任麗 賈田芊 李興歡 謝曉林 謝曉峰 張德柱 孫靜

摘 要 目的：建立黃花油點(diǎn)草藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：參照2015年版《中國藥典》方法對(duì)藥材樣品的性狀、顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒別，對(duì)其水分、灰分及浸出物進(jìn)行檢查；采用薄層色譜法（TLC）對(duì)藥材樣品中槲皮素、煙花苷進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定藥材樣品中葛根素、對(duì)羥基苯甲酸、煙花苷、阿魏酸、槲皮素、山柰酚的含量。結(jié)果：性狀、顯微鑒別具有專屬性；槲皮素、煙花苷的TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對(duì)照無干擾；10批藥材樣品水分含量范圍為0.61%～1.89%，總灰分含量范圍為6.28%～8.88%，酸不溶性灰分含量范圍為0.76%～1.79%，醇溶性浸出物含量范圍為1.31%～2.00%，水溶性浸出物含量范圍為9.39%～14.27%。葛根素、對(duì)羥基苯甲酸、煙花苷、阿魏酸、槲皮素、山柰酚檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.031 92～0.111 7 μg（r=0.999 6）、0.085 3～0.298 5 μg（r=0.999 5）、0.010 76～0.037 66 μg（r=0.999 8）、0.070 08～0.245 3 μg（r=0.999 8）、0.058 56～0.205 0 μg（r=0.999 4）、0.009 860～0.033 88 μg（r=0.999 4）；定量限分別為1.06、0.47、0.75、1.40、1.20、0.74 ng，檢測限分別為0.36、0.12、0.30、0.53、0.60、0.31 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%；平均加樣回收率分別為101.54%、102.10%、101.46%、103.35%、99.36%、96.85%，RSD分別為1.76%、1.68%、1.56%、1.26%、0.91%、1.96%（n=6）；樣品含量分別為0.017～0.047、0.042～0.140、0.003 8～0.015 0、0.049～0.180、0.024～0.091、0.003 9～0.011 0 mg/g。結(jié)論：所建質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于黃花油點(diǎn)草的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 黃花油點(diǎn)草；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法；水分；灰分；浸出物；葛根素；對(duì)羥基苯甲酸；煙花苷；阿魏酸；槲皮素；山柰酚

Study on Quality Standard of Tricyrtis maculata

REN Li1，JIA Tianqian1，LI Xinghuan1，XIE Xiaolin2，XIE Xiaofeng2，ZHANG Dezhu2，SUN Jing1（1. College of Pharmacy， Shaanxi University of TCM， Shaanxi Xianyang 712046， China； 2. Shaanxi Panlong Pharmaceutical Group Co.， Ltd.， Xi’an 710025， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the quality standard of Tricyrtis maculata. METHODS： The character and microstructure of T. maculata were identified according to the method stated in 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia. The contents of moisture， ash and extract were determined. TLC was used for qualitative identification of quercetin and nicotifiorin in samples. The contents of puerarin， p-hydroxybenzoic acid， nicotiflorin， ferulic acid， quercetin and kaempferol were determined by HPLC. RESULTS： The characters and microscopic identification had specificity. TLC spots of quercetin and nicotifiorin were clear and well-separated without interference from negative control. The water content， total ash content， acid insoluble ash content， alcohol soluble extract and water soluble extract for 10 batches of samples were 0.61%-1.89%，6.28%-8.88%，0.76%-1.79%，1.31%-2.00% and 9.39%-14.27%， respectively. The linear range of puerarin， p-hydroxybenzoic acid， nicotiflorin， ferulic acid， quercetin and kaeniphenol were 0.031 92-0.111 7 μg （r=0.999 6）， 0.085 3-0.298 5 μg （r=0.999 5）， 0.010 76-0.037 66 μg （r=0.999 8）， 0.070 08- 0.245 3 μg （r=0.999 8），0.058 56-0.205 0 μg （r=0.999 4），0.009 860-0.033 88 μg （r=0.999 4）， respectively. The quantitation limits were 1.06， 0.47， 0.75， 1.40， 1.20， 0.74 ng， and the detection limits were 0.36， 0.12， 0.30， 0.53， 0.60， 0.31 ng， respectively. RSDs of precision， stability and repeatability tests were all less than 2%. The average recoveries were 101.54%， 102.10%， 101.46%， 103.35%， 99.36% and 96.85%， respectively； RSDs were 1.76%， 1.68%， 1.56%， 1.26%， 0.91% and 1.96%， respectively （n=6）； the results of the content were 0.017-0.047， 0.042-0.140， 0.003 8-0.015 0， 0.049-0.180， 0.024- 0.091， 0.003 9-0.011 0 mg/g. CONCLUSIONS： The established quality standard can be used for the quality control of T. maculata.

