王婭寧 高龍

摘 ? 要：細菌內(nèi)毒素廣泛存在于人們的生活中，可引起人體發(fā)熱、白細胞減少、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克、彌散性血管內(nèi)凝血等癥狀，在藥品生產(chǎn)過程中不可避免地會引入細菌內(nèi)毒素，所以藥品質(zhì)量控制中對內(nèi)毒素的檢測尤為重要。目前，細菌內(nèi)毒素的檢測方法有家兔熱原試驗法、鱟試劑法、微量凝膠法、重組C因子法、酶聯(lián)免疫法等檢測方法。文章對這幾種檢測方法進行綜述，比較各自的優(yōu)缺點，以期為內(nèi)毒素的檢測提供更合理有效的方法。

關(guān)鍵詞：細菌內(nèi)毒素檢查法;鱟試劑;微量凝膠法;重組C因子法

細菌內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細胞壁上的脂多糖，在極微量（1～5 ng/kg體重）的情況下便可引起人體發(fā)熱、白細胞減少、微循環(huán)障礙、全身炎癥反應(yīng)及多器官功能衰竭等嚴重不良反應(yīng)，所以在藥物生產(chǎn)中，尤其是注射劑的生產(chǎn)中，細菌內(nèi)毒素的控制與檢測非常重要，關(guān)乎人們的生命安全。

細菌內(nèi)毒素的檢測方法：家兔熱原試驗法、鱟試劑法、微量凝膠法、重組C因子法、酶聯(lián)免疫法等檢測方法?！吨腥A人民共和國藥典》（2015版）規(guī)定細菌內(nèi)毒素的檢測采用鱟試劑檢測法。鱟試劑是由美洲鱟或東方鱟的血液中變形細胞的溶解物提取而成。我國每年對鱟試劑的需求為1 000萬支，使我國鱟資源面臨著巨大壓力[1]。由于近些年淺海環(huán)境的惡化，人們肆意地捕食，我國的鱟資源急劇減少，所以，尋找細菌內(nèi)毒素檢查法的替代方法和補充方法已經(jīng)迫在眉睫[2]。

1 ? ?細菌內(nèi)毒素檢查方法分析

1.1 ?家兔法

由于家兔對熱原的反應(yīng)與人基本相似，所以，采用家兔耳緣靜脈注射的方式，監(jiān)測家兔體溫，用來定性檢測熱原。但是家兔法存在很多缺點，如：不能定量檢測熱原、使用動物實驗、檢測周期長、靈敏度低等，因此家兔法正在逐步被取代。

1.2 ?鱟試劑法

鱟試劑法是目前檢查細菌內(nèi)毒素的常用標(biāo)準，鱟試劑主要含有：C因子、B因子、G因子、凝固蛋白酶原等物質(zhì)，其反應(yīng)原理是：首先C因子與細菌內(nèi)毒素結(jié)合被激活為酶活性形式，然后活化的C因子將B因子活化，活化的B因子將凝固蛋白酶原活化為凝固蛋白酶，凝固蛋白酶將凝固蛋白原轉(zhuǎn)化為凝固蛋白形成凝膠[3]。鱟試劑法具有操作簡單、高靈敏度、易于推廣等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥品檢測，但鱟試劑法在檢測某些復(fù)雜成分的藥品時，需要排除很多干擾因素，給檢驗工作增加了負擔(dān)，同時由于鱟資源逐漸枯竭，尋找鱟試劑法的替代方法也是最近幾年的研究重點。

