姚佳
【摘 要】探討長鏈非編碼 RNA LINC011614在三陰性乳腺癌中的表達(dá)水平作用。方法:采用實(shí)時(shí)定量PCR方法,檢測(cè)不同乳腺癌細(xì)胞株與正常乳腺上皮細(xì)胞系,乳腺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)量。構(gòu)建敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,采用CCK8、流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)、細(xì)胞克隆及劃痕等功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LINC01614與增殖和遷移能力的變化。結(jié)果:LINC01614 在TNBC細(xì)胞和乳腺癌組織中均明顯高于正常細(xì)胞及癌旁組織;敲低LINC01614后細(xì)胞增殖及遷移能力減弱,細(xì)胞周期阻滯。結(jié)論:LINC01614在乳腺癌中高表達(dá)且參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展,機(jī)制可能與其過表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖,并促進(jìn)轉(zhuǎn)移有關(guān),可作為乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)和治療的潛在靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】三陰性乳腺癌;長鏈非編碼RNA;LINC01614
乳腺癌具有高度異質(zhì)性,是全球女性第二大癌癥相關(guān)死因。我國近10余年發(fā)病率逐年攀升,在一些大中型城市,乳腺癌已然成為嚴(yán)重危害女性健康的最常見惡性腫瘤[1]。目前對(duì)乳腺癌的主要治療手段為手術(shù)治療結(jié)合術(shù)后放化療及內(nèi)分泌治療的綜合治療,尤其是蒽環(huán)類和紫杉醇等抗癌藥為主的化療方案的逐步應(yīng)用,乳腺癌病人術(shù)后的生存率明顯較大提高。然而長期的聯(lián)合化療會(huì)使乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性,進(jìn)展期乳腺癌患者常常因腫瘤對(duì)化療藥物的多藥耐藥,導(dǎo)致化療失敗,腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量和長期生存率。惡性骨腫瘤多發(fā)并難以治愈, 超過一半的晚期前列腺癌和乳腺癌患者會(huì)出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移[2-3]。因此,尋求其他有效的治療手段,已成為目前乳腺癌治療研究的熱點(diǎn)。
乳腺癌是一個(gè)多因素、多基因參與、多階段形成的復(fù)雜的異質(zhì)性疾病,病程中伴隨著有害突變的積累、基因組不穩(wěn)定性的增加、表觀遺傳學(xué)修飾的改變以及眾多癌基因和抑癌基因的功能和表達(dá)異常的分子事件。長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNA , LncRNA)是一類長度超過200個(gè)核苷酸的RNA[4],本身并不編碼蛋白質(zhì),而是以RNA的形式在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種層面上影響基因的表達(dá),與基因沉默、轉(zhuǎn)錄激活、染色體構(gòu)型修飾等密切相關(guān),其表達(dá)異常亦可影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后[5]。目前有研究表明某些LncRNA僅會(huì)編碼幾個(gè)至十幾個(gè)氨基酸的Microprotein,并與特定疾病關(guān)系密切[6]。研究表明,HOTAIR(HOX transcript antisense RNA , HOTAIR)與乳腺癌的預(yù)后,細(xì)胞干性和臨床病理特征相關(guān)[7-8]。而LncRNA LSINCT5則能夠在乳腺癌和卵巢癌中高表達(dá)并且調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖,影響腫瘤的侵襲[9]。LncRNA在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用的機(jī)制初現(xiàn)端倪,但仍有待深入探究。
LINC01614在肺癌中高表達(dá),而敲除LINC01614后可以通過上調(diào)mir-217和下調(diào)foxp1抑制肺腺癌細(xì)胞的進(jìn)展[10-11]。LINC01614在乳腺癌組織中顯著高表達(dá) [12]。有研究報(bào)道LINC01614通過TGFβ和FAK信號(hào)通路參與乳腺癌不良預(yù)后的調(diào)控,一般情況而言不良預(yù)后往往伴隨著腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移[12]。三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)由于腫瘤分化程度低、異質(zhì)性高、侵襲及轉(zhuǎn)移臟。
故本研究圍繞LINC01614與三陰性乳腺癌的增殖及轉(zhuǎn)移展開研究。
1 實(shí)驗(yàn)材料及方法:
1.1 收集本院 2018年 1 月至 2018 年 6月女性乳腺癌患者手術(shù)切除的 10對(duì)癌組織和癌旁組織,均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為三陰性乳腺癌,術(shù)前均未行抗腫瘤治療,手術(shù)切除的組織立即冷凍于-80 ℃以用于提取 RNA。