KEYWORDS Tricyrtis maculata； Quality standard； TLC； HPLC； Moisture； Ash； Extract； Puerarin； p-hydroxybenzoic acid； Nicotiflorin； Ferulic acid； Quercetin； Kaempferol

黃花油點(diǎn)草為百合科油點(diǎn)草屬多年生草本植物黃花油點(diǎn)草[Tricyrtis maculata （D.Don） Machride]的干燥根或全草[1]，又名紅酸七、粗柄油點(diǎn)草、山竹花等；其味甘，性平，主要分布于浙江、湖北、陜西、四川等地，多生長在海拔280～2 300 m的山坡林下、路旁等處[2-3]。其具有補(bǔ)肺止咳、理氣活血、散結(jié)、補(bǔ)虛等功效[1]，是陜西省民間用于治療跌打損傷的重要藥材之一。但黃花油點(diǎn)草缺少質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，難以控制其質(zhì)量。為保證用藥的有效性和安全性，筆者認(rèn)為有必要建立黃花油點(diǎn)草的地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期對(duì)該藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。文獻(xiàn)報(bào)道其主要含有酚酸類、黃酮類、甾體類、萜類等成分，現(xiàn)已分離出的成分有甾體類、黃酮類和酚酸類[3]。為了達(dá)到控制黃花油點(diǎn)草質(zhì)量的目的，本文對(duì)黃花油點(diǎn)草的性狀、水分、灰分和浸出物進(jìn)行測定，建立了煙花苷和槲皮素的薄層鑒別方法，測定了對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、葛根素、煙花苷、槲皮素、山柰酚的含量，并根據(jù)6種成分的含量推測其次生代謝產(chǎn)物含量在8月底至9月期間較高，為黃花油點(diǎn)草進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

戴安U-3000型高效液相色譜（HPLC）儀，包括LPG-3400SD型四元梯度泵、WPS-3000型自動(dòng)進(jìn)樣器、VWD-3x00（RS）型檢測器、TCC-3x00（RS）型柱溫箱、Thermo色譜工作站（美國賽默飛世爾公司）；FA2004A型電子分析天平（上海壘固儀器有限公司）；KQ-250DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Leica ICC50W型顯微鏡（北京冠普佳科技有限公司）；ZF-90B型多功能紫外透射儀（上海光豪分析儀器有限公司）；101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠）；SX-2-4馬弗爐（常州市昊江電熱器材制造有限公司）；薄層層析硅膠G板（青島海浪硅膠干燥劑有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

10批黃花油點(diǎn)草均采自陜西省寶雞市太白縣（采收時(shí)間分別為2017年4月20日、4月28日、6月24日、6月29日、7月14日、7月22日、8月10日、8月15日、8月22日、9月12日，編號(hào)：S1～S10），經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王繼濤教授鑒定為百合科植物黃花油點(diǎn)草[Tricyrtis maculata （D.Don） Machride]的干燥全草；葛根素對(duì)照品（批號(hào)：3681-99-0，純度：98%）、對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品（批號(hào)：99-69-7，純度：99%）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：117-39-5，純度：98%）、煙花苷對(duì)照品（批號(hào)：100080-201610，純度：91.9%）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：1135-24-6，純度：98%）、山柰酚對(duì)照品（批號(hào)：520-18-3，純度：98%）均來自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

本品株高50～70 cm，常切成段，長5～10 cm；根為棕黃色，多具須根，根須稍彎曲，質(zhì)堅(jiān)實(shí)稍帶柔韌；莖為圓柱形，表面為棕黃色，莖痕明顯，質(zhì)硬易折斷，斷面中空呈黃白色；葉互生，橢圓形，頂端漸尖；葉正面褐綠色，背面灰綠色，葉脈較密，易破碎；蒴果2.5～3.0 cm，具3棱，黃綠色。藥材性狀見圖1。