1.3 ?微量凝膠法

微量凝膠法是采用微量鱟試劑與微量供試品反應(yīng)的一種檢測方法，在無菌環(huán)境下加樣品10 μL，和鱟試劑平鋪在無熱原的平板上進行反應(yīng)，使用含2%亞甲基藍的70%乙醇溶液為染料，滴在凝膠樣本上，若形成堅實凝膠，染料會順著凝膠滑落，記錄為陽性;若未形成凝膠，樣本將被染色，記錄為陰性。裴宇盛等[4]選取了74個品種的232批次的樣品，分別采用凝膠法和微量凝膠法進行試驗，結(jié)果判斷相同的為221批，占95.2%，根據(jù)數(shù)據(jù)分析，微量法的陰性結(jié)果可靠，更加靈敏，但假陽性率相對較高?！稓W洲藥典》7.0版已收錄了微量凝膠法且已使用多年，但微量凝膠法在我國的實際應(yīng)用中還存在著一些問題，如：（1）有部分廠家生產(chǎn)的鱟試劑只能使用自己生產(chǎn)的檢查用水才能判斷檢查結(jié)果。裴宇盛等[4]的試驗發(fā)現(xiàn)個別廠家在使用微量凝膠法時，試驗結(jié)果出現(xiàn)難以區(qū)分陽性和陰性的問題，但用鱟試劑廠家提供的檢查用水時，有助于解決該問題，這是因為我國鱟試劑廠家在生產(chǎn)工藝上存在著差別，這種差別所帶來的影響在微量法中被放大了。（2）目前，我國還未制定微量凝膠法的統(tǒng)一標(biāo)準，試驗結(jié)果的判定存在一定的主觀性。（3）含有表面活性劑的樣品不適合使用微量法，如果樣品中含有表面活性劑，會使液體攤散在酶標(biāo)板上，進而在水浴孵育時使液體蒸發(fā)，導(dǎo)致無法觀察結(jié)果。（4）微量法使用的染色劑中含有高濃度乙醇，乙醇揮發(fā)會導(dǎo)致凝膠融化，使結(jié)果全部為陰性，因此在染色結(jié)束后應(yīng)馬上觀察結(jié)果。所以，微量凝膠法優(yōu)缺點比較明顯，陰性結(jié)果可靠，假陽性率太高，可以利用微量凝膠法進行大批量樣品篩查，其不確定結(jié)果可以使用凝膠法進行驗證或者仲裁。微量凝膠法在未來經(jīng)過經(jīng)驗的積累，制定統(tǒng)一的標(biāo)準之后，有望收錄進我國藥典。

1.4 ?重組C因子法

重組C因子是由東方鱟或者美洲鱟的基因克隆而成，具有與C因子一樣的生理活性。目前，我國已成功開發(fā)重組C因子試劑盒且已上市[5]，其原理是使用單一的蛋白質(zhì)C因子作為活性成分參與反應(yīng)，被內(nèi)毒素活化的C因子將人工合成的三肽鏈熒光底物裂解，產(chǎn)生熒光復(fù)合物，通過定量檢測熒光復(fù)合物來量化細菌內(nèi)毒素。其優(yōu)點是因為沒有B因子的存在，從而有效地避免了因G因子的旁路干擾而產(chǎn)生的假陽性。裴宇盛等[6]選用了我國生產(chǎn)的抗生素、中藥注射液、生化藥品、重組技術(shù)產(chǎn)品、病毒疫苗和單克隆抗體6個具有代表性的品種進行干擾試驗。結(jié)果回收率均在50%～200%范圍內(nèi)，表明該6個品種在我國均可用重組C因子法進行檢測。近些年來，雖然我國關(guān)于重組C因子的制備研究增多[7-8]，但是有關(guān)重組C因子的應(yīng)用研究比較少[9-10]，能提供的試驗經(jīng)驗很少，重組C因子法在我國還沒有取得法定地位。根據(jù)文獻提供的數(shù)據(jù)支持，仍需要大力推廣重組C因子法，獲得更多的實驗數(shù)據(jù)，為重組C因子法收錄進我國藥典作鋪墊。

