柳娜 楊文雄 王世紅 張雪婷 楊長剛

摘要：通過特異PCR擴增技術(shù)，以擬南芥基因組DNA為模板，克隆了rd29A基因上游? ?1 600 bp的脅迫誘導(dǎo)型啟動子序列。將此1 600 bp的調(diào)控序列與GUS基因連接構(gòu)建植物表達載體pBI101-rd29A-GUS，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)基因擬南芥。定量PCR結(jié)果顯示，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因純合株系中rd29A顯著上調(diào)表達。GUS組織化學(xué)染色及GUS定量分析結(jié)果表明，在ABA、甘露醇和NaCl等脅迫處理下，GUS活性增強，尤其是ABA脅迫處理。說明rd29A啟動子可以增強逆境下GUS基因的表達，可作為一種誘導(dǎo)型啟動子應(yīng)用于提高作物抗逆性的基因工程研究中。

關(guān)鍵詞：rd29A;干旱;ABA;NaCl;甘露醇;小麥

中圖分類號：S336? ? ? ?文獻標(biāo)志碼：A? ? ? ?文章編號：1001-1463（2019）05-0040-07

Abstract：About 1600bp stress inducible promoter of rd29A from Arabidopsis thaliana genomic DNA was cloned by PCR. The plant expression vector pBI101-rd29A-GUS was constructed with this regulatory region linked up with GUS gene，and then transferred to Arabidopsis by Agrobacterium tumefaciens system. The expression level of rd29A was up-regulated under drought stress in homozygous seedlings. Histochemical analysis and quantitative analysis results showed that the GUS activity was enhanced under ABA、NaCl and mannitol treatments. Therefore， rd29A prompter can strengthen the expression of GUS gene under stresses， and can be used as an inducible promoter in gene engineering for stress resistance improvement of crops.

Key words：rd29A; Drought; ABA; NaCl; Mannitol; Wheat

在復(fù)雜的自然生境下，農(nóng)作物的生長發(fā)育經(jīng)常會遭受到干旱、低溫、高鹽和澇旱等逆境脅迫的影響，進而影響農(nóng)作物產(chǎn)量[1 ]。近年來，現(xiàn)代生物育種技術(shù)在作物育種中的貢獻愈加顯著，其中利用基因工程技術(shù)提高植物抗逆性已成為分子生物學(xué)研究的重要領(lǐng)域之一[2 - 3 ]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為一項強有力的工具，在不改變作物原有特性的基礎(chǔ)上，可以將控制植物抗逆的關(guān)鍵基因?qū)肫渲?，從而實現(xiàn)品種改良的目的。然而，大部分的轉(zhuǎn)基因是用CaMV35S植物組成型強啟動子驅(qū)動目的基因表達，使得目的基因在植物不需要的情況下仍能強烈表達，進而改變植物正常的基因調(diào)控和代謝途徑，而引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長發(fā)育，造成轉(zhuǎn)基因植物生長緩慢、株型變小等[4 - 6 ]。

擬南芥rd29A啟動子是逆境誘導(dǎo)型啟動子，含有干旱、高鹽、低溫、ABA誘導(dǎo)表達等相關(guān)的順式作用元件（Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki，1994），可用于抗逆基因工程。因此，選擇合適的逆境誘導(dǎo)型啟動子進行克隆以替代CaMV35S啟動子與特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合驅(qū)動目的基因表達，在提高植物的抗性并減小目的基因過量表達給轉(zhuǎn)基因植物帶來的不利影響等方面具有極大的優(yōu)越性。

研究發(fā)現(xiàn)，rd29A的表達受多種環(huán)境因素誘導(dǎo)，可響應(yīng)冷、干旱、鹽和脫落酸（ABA）等脅迫[7 ]。我們根據(jù)擬南芥rd29A起始密碼子上游1600bp的啟動子序列設(shè)計引物，以DNA為模板，克隆獲得了該啟動子，將其與植物表達載體pBI101-GUS連接，檢測了其在不同脅迫下的活性，以期為今后利用該誘導(dǎo)型啟動子培育抗性作物品種（如小麥）提供研究基礎(chǔ)和應(yīng)用依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料

1.1.1? ? 供試材料? ? 以擬南芥野生型（Col-0生態(tài)型）種子為材料。種子在4 ℃春化3 d后，用15%次氯酸鈉消毒，點種在MS培養(yǎng)基上。培養(yǎng)7 d后，取材提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后進行基因克隆。同時將幼苗移至營養(yǎng)土（土與蛭石按體積比3∶1配制）中，在23 ℃培養(yǎng)室培養(yǎng)（光照16 h、黑暗8 h）28 d左右，用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灐?/p>