2.2 顯微鑒別

2.2.1 莖橫切面 藥材莖橫切面顯微圖見圖2A、2B。由圖2A、2B可見，本品莖表皮細(xì)胞1～2列，排列緊密；其下為厚壁細(xì)胞2～3列，周圍纖維束成環(huán)；基本組織由大量薄壁細(xì)胞組成，其中散有維管束，外圍維管束排列緊密，木質(zhì)部和韌皮部相間排列。

2.2.2 根橫切面 藥材根橫切面顯微圖見圖2C、2D。由圖2C、2D可見，本品根最外層為1列整齊的表皮細(xì)胞，表面附著角質(zhì)層；基本組織由大量疏松的薄壁細(xì)胞組成，類圓形，其中散有維管束；內(nèi)皮層細(xì)胞緊密排列成環(huán)，有明顯的凱氏帶，皮層中木質(zhì)部、韌皮部相間排列。

2.2.3 粉末鑒別 藥材粉末顯微特征圖見圖3。由圖3可見，本品全草粉末為黃綠色，多見非腺毛及其脫落后的疤痕；單細(xì)胞，壁稍厚，棕黃色，部分壁上可見紋理；莖皮碎片可見，略顯棕黃色，莖表皮細(xì)胞表面觀呈多角形、長多角形或長條形；纖維成束，可見紋孔；導(dǎo)管為螺紋和環(huán)紋導(dǎo)管；葉下皮細(xì)胞可見氣孔[1]，葉上皮細(xì)胞呈多邊形或類圓形，壁較厚。

2.3 薄層色譜（TLC）鑒別

取煙花苷、槲皮素對(duì)照品適量，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度均為0.2 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。取各批藥材粉末0.5 g，提取溫度為40 ℃，加甲醇20 mL，超聲（功率：250 W，頻率：100 kHz）處理1 h，過濾，濃縮，干燥，加甲醇10 mL溶解，即得供試品溶液。以甲醇作為陰性對(duì)照溶液。參照2015年版《中國藥典》（一部）TLC法[4]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于硅膠G板上，槲皮素以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5 ∶ 4 ∶ 1，V ∶ V ∶ V）為展開劑，稀鹽酸蒸氣飽和[5-6]，展開，取出，晾干，以2%三氯化鋁乙醇溶液顯色，于105 ℃下烘5 min，于365 nm波長下檢視；煙花苷以乙酸乙酯-甲酸-水（8 ∶ 1 ∶ 1，V ∶ V ∶ V）為展開劑，展開，取出，晾干，以10%硫酸乙醇溶液顯色[7]，于365 nm波長下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖4。

2.4 水分、灰分及浸出物含量檢測

2.4.1 水分 取10批藥材樣品（S1～S10）各適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）通則“0832水分測定法”項(xiàng)下烘干法[8]第二法測定，平行測定3次。結(jié)果顯示，10批藥材樣品水分含量范圍為0.61%～1.89%，平均值為0.89%，按不高于平均值的120%設(shè)限，均符合2015年版《中國藥典》（四部）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（不得超過2.00%）[8]，詳見表1。

2.4.2 總灰分 取10批藥材樣品（S1～S10）各適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）通則“2302總灰分測定法”[8]測定，平行測定3次。結(jié)果顯示，10批藥材樣品總灰分含量范圍為6.28%～8.88%，平均值為7.96%，按不高于平均值的120%設(shè)限，均符合2015年版《中國藥典》（四部）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（不得超過10.00%）[8]，詳見表1。

2.4.3 酸不溶性灰分 取10批藥材樣品（S1～S10）各適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）通則 “2302酸不溶性灰分測定法”[8]測定，平行測定3次。結(jié)果顯示，10批藥材樣品酸不溶性灰分含量范圍為0.76%～1.79%，平均值為1.12%，按不高于平均值的120%設(shè)限，均符合2015年版《中國藥典》（四部）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（不得超過2.00%）[8]，詳見表1。

2.4.4 醇溶性浸出物 取10批藥材樣品（S1～S10）各適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）通則“2201醇溶性浸出物測定法”項(xiàng)下熱浸法[8]測定，平行測定3次。結(jié)果顯示，10批藥材樣品醇溶性浸出物含量范圍為1.31%～2.00%，平均值為1.61%，按不低于平均值的80%設(shè)限，均符合2015年版《中國藥典》（四部）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（不得少于1.00%）[8]，詳見表1。

