h后均可達0.70以上，4個接種量在培養(yǎng)48 h后脫氮率均在80.0%以上，初始接種量對于脫氮率的影響不明顯，由此可得出菌株ZF7在OD600大于0.70后對脫氮率的影響不顯著。顏薇芝等（2017）對1株不動桿菌的脫氮性能研究中也得到類似結(jié)果，在不同碳源情況下，當(dāng)OD600大于1.00以上時，OD600的增加并未使脫氮效率提高。

3. 3 關(guān)于篩選菌株應(yīng)用于氮素凈化

已有學(xué)者通過構(gòu)建小型盆栽人工濕地（陳朋，2009）或利用工業(yè)廢水（趙志嵐，2013）對實驗室條件下篩選得到的硝化細菌或反硝化細菌的氮素凈化效果進行相關(guān)研究，但目前國內(nèi)外對于將篩選得到的硝化細菌或反硝化細菌應(yīng)用于大型人工濕地凈化效果的研究仍較少。本研究通過對復(fù)合垂直潛流人工濕地運行期間的pH和溫度進行連續(xù)監(jiān)測，pH變化范圍基本在6.0～8.0，溫度范圍為19～33 ℃。菌株ZF7在該pH和溫度范圍內(nèi)有很好的生長狀態(tài)，OD600可達1.00以上，脫氮率在80.0%以上;菌株ZX2硝化速率在50.0～60.0 mg/（L·d）范圍內(nèi)波動。表明復(fù)合垂直潛流人工濕地運行期間，在pH和溫度的適宜波動范圍內(nèi)篩選獲得的反硝化細菌和硝化細菌能發(fā)揮其氮素凈化效果，但具體效果仍需通過進一步的實際應(yīng)用來檢驗。

4 結(jié)論

本研究從復(fù)合垂直潛流人工濕地運行過程中篩選得到氮素去除效果較好的硝化細菌和反硝化細菌，經(jīng)鑒定硝化細菌屬于不動桿菌屬，反硝化細菌屬于假單胞菌屬。在pH 7.0、溫度30 ℃、亞硝酸鈉濃度0.8 g/L條件下硝化菌株ZX2的硝化能力最強;在pH 7.0、溫度35 ℃，接種量6%條件下反硝化菌株ZF7的反硝化能力最強，即可為下一步強化人工濕地氮素凈化功能提供備用菌株。

參考文獻：

布坎南R.E.，吉本斯N.E. 1984. 伯杰氏細菌學(xué)鑒定手冊[K]. 第8版. 中國科學(xué)院微生物研究所譯. 北京：科學(xué)出版社. [Buchanan R E，Gibbons N E. 1984. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology[K]. The 8th Edition. Translated by Institute of Microbiology，Chinese Academy of Scien-ces. Beijing：Science Press.]

蔡妙英，東秀珠. 2001. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社. [Cai M Y，Dong X Z. 2001. Handbook of Identification of Common Bacterial Systems[M]. Beijing：Science Press.]

陳朋. 2009. 反硝化細菌的篩選、鑒定及其強化處理硝酸鹽廢水的研究[D]. 濟南：山東大學(xué). [Chen P. 2009. Isolation and identification of denitrifying bacteria and its bioaugmentation on nitrate wastewater treatment[D]. Jinan：Shandong University.]

董玉峰. 2014. 復(fù)合濕地凈水效果的評價及優(yōu)化技術(shù)的研究[D]. 上海：上海海洋大學(xué). [Dong Y F. 2014. Purification effect and optimization techniques of composite construc-ted wetland[D]. Shanghai：Shanghai Ocean University.]

國家環(huán)境保護總局《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會. 2002. 水和廢水監(jiān)測分析方法[M]. 第4版. 北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社. [Editorial Board of Water and Wastewater Monitoring and Analysis Methods of the State Environmental Protection Administration. 2002. Water and Wastewater Monitoring and Analysis Methods[M]. The 4th Edition. Beijing：China Environmental Science Press.]

胡朝松，李春強，劉志昕，于曉玲，孫建波，彭明. 2009. 海洋沉積物中反硝化細菌的分離鑒定及反硝化性能研究[J]. 環(huán)境科學(xué)研究，22（1）：114-118. [Hu C S，Li C Q，Liu Z X，Yu X L，Sun J B，Peng M. 2009. Identification and denitrification analysis of denitrifying bacteria in sea sediment[J]. Research of Environmental Sciences，22（1）：114-118.]

胡國元，張凱，袁軍，楊洋，雷夢婕，章建國. 2012. 施氏假單胞菌菌株的脫氮特性[J]. 武漢工程大學(xué)學(xué)報，34（6）：4-7. [Hu G Y，Zhang K，Yuan J，Yang Y，Lei M J，Zhang J G. 2012. Characteristics of removing nitrogen of Pseudomonas stutzeri strain[J]. Journal of Wuhan Institute of Technology，34（6）：4-7.]