1.1.2? ? 主要試劑? ? 植物總RNA提取試劑盒（Tiangen）、反轉(zhuǎn)錄酶（Thermo Fisher）、MS粉（Duchefa）、高保真酶Prime STAR（Takara）、凝膠回收試劑盒（康潤生物）、內(nèi)切核酸酶（NEB）、SYBR Green I（Takara）、0.2 mL PCR八連管（Bio-Rad）?？敲顾?、利福平、NaCl、甘露醇、Na2HPO4、NaH2PO4、SDS和Na2EDTA·2H2O購自索萊寶，ABA購自Sigma公司，X-Gluc和MUG購自Goldbio公司。Triton X-100、β-巰基乙醇、Na2CO3、考馬斯亮藍G250和牛血清白蛋白BSA購自上海生物工程有限公司。

1.2? ?方法

1.2.1? ? 載體構(gòu)建? ? 參照CTAB法[8 ]提取基因組DNA作為模板。選取rd29A的5’上游序列1 600 bp設(shè)計特異性引物進行PCR擴增。引物由華大基因公司合成。將克隆得到的片段回收后，由Hind III酶和XbaI酶進行雙酶切，同時對載體pBI101-GUS用相同的酶雙酶切后，與酶切片段進行連接，得到由擬南芥rd29A基因啟動子驅(qū)動的植物表達載體pRD29A-pBI101-GUS。雙酶切鑒定獲得陽性克隆，測序，序列合適后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。

1.2.2? ?轉(zhuǎn)基因純合株系獲得? ?利用浸花法[9 ]，將1.2.1中獲得的陽性克隆侵染擬南芥野生型（Col-0），獲得T0代種子。將干燥的T0代種子在含卡那霉素的MS培養(yǎng)基上大量播種，挑取有抗性的幼苗移入土中繼續(xù)培養(yǎng)，單株收取得到T1代種子。將T1代種子按照3∶1的原則繼續(xù)經(jīng)卡那霉素篩選，存活的株系單株收種子得到T2代種子。T2代種子繼續(xù)經(jīng)抗生素篩選，全部存活沒有分離的則定為純合株系，用于后續(xù)實驗。

1.2.3? ? 定量PCR分析? ? ?將純合株系種子在4 ℃下春化3 d后，用15%次氯酸鈉消毒，點種在MS培養(yǎng)基上。7 d后將幼苗移至營養(yǎng)土中，在23 ℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)（16 h光照/8 h黑暗）12 d后進行干旱處理。

試驗設(shè)計分為2組，一組為對照組，正常澆水;一組為處理組，不澆水。處理7 d后分別取材。參照植物總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，檢測其完整性并測定RNA濃度和純度。取2 μg RNA，按照反轉(zhuǎn)錄酶的說明書進行cDNA合成。反轉(zhuǎn)錄后用于定量分析。

1.2.4? ? 組織表達分析? ? 純合株系種子在4 ℃下春化3 d后，用15%次氯酸鈉消毒，點種在MS培養(yǎng)基上。7 d后，幼苗移至處理培養(yǎng)基上。試驗設(shè)計分為4組，對照組不作任何處理，繼續(xù)在MS培養(yǎng)基上正常生長;其他3組分別為200 mM NaCl處理、150 μM ABA處理，以及300 mM甘露醇處理。處理2 h后，對4組試驗取材進行GUS染色。GUS染色按照文獻的方法進行[10 ]。

1.2.5? ? GUS活性分析? ? 首先提取植物總蛋白。取200 mg新鮮的植物組織，液氮速凍后迅速磨碎，將研磨后的組織轉(zhuǎn)到1.5 mL離心管里，加入1 mL GUS提取緩沖液[0.1 M 磷酸緩沖液（pH 7.0）50 mL;10% SDS 1 mL;0.5M EDTA（pH 8.0） 2 mL;Triton X-100 100 μL;β-巰基乙醇100 μL;加水定容至100 mL]，充分混勻。4 ℃ 11 600 rpm 離心5 min，將上清轉(zhuǎn)至另一新的離心管中，冰上放置。