2.4.5 水溶性浸出物 取10批藥材樣品（S1～S10）各適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）通則“2201水溶性浸出物測定法”項(xiàng)下冷浸法[8]測定，平行測定3次。結(jié)果顯示，10批藥材樣品水溶性浸出物含量范圍為9.39%～14.27%，平均值為11.39%，按不低于平均值的80%設(shè)限，均符合2015年版《中國藥典》（四部）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（不得少于9.00%）[8]，詳見表1。

2.5 葛根素、對(duì)羥基苯甲酸的含量測定

2.5.1 色譜條件 色譜柱：Waters Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.40%磷酸水溶液（15 ∶ 85，V/V）[9-10]；檢測波長：250 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.5.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取葛根素、對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品適量，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲（功率：250 w，頻率：100 kHz）處理10 min使其溶解，加甲醇定容，制成葛根素、對(duì)羥基苯甲酸質(zhì)量濃度分別為0.285、0.205 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。精密吸取上述各單一對(duì)照品溶液0.7、2.6 mL，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備 取藥材樣品粉末10 g，精密稱定，加石油醚脫脂2 h，加70%乙醇400 mL回流提取，提取時(shí)間依次為1 h、30 min[11]，提取液過濾濃縮至10 mL；精密吸取上述濃縮液5 mL，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 空白對(duì)照溶液 以甲醇作為空白對(duì)照。

2.5.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、空白對(duì)照溶液各10 μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖5。由圖5可見，供試品與混合對(duì)照品相應(yīng)的出峰時(shí)間一致，分離度>4，理論板數(shù)以葛根素峰計(jì)不低于10 000，空白對(duì)照對(duì)測定無干擾。

2.5.6 線性關(guān)系考察 取“2.5.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋，制得系列對(duì)照品工作溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各待測成分進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得葛根素、對(duì)羥基苯甲酸回歸方程分別為y=239.868x+11 761（r=0.999 6）、y=792.368x+26 921（r=0.999 5），表明兩者進(jìn)樣量分別在0.031 92～0.111 7、0.085 3～0.298 5 μg范圍內(nèi)時(shí)線性關(guān)系良好。

2.5.7 定量限與檢測限考察 取“2.5.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比為10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測限。結(jié)果，葛根素、對(duì)羥基苯甲酸的定量限分別為1.06、0.47 ng，檢測限分別為0.36、0.12 ng。

2.5.8 精密度試驗(yàn) 取“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S4）適量，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，葛根素、對(duì)羥基苯甲酸峰面積的RSD分別為1.95%、1.98%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.5.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.5.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S4）適量，分別于室溫下放置0、4、6、8、10、12、24 h時(shí)按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，葛根素、對(duì)羥基苯甲酸峰面積的RSD分別為1.86%、1.95%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材樣品粉末（編號(hào)：S4）適量，共6份，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算含量。結(jié)果，葛根素、對(duì)羥基苯甲酸平均含量分別為0.017 2、0.042 5 mg/g，RSD分別為1.09%、1.01%（n=6），表明本方法重復(fù)性好。

2.5.11 加樣回收率試驗(yàn) 取藥材樣品粉末（編號(hào)：S4），共6份，每份約2.5 g，分別加入一定量的葛根素、對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.6 煙花苷、阿魏酸、槲皮素、山柰酚的含量測定

2.6.1 色譜條件 色譜柱：Waters Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.40%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，80%A→75%A；20～85 min，75%A→45%A；85～90 min，45%A→80%A；90～100 min，80%A）；檢測波長：360 nm[12-13]；流速：0.8 mL/min；柱溫：35 ℃[13-15]；進(jìn)樣量：10 μL。

2.6.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取煙花苷、阿魏酸、槲皮素、山柰酚對(duì)照品適量，精密稱定，制成質(zhì)量濃度分別為0.269、0.292、0.122、 0.121 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述各單一對(duì)照品溶液0.6、0.13、 0.07、0.3 mL，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.6.3 供試品溶液的制備 按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。