2 ? ?發(fā)展趨勢

微量凝膠法與重組鱟C因子法目前已經(jīng)具備了全面推廣的條件，在推廣使用中可以收集到大量的應(yīng)用數(shù)據(jù)，逐步形成一套標(biāo)準的檢測方法，然后便可收錄進我國藥典，同時還應(yīng)該探索靈敏度更高、適應(yīng)性更強的方法。如Grallert H等[11]制備了一種對細菌內(nèi)毒素核心保守區(qū)域具有高度特異性和選擇性的噬菌體蛋白，實現(xiàn)了對內(nèi)毒素的特異性捕捉。該方法是重組C因子法和ELISA法的結(jié)合，其具體步驟為將樣品吸附到預(yù)先包被的酶標(biāo)板上，然后將樣品基質(zhì)洗脫，加入重組C因子，重組C因子被內(nèi)毒素活化，活化的C因子與熒光底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光。該方法檢測范圍為0.05～500 EU/mL，用15種不同菌株的內(nèi)毒素，同時用這種方法與細菌內(nèi)毒素檢查法測定，結(jié)果數(shù)值呈線性相關(guān)（R2=0.91）[11]。該方法具有明顯的優(yōu)勢，如：假陽性、假陰性結(jié)果更少，靈敏度更高，檢測范圍更廣，適用性更強。我國也有關(guān)于ELISA法檢測細菌內(nèi)毒素的研究，但并未使用重組C因子法檢測。張夢等[12]采用分子印跡法，以多巴胺為功能單體，內(nèi)毒素為模板分子，在酶標(biāo)板形成包被抗體MIP，用于吸附內(nèi)毒素，MIP的吸附性與多巴胺的聚合時間有關(guān)，多巴胺膜越厚吸附能力越強。周卓晟[13]采用多粘菌素B作為酶標(biāo)板的包被材料，作為內(nèi)毒素的吸附劑。分子印跡法產(chǎn)生的MIP與多粘菌素B都具有價格低廉、易于制備的優(yōu)點，可以大批量的生產(chǎn)制備，可以嘗試用這兩種材料來吸附細菌內(nèi)毒素。

3 ? ?結(jié)語

目前，我國東南沿海海域的中華鱟和圓尾鱟因為棲息環(huán)境的破壞和大量捕食等原因數(shù)量急劇減少，甚至某些地區(qū)瀕臨滅絕。應(yīng)該積極地推廣和使用細菌內(nèi)毒素檢查法的替代方法，減少鱟試劑的使用量，使鱟資源變成可持續(xù)發(fā)展的資源，長期地造福人類。

[參考文獻]

[1]李裕紅，頡曉勇，關(guān)杰耀.活化石中國鱟瀕危現(xiàn)狀及搶救性保護宣言[J].濕學(xué)，2018（16）：118-120.

[2]翁朝紅，謝仰杰，肖志群，等.福建及中國其他沿岸海域中國鱟資源分布現(xiàn)狀調(diào)查[J].動物學(xué)雜志，2012（47）：42-50.

[3]李世崇，胡顯文，胥照平.鱟C因子的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用[J].中國生物工程雜志，2003（5）：78-81.

[4]裴宇盛，蔡 ?彤，陳 ?晨，等.微量凝膠法檢查細菌內(nèi)毒素方法學(xué)驗證研究[J].中國新藥志，2018（27）：16-20.

[5]王 ?征.生物制劑內(nèi)毒素檢測新技術(shù)-重組C因子內(nèi)毒素檢測試劑盒的開發(fā)和應(yīng)用[C].北京：第六屆生物技術(shù)藥物理化特性分析與質(zhì)量研究技術(shù)研討會，2018.

[6]裴宇盛，蔡 ?彤，陳 ?晨等.重組C因子法檢測細菌內(nèi)毒素的方法適用性研究[J].中國藥業(yè)，2019（28）：25-28.

[7]張軼嶺，祁 ?靜，張 ?春，等.昆蟲細胞表達鱟C因子內(nèi)毒素活性檢測的研究[J].生物技術(shù)，2017（27）：76-81.

[8]祁 ?靜，劉 ?濤，李 ?珍，等.Bac-to-Bac/BmNPV桿狀病毒在家蠶幼蟲中表達重組鱟C因子[J].生物工程學(xué)報，2014（30）：111-118.

[9]裴宇盛，蔡 ?彤，高 ?華.細菌內(nèi)毒素檢查新方法進展[J].藥物分析雜志，2014（34）：19-22.

[10]裴宇盛，蔡 ?彤，陳 ?晨，等.重組C因子法檢測福沙匹坦二葡甲胺中細菌內(nèi)毒素的方法學(xué)研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2019（36）：5-8.

[11]GRALLERT H，LEOPOLDSEDER S，SCHUETT M，et al.EndoLISA：a novel and reliable method for endotoxin detection[J].Nat Methods，2011（10）：3.

[12]張 ?夢.基于人工抗體的內(nèi)毒素快速檢測方法研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2013.

[13]周卓晟.檢測細菌內(nèi)毒素的酶聯(lián)免疫吸附法及免疫傳感器法的研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2010.