接著以牛血清白蛋白BSA作標(biāo)曲，參照Bradford的方法對蛋白濃度進行測定[11 ]。

最后對GUS表達水平進行定量分析：取100 μL蛋白上清，加入37 ℃預(yù)熱的GUS提取緩沖液400 μL后再加入500 μL MUG底物（2 mM），37 ℃溫浴。在0 min、15 min、30 min、45 min和60 min時分別取混合反應(yīng)物200 μL加入到800 μL反應(yīng)終止液（0.2 M Na2CO3）中，室溫下避光保存。利用熒光分光光度計在激發(fā)波長365 nm、發(fā)射波長455 nm下，狹縫10 nm時測定不同時間點的熒光強度值。以熒光強度值對反應(yīng)時間作曲線，求出單位時間熒光強度變化。用單位時間熒光強度變化除以參加反應(yīng)的蛋白量，求得單位質(zhì)量的蛋白在單位時間的熒光強度變化。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?rd29A啟動子的擴增及酶切鑒定

以擬南芥DNA為模板，加入特異性引物（表1）進行擴增。電泳結(jié)果（圖1）表明，克隆得到約1 600 bp的預(yù)期片段（命名為pRD29A）。利用HindIII酶和XbaI酶對目的片段和植物表達載體pBI101-GUS進行雙酶切，將pRD29A插入到載體，得到由擬南芥rd29A啟動子驅(qū)動GUS報告基因的植物表達載體pBI101-rd29A-GUS。HindIII酶和XbaI酶雙酶切鑒定重組克?。▓D2），表明rd29A啟動子完整的插入到表達載體中，同時通過測序確定為所需陽性克隆。

2.2? ?轉(zhuǎn)基因植株篩選

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將上述成功的陽性克隆轉(zhuǎn)基因進入擬南芥中。對轉(zhuǎn)基因獲得的種子進行抗生素（卡那霉素）篩選。轉(zhuǎn)基因植株具有抗性，幼苗較綠，根能夠伸長生長，未轉(zhuǎn)入成功的植株因缺乏抗性而黃化死去（圖3）。多次篩選后獲得純合株系。

2.3? ?干旱脅迫下rd29A及GUS基因表達量變化

rd29A是干旱脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因，因此檢測了干旱脅迫和未處理條件（CK）下轉(zhuǎn)基因純合株系中rd29A以及GUS報告基因表達量變化。對照組和處理組各取3個生物學(xué)重復(fù)，提取總RNA后進行凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示6個樣本的RNA完整性均較好（圖4）。測定濃度和純度后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA用于實時熒光定量分析。

定量分析結(jié)果（圖5）顯示，與對照組相比，干旱處理后rd29A基因顯著上調(diào)表達，而GUS基因表達略有上調(diào)。

2.4? ?GUS染色及活性分析

分析了不同脅迫處理下轉(zhuǎn)基因株系中GUS活性是否發(fā)生變化。將培養(yǎng)7 d的幼苗經(jīng)不同處理2 h后進行GUS染色，脫色后在體視顯微鏡觀察。結(jié)果（圖6）顯示，與對照組相比，3種處理下下胚軸、葉片及整株幼苗中GUS活性均升高。其中ABA處理下GUS活性顯著高于對照組與其他2個處理組，尤其在子葉中。甘露醇和NaCl處理與對照相比GUS活性略有升高。

為進一步分析不同處理下GUS活性變化，將培養(yǎng)7 d的幼苗經(jīng)不同處理2 h后的GUS活性進行定量分析。結(jié)果（圖7）顯示，與對照組相比，3種處理下GUS活性在整株幼苗中均升高。其中ABA處理下GUS活性高于對照組與其他兩個處理組。甘露醇和NaCl處理下與對照相比GUS活性略有升高，這與GUS染色結(jié)果一致。

3? ?小結(jié)與討論

啟動子是提供RNA聚合酶識別和結(jié)合的一段DNA序列和相關(guān)的調(diào)控元件，通常位于基因的上游，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄。根據(jù)啟動子的作用方式，可分為組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。在作物的遺傳轉(zhuǎn)化中，絕大多數(shù)用組成型啟動子CaMV35S驅(qū)動目的基因表達，這可能造成轉(zhuǎn)基因作物的生長發(fā)育受到限制，因此誘導(dǎo)型和特異型啟動子的研究受到越來越廣泛的關(guān)注。