2.6.4 空白對(duì)照溶液 以甲醇作為空白對(duì)照溶液。

2.6.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取上述供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、空白對(duì)照溶液各10 μL，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖6。由圖6可見，供試品和混合對(duì)照品相應(yīng)的出峰時(shí)間一致，分離度>3，理論板數(shù)以煙花苷峰計(jì)不低于20 000，空白對(duì)照對(duì)測定無干擾。

2.6.6 線性關(guān)系考察 取“2.6.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各待測成分進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得煙花苷、阿魏酸、槲皮素、山柰酚回歸方程分別為y=103.617x+2 106.3（r=0.999 8）、y=57.905x+5 122.7（r=0.999 8）、y=127.471x+18 072（r=0.999 4）、y=384.620x+2 241.9（r=0.999 4），表明四者進(jìn)樣量分別在0.010 76～0.037 66、0.070 08～0.245 3、0.058 56～0.205 0、0.009 860～0.033 88 μg范圍內(nèi)時(shí)線性關(guān)系良好。

2.6.7 定量限與檢測限考察 取“2.6.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比為10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測限。結(jié)果，煙花苷、阿魏酸、槲皮素、山柰酚的定量限分別為0.75、1.40、1.20、0.74 ng，檢測限分別為0.30、0.53、0.60、0.31 ng。

2.6.8 精密度試驗(yàn) 取“2.6.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S10）適量，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，煙花苷、阿魏酸、槲皮素、山柰酚峰面積的RSD分別為1.58%、1.58%、1.90%、1.94%（n=6），表明本方法精密度良好[16]。

2.6.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.6.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S10）適量，分別于室溫下放置0、4、6、8、10、12、24 h時(shí)按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，煙花苷、阿魏酸、槲皮素、山柰酚峰面積的RSD分別為1.64%、1.45%、1.24%、1.78%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材樣品粉末（編號(hào)：S10）適量，共6份，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算含量。結(jié)果，煙花苷、阿魏酸、槲皮素和山柰酚的平均含量分別為0.007 65、0.088 2、0.082 3、0.008 65 mg/g，RSD分別為1.95%、1.75%、1.14%、1.45%（n=6），表明本方法重復(fù)性好。

2.6.11 加樣回收率試驗(yàn) 取藥材樣品粉末（編號(hào)：S10），共6份，每份約1 g，精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表5。

2.6.12 耐用性試驗(yàn) 取藥材樣品粉末（編號(hào)：S10）適量，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別考察不同色譜柱[Waters Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Thermo Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]、流動(dòng)相（水相中磷酸比例為0.30%、0.35%、0.40%）、流速（0.8、0.9、1.0 mL/min）、柱溫（34、35、36 ℃）對(duì)樣品含量測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表6。

2.6.13 樣品含量測定 取10批藥材樣品粉末，約10 g，按“2.6.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算樣品中煙花苷、阿魏酸、槲皮素、山柰酚的含量，結(jié)果見表7。

3 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道，黃花油點(diǎn)草中含有多種黃酮類成分[2-3]。故筆者參考上述文獻(xiàn)選擇煙花苷和槲皮素兩種成分進(jìn)行定性鑒別，并以煙花苷為特性檢測成分、槲皮素為通用性檢測成分。本文采用甲醇提取藥材樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提取溫度低于40 ℃時(shí)煙花苷的TLC斑點(diǎn)較暗，這可能與煙花苷可溶于熱甲醇有關(guān)。槲皮素TLC鑒別分別以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5 ∶ 2 ∶ 1、5 ∶ 4 ∶ 0.5、9 ∶ 3 ∶ 1、5 ∶ 4 ∶ 1， V/V/V）[8，16-17]、氯仿-乙酸乙酯-甲酸（10 ∶ 3 ∶ 1、9 ∶ 3 ∶ 2，V/V/V）、正丁醇-乙酸乙酯-水（4 ∶ 2 ∶ 1，V/V/V）[17]為展開劑時(shí)展開效果均不好，而采用稀鹽酸蒸氣飽和的甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5 ∶ 4 ∶ 1，V/V/V）[5]展開時(shí)斑點(diǎn)清晰。煙花苷TLC鑒別分別以氯仿-甲醇-水（5 ∶ 2 ∶ 0.1、5 ∶ 2 ∶ 0.3、 5 ∶ 2 ∶ 0.2，V/V/V）[14]、乙酸乙酯-甲酸-水（上層）（10 ∶ 1 ∶ 2， V/V/V）[7]為展開劑時(shí)展開效果均不好，而采用乙酸乙酯-甲酸-水（8 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）[17]展開時(shí)效果較好。