1.2 細(xì)胞及試劑:正常人乳腺細(xì)胞系MCF10A和人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468購于美國模式培養(yǎng)物保藏所細(xì)胞庫。培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國 BI公司。 RNeasy Mini Kit、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒QuantiTect Reverse Transcription Kit 和 QPCR 試劑盒QuantiTect SYBR Green PCR Kit 購自日本takara公司,LINC01614和內(nèi)參 GAPDH 引物由杭州有康生物公司合成。CCK8及流式周期試劑盒均購于江蘇碧云天生物公司。LINC01614干擾的慢病毒及對(duì)照由上海吉?jiǎng)P基因公司提供。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法:
1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng):乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7)及正常乳腺細(xì)胞系MCF10A使用10%胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)基,均在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3.2 CCK8法檢測(cè):將細(xì)胞打成懸液,密度為2×104個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液。按照每孔100μl的體積接種到96 孔培養(yǎng)板內(nèi),每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置空白組(只加培養(yǎng)基)。將培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),分別在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h和120h時(shí)將原培養(yǎng)基更換含為100μl含10%CCK-8溶液的無血清培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱中孵育1h后,測(cè)定450nm 波長下各孔的光密度(OD)值。所測(cè)各組OD值減去空白組OD值的平均值即為各組的實(shí)際OD值,以24h的OD值為基準(zhǔn)值,計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞的增殖速率(實(shí)際OD值/基準(zhǔn)值×100%)。
1.3.3克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外克隆形成能力:將細(xì)胞打成懸液,按250個(gè)/ml的密度接種含6孔板中,每孔2ml。將培養(yǎng)板置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周,當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí),用4%多聚甲醛固定細(xì)胞后洗去染色液,將6孔板倒置于空氣中干燥。用相機(jī)拍攝每孔克隆形成情況,并用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆,或在顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。
1.3.4 PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期:將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入15ml離心管中,收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml,取1ml單細(xì)胞懸液。加入100%冷乙醇4ml固定,4℃保存過夜。將 Rnase A:PI 工作液按 1:9 體積配制成PI/RNase A染色工作液。染色前用 PBS 洗去固定液,2000rpm離心5min。加入500μl染色液,室溫避光孵育30-60min后上機(jī)檢測(cè)。
1.3.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力:將細(xì)胞接種在6孔板中,待細(xì)胞融合度達(dá)100%時(shí),使用移液器頭垂直劃出3個(gè)間隔,置于含不同干預(yù)因素的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。于0、24和48 h分別拍照,比較劃痕寬度。
1.3.6 RT-qPCR 檢測(cè)LINC01614 表達(dá)組織或細(xì)胞經(jīng) Trizol法提取總 RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA,使用 ABI-7500PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè),并分析計(jì)算其表達(dá)量。引物序列:LINC01614 F: 5′-AACCAAGAGCGAAGCCAAGA-3; R:5′-GCTTGGACACAGACCCTAGC-3′; GAPDH F: 5′-CTGGTAAAGTGGATATTGTTGCCAT-3′; R: 5′-TGGAATCATATTGGAACATGTAAACC-3′。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
使用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù),使用Graphpad Prism 7 軟件制作圖像。所有數(shù)據(jù)均為至少3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均結(jié)果。計(jì)量數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。當(dāng)兩組獨(dú)立樣本滿足正態(tài)分布及方差齊性時(shí),采用t檢驗(yàn),否則采用校正t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 時(shí)認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果:
2.1 LINC01614 在TNBC細(xì)胞和組織中均高表達(dá)
首先在乳腺癌細(xì)胞系中檢測(cè)LINC01614的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)LINC01614在TNBC細(xì)胞系的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于MCF10A(圖1A);接著檢測(cè)TNBC組織中LINC01614的表達(dá)水平,LINC01614在TNBC組織的表達(dá)水平高于癌旁組織(圖1B)。初步說明LINC01614在乳腺癌惡性腫瘤TNBC中是高表達(dá)的,可能與TNBC的增殖與轉(zhuǎn)移相關(guān)。
2.2 LINC01614敲低影響TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231的增殖和凋亡;
敲低LINC01614后MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力變?nèi)?,并出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯情況,G1期細(xì)胞比例增加同時(shí)伴隨著細(xì)胞凋亡變多(圖2B-D);克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證MDA-MB-231敲低后細(xì)胞增殖能力減弱(圖E)
2.3 LINC01614敲低影響TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231遷移
劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低LINC01614是否影響細(xì)胞的遷移,發(fā)現(xiàn)敲低LINC01614后細(xì)胞遷移能力減弱(圖3)
3 討論:
乳腺癌是女性發(fā)病率最高的癌癥,而三陰性乳腺癌 (TNBC) 是乳腺癌中惡性程度最高的一個(gè)亞型,且治療方式極其有限。與其它亞型相比,TNBC患者容易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差。因此,為改善TNBC患者的預(yù)后,亟需進(jìn)一步探索TNBC可能的分子病理學(xué)機(jī)制,以尋找新的診斷標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)[13-14]。LncRNA近年來被發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用,其可通過表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)等多種方式參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲遷移以及腫瘤血管生成等生物學(xué)行為[15-16]。
LINC01614在肺癌中高表達(dá),而敲除LINC01614后可以通過上調(diào)mir-217和下調(diào)foxp1抑制肺腺癌細(xì)胞的進(jìn)展[10-11]。LINC01614通過TGFβ和FAK信號(hào)通路參與乳腺癌不良預(yù)后的調(diào)控。三陰性乳腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移臟器能力強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高,且缺乏有效的治療手段,預(yù)后極差,是乳腺癌臨床治療的重大難題。然而,LINC01614在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及轉(zhuǎn)移相關(guān)性未曾有報(bào)道。
本研究檢測(cè)了三陰性乳腺癌組織及細(xì)胞系中LINC01614的表達(dá)水平,以進(jìn)一步證實(shí)LINC01614在三陰性乳腺癌中的表達(dá)是否上調(diào)。與其他類型腫瘤中的報(bào)道一致,乳腺癌組織的LINC01614水平較正常組織升高。該結(jié)果有力地提示了 LINC01614 作為檢測(cè)三陰性乳腺癌潛在生物標(biāo)記物的可能性。
在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中,敲低LINC01614的表達(dá)后,細(xì)胞增殖能力顯著降低,細(xì)胞周期阻滯于G1期,并且凋亡數(shù)量增加。劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力下降。以上結(jié)果支持 LINC01614參與了三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展,可能是三陰性乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。
綜上所述,LINC01614在三陰性乳腺癌中高表達(dá)且參與了該腫瘤發(fā)生發(fā)展,可作為乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)和治療的潛在靶點(diǎn)。本研究樣本量較少且未評(píng)估該指標(biāo)的不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn),后續(xù)將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行完善。LINC01614通過何種途徑或信號(hào)通路來調(diào)控三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展目前尚不清楚,這將為今后的工作重點(diǎn),后續(xù)將借助體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。
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基金資助:
2017浙江省教育廳課題(Y201738263)