誘導(dǎo)型啟動子通常是指在某些特定的信號刺激下可以大幅度提高基因轉(zhuǎn)錄水平的啟動子。誘導(dǎo)型啟動子對基因表達的調(diào)控，可以改善植物在發(fā)育過程中對環(huán)境變化的適應(yīng)，同時可避免基因過量表達對植物造成的潛在危害。誘導(dǎo)型啟動子包括多種類型：可被激素如脫落酸、生長素等誘導(dǎo)表達的啟動子ABRE和E1[12 - 13 ];可在低溫、脫水以及高鹽等逆境因子的作用下被誘導(dǎo)表達的啟動子Fro1、ABA2和Rab16A [14 - 16 ];能夠?qū)θ斯ず铣傻幕瘜W(xué)誘導(dǎo)物作出反應(yīng)的啟動子IN2-2[17 ]。此外還存在一些能夠被光誘導(dǎo)Sgt1[18 - 19 ]和機械創(chuàng)傷誘導(dǎo)Win3 [20 ]表達的啟動子類型。

rd29A啟動子作為誘導(dǎo)型啟動子中研究最廣泛的啟動子，已被許多學(xué)者應(yīng)用于提高轉(zhuǎn)基因作物抗性的育種研究中[21 - 22 ]。rd29A作為DREB1調(diào)控的目的基因，其啟動子區(qū)域含有DRE核心序列和ABA響應(yīng)的順式作用元件（ABRE）[23 ]。在植物細(xì)胞缺水時，體內(nèi)產(chǎn)生的ABA通過信號傳導(dǎo)，可以產(chǎn)生與rd29A啟動子區(qū)ABRE序列相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，啟動rd29A的表達。同時DREB1轉(zhuǎn)錄因子與rd29A啟動子DRE核心序列結(jié)合也可以誘導(dǎo)該基因的表達。細(xì)胞不缺水時rd29A并不表達[24 - 25 ]，因此認(rèn)為rd29A是一個干旱誘導(dǎo)型啟動子。

本研究經(jīng)過定量分析，已經(jīng)證明干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因株系中rd29A顯著上調(diào)表達。同時通過GUS染色和GUS活性定量分析發(fā)現(xiàn)，在ABA、甘露醇和NaCl等非生物脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系的葉脈和下胚軸處的GUS染色加深，說明rd29A啟動子在脅迫誘導(dǎo)下活性增強，可以有效地驅(qū)動GUS基因的表達。前人的研究同樣表明將擬南芥rd29A啟動子轉(zhuǎn)入煙草中，經(jīng)GUS染色分析發(fā)現(xiàn)脅迫處理下轉(zhuǎn)基因煙草葉脈處藍色較深[26 ]。

Kasuga等[27 ]分別構(gòu)建了CaMV35S啟動子和rd29A啟動子驅(qū)動DREB1A基因的表達載體，轉(zhuǎn)基因到擬南芥中區(qū)別其抗逆能力。結(jié)果顯示，CaMV35S驅(qū)動的DREB1A基因過表達后激活轉(zhuǎn)基因株系中其他脅迫基因的表達，如rd29A、Kin1、Cor6.6、Cor15a、rd17和P5CS等，雖然具有更強的抗旱、抗鹽等能力，但其在正常條件下生長遲緩。而由rd29A驅(qū)動的DREB1A基因表達后，轉(zhuǎn)基因株系既可獲得更強的脅迫耐性，同時植株生長受到的影響較小。因此rd29A誘導(dǎo)型啟動子在植物抗逆基因工程中具有廣泛的應(yīng)用前景和極大的研究價值。我們在前人的基礎(chǔ)上構(gòu)建了Rd29A啟動驅(qū)動的GUS基因表達，不僅在組織染色水平上驗證了其在干旱脅迫條件下的響應(yīng)，同時多角度做了關(guān)聯(lián)驗證，如自身RD29A基因的誘導(dǎo)表達分析，GUS活性定量分析，更加精確地明確了Rd29A啟動子的功能。希望通過進一步構(gòu)建rd29A干旱誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動DREB轉(zhuǎn)錄因子的植物表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其成功轉(zhuǎn)入小麥中，以提高甘肅旱地小麥產(chǎn)量。

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（本文責(zé)編：陳? ? ?珩）

收稿日期：2019 - 03 - 06

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31560390）;甘肅省科技重大專項（17ZD2NA016-7）;甘肅省小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（GARS-01-01）;公益性行業(yè)農(nóng)業(yè)科研專項（201503125-1）資助。

作者簡介：柳? ?娜（1981 — ），女，甘肅靖遠(yuǎn)人，副研究員，主要從事小麥分子和常規(guī)育種工作。Email：592905658@qq.com。

通信作者：楊文雄（1964 — ），男，甘肅會寧人，研究員，主要從事小麥育種研究工作。Email：ywxm822@126.com。