金少鋒. 2018. 好氧反硝化細菌的分離鑒定及反硝化能力[J]. 綠色環(huán)保建材，（3）：193. [Jin S F. 2018. Isolation，identification and denitrification ability of aerobic denitrifying bacteria[J]. Green Environmental Protection Buil-ding Materials，（3）：193.]

孔慶鑫. 2004. 一株新型脫氮微生物的分離鑒定及其脫氮機制[D]. 北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院. [Kong Q X. 2004. Screening and identifying of a novel denitrogenation microorganism and study on its nitrogen remo-val machanisms[D]. Beijing：Academy of Military Medical Sciences.]

雷旭，李冰，李曉，王璐，朱健. 2015. 復(fù)合垂直流人工濕地系統(tǒng)中不同植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，34（5）：1373-1381. [Lei X，Li B，Li X，Wang L，Zhu J. 2015. Rhizosphere microbial communities of three plants in vertical-flow constructed wetland[J]. Chinese Journal of Ecology，34（5）：1373-1381.]

李寶華，邢玉亮，陳靜，程輝，張茜，于俊萍. 2013. 濕地植物對郊區(qū)污水中氨氮凈化效果的研究[J]. 環(huán)境科學(xué)導(dǎo)刊，32（5）：83-84. [Li B H，Xing Y L，Chen J，Cheng H，Zhang Q，Yu J P. 2013. Purification of ammonia nitrogen in the suburb wastewater by wetland plants[J]. Environmental Science Survey，32（5）：83-84.]

連紅民，邱忠平，何昆明，周文秀. 2015. 一株好氧反硝化—異養(yǎng)硝化菌的篩選及脫氮特性研究[J]. 生物技術(shù)通報，31（6）：138-143. [Lian H M，Qiu Z P，He K M，Zhou W X. 2015. Screening and denitrification characteristics of an aerobic denitrifying-heterotrophic nitrification bacterium[J]. Biotechnology Bulletin， 31（6）：138-143.]

梁新雪. 2011. 氨氮污染對水產(chǎn)養(yǎng)殖的危害及防治技術(shù)[J]. 大眾科技，（9）：147-148. [Liang X X. 2011. Hazards and control techniques of ammonia nitrogen pollution on aquaculture[J]. Popular Science & Technology，（9）：147-148.]

劉國鋒，徐跑，吳霆，徐增洪，徐剛春. 2018. 中國水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境氮磷污染現(xiàn)狀及未來發(fā)展思路[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，34（1）：225-233. [Liu G F，Xu P，Wu T，Xu Z H，Xu G C. 2018. Present condition of aquaculture nitrogen and phosphorus environmental pollution and future development strategy[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，34（1）：225-233.]

劉小英，馮晟，班宜輝，薛領(lǐng)，林志聰，呂坤媛，徐舟影. 2016. 一株異養(yǎng)硝化—好氧反硝化細菌的分離鑒定及其脫氮性能研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報，25（12）：1983-1990. [Liu X Y，F(xiàn)eng S，Ban Y H，Xue L，Lin Z C，Lü K Y，Xu Z Y. 2016. Study on isolation，identification and nitrogen removal performance of a heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium[J]. Ecology and Environment Sciences，25（12）：1983-1990.]

劉玉香. 2012. 兩株異養(yǎng)硝化—好氧反硝化菌的分離鑒定和脫氮性能研究[D]. 太原：太原理工大學(xué). [Liu Y X. 2012. Isolation，identification and nitrogen removal performance of two heterotrophic nitrification-aerobic denitri-fying bacteria[D]. Taiyuan：Taiyuan University of Techno-logy.]

魯敏，郭振，李東和. 2012. 人工濕地園林植物對生活污水中氨氮凈化效果的影響[J]. 中國園林，28（1）：81-84. [Lu M，Guo Z，Li D H. 2012. Study on the purification effects of constructed wetland plants in NH4+-N disposal in living wastewater[J]. Chinese Landscape Architecture，28（1）：81-84.]

王愛平，金秋，吳琦平. 2010. 人工濕地硝化與反硝化細菌分布研究[J]. 環(huán)境科技，23（1）：1-4. [Wang A P，Jin Q，Wu Q P. 2010. Study on distribution of nitrobacteria and denitrobacteria in constructed wetland[J]. Environmental Science and Technology，23（1）：1-4.]