本試驗(yàn)嘗試依次用水煎煮、甲醇超聲、80%甲醇回流、70%乙醇回流、石油醚脫脂后70%乙醇回流的方法提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以石油醚脫脂后70%乙醇回流提取可同時(shí)提取出葛根素、對(duì)羥基苯甲酸、煙花苷、阿魏酸、槲皮素、山柰酚，但煙花苷和山柰酚的含量低，可控程度較低，檢測過程中偏差較大，因此筆者認(rèn)為下一步應(yīng)對(duì)黃花油點(diǎn)草進(jìn)行分離，尋找更容易實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制的成分?，F(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)中黃花油點(diǎn)草已確定的化學(xué)成分種類較少，目前確定的化學(xué)成分有葛根素、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸、3-甲氧基槲皮素、β-谷甾醇、槲皮素、山柰酚、煙花苷[1-3，14]。本研究以葛根素、對(duì)羥基苯甲酸、煙花苷、阿魏酸、槲皮素、山柰酚為檢測指標(biāo)，建立了HPLC法測定其6種成分含量的方法。筆者曾采用全波長掃描以及在250、340、225、360 nm波長下檢測發(fā)現(xiàn)，在225、250 nm波長處葛根素、對(duì)羥基苯甲酸、煙花苷、阿魏酸、槲皮素、山柰酚都可出現(xiàn)，雜質(zhì)峰吸收較多，峰形較差，在340 nm波長處對(duì)羥基苯甲酸吸收不明顯，在360 nm波長處溶劑峰較小，因此選擇250、360 nm兩個(gè)波長對(duì)黃花油點(diǎn)草的6種成分進(jìn)行檢測。此外，本試驗(yàn)考察了不同柱溫（25、30、35、36 ℃）對(duì)分離度的影響，結(jié)果柱溫為35 ℃時(shí)，在250 nm波長下葛根素、對(duì)羥基苯甲酸和在360 nm波長下煙花苷、阿魏酸、槲皮素、山柰酚的分離度最好，因此選擇柱溫為35 ℃對(duì)黃花油點(diǎn)草中6種成分進(jìn)行檢測。色譜圖中部分未知成分峰面積所占比例大，因此對(duì)黃花油點(diǎn)草中的其他成分還有待進(jìn)一步確定[18-19]。

含量測定結(jié)果顯示，葛根素、對(duì)羥基苯甲酸含量范圍分別為0.017～0.047、0.042～0.140 mg/g，平均值分別為0.040、0.091 mg/g，按不低于平均值的80%設(shè)限，暫定兩者含量分別不得低于0.032、0.073 mg/g。煙花苷、阿魏酸、槲皮素、山柰酚含量范圍分別為0.003 8～0.015 0、0.049～0.180、0.024～0.091、0.003 9～0.011 0 mg/g，平均值分別為0.006、0.084、0.062、0.006 6 mg/g，按不低于平均值的80%設(shè)限，暫定四者含量分別不得低于0.004 8、0.067、0.050、0.005 3 mg/g。10批樣品測定結(jié)果表明，從表4和表7中得出同一批藥材樣品中葛根素、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、槲皮素的含量接近，差異較小，煙花苷、山柰酚的含量較低，差異較大；10批藥材樣品中葛根素、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸含量相對(duì)較穩(wěn)定，槲皮素、煙花苷、山柰酚含量差異較小，最高含量均為最低含量的3倍左右。根據(jù)采收時(shí)間對(duì)10批藥材中的6種成分含量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，7、8、9月份采收藥材中6種成分的含量升高，9月份采收藥材中6種成分的含量較為穩(wěn)定。這提示隨著時(shí)間的變化藥材本身的次生代謝產(chǎn)物含量也逐漸累積，到8月底至9月份趨于穩(wěn)定，與黃花點(diǎn)油草的正常采收期9月份相吻合。

綜上所述，本文所建質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)全面、可行，可用于黃花油點(diǎn)草的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2018-09-02 修回日期：2019-01-09）

（編輯：余慶華）