王弘宇，馬放，楊開，魏利，蘇俊峰，張獻旭. 2009. 兩株異養(yǎng)硝化細菌的氨氮去除特性[J]. 中國環(huán)境科學(xué)，29（1）：47-52. [Wang H Y，Ma F，Yang K，Wei L，Su J F，Zhang X X. 2009. Ammonia removal by two strains of heterotrophic nitrifying bacteria[J]. China Environmental Science，29（1）：47-52.]

王薇，蔡祖聰，鐘文輝，王國祥. 2007. 好氧反硝化菌的研究進展[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，18（11）：2618-2625. [Wang W，Cai Z C，Zhong W H，Wang G X. 2007. Research advances in aerobic denitrifiers[J]. Chinese Journal of Applied Ecology，18（11）：2618-2625.]

王小菊，何春平，王震，邢傳宏，宋安東，陳紅歌. 2013. 高效硝化細菌的篩選及特性研究[J]. 中國環(huán)境科學(xué)，33（2）：286-292. [Wang X J，He C P，Wang Z，Xing C H，Song A D，Chen H G. 2013. Screening and characterization of an efficient nitrobacterium[J]. China Environmental Scien-ce，33（2）：286-292.]

夏輝，梁運祥. 2006. 1株凈水貧營養(yǎng)細菌的篩選及其低營養(yǎng)特性的初步研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，25（5）：530-534. [Xia H，Liang Y X. 2006. Screening and preliminary study of an oligotrophic bacteria for water purification[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，25（5）：530-534.]

顏薇芝，張漢強，余從田，雷艷芳，郝健，史吉平. 2017. 1株異養(yǎng)硝化好氧反硝化不動桿菌的分離及脫氮性能[J]. 環(huán)境工程學(xué)報，11（7）：4419-4428. [Yan W Z，Zhang H Q，Yu C T，Lei Y F，Hao J，Shi J P. 2017. Isolation of Acinetobacter sp.YN3 and its heterotrophic nitrification-ae-robic denitrification characters[J]. Journal of Environmental Engineering，11（7）：4419-4428.]

楊浩鋒，唐佳玙，胡安輝，楊岳平，謝柳. 2014. 一株反硝化細菌的分離鑒定及其反硝化特性[J]. 環(huán)境工程學(xué)報，8（1）：366-371. [Yang H F，Tang J Y，Hu A H，Yang Y P，Xie L. 2014. Identification and denitrification characteristics of a denitrifier[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering，8（1）：366-371.]

楊基先，高珊珊，馬放，蘇俊峰，王強. 2008. 一株好氧反硝化細菌的分離鑒定及反硝化能力[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報，28（7）：1302-1307. [Yang J X，Gao S S，Ma F，Su J F，Wang Q. 2008. Identification and phylogenetic analysis of an isolated aerobic denitrifier[J]. Acta Scientiae Circumstantiae，28（7）：1302-1307.]

尹煒，李培軍，尹澄清，臺培東，李海波，郭偉. 2004. 潛流人工濕地的局限性與運行問題[J]. 中國給水排水，20（11）：81-84. [Yin W，Li P J，Yin C Q，Tai P D，Li H B，Guo W. 2004. Application limitation and operation of subsurface flow constructed wetland[J]. China Water & Wastewater，20（11）：81-84.]

曾慶武，梁運祥，葛向陽. 2008. 反硝化細菌的分離篩選及其反硝化特性的初步研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，27（5）：616-620. [Zeng Q W，Liang Y X，Ge X Y. 2008. Scree-ning of denitrobacteria and preliminary study about its denitrification properties[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，27（5）：616-620.]

張鴻，陳光榮，吳振斌，鄧家齊. 1999. 兩種人工濕地中氮、磷凈化率與細菌分布關(guān)系的初步研究[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），33（4）：575-578. [Zhang H，Chen G R，Wu Z B，Deng J Q. 1999. The study on the relationship between N，P remoivng rates and the distribution of bacteria in two artifical wetlands[J]. Journal of Central Normal China University（Natural Sciences），33（4）：575-578.]

張艷，李秋芬，王印庚. 2007. 大菱鲆工廠化養(yǎng)殖水質(zhì)凈化菌的篩選與系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 漁業(yè)科學(xué)進展，28（4）：21-25. [Zhang Y，Li Q F，Wang Y G. 2007. Screening and phylogenetic analysis of bacteria used for purifying water quality in industrial culture of Turbot[J]. Marine Fishe-ries Research，28（4）：21-25.]

趙志嵐. 2013. 一株反硝化細菌的分離、鑒定及應(yīng)用[D]. 信陽：信陽師范學(xué)院. [Zhao Z L. 2013. Isolation， identification and application of a denitrifying bacteria[D]. Xinyang：Xinyang Normal University.]

Zar J H. 1999. Biostatistical Analysis[M]. Upper Saddle River：Prentice Hall.

（責(zé)任編輯 羅 麗）