芮瑩 徐慶 韋京辰 高恩怡 龔紅菲 唐坤

摘 要 目的：研究苧麻葉不同溶劑萃取物對(duì)甲型流感病毒（H1N1）的體外抑制作用和抗氧化活性，以擴(kuò)大苧麻植物的藥用部位并開發(fā)天然抗病毒、抗氧化藥物。方法：取苧麻葉以95%乙醇提取，分別用水加熱溶解醇提物浸膏，再以不同溶劑分別萃取，制得苧麻葉石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物。考察50～400 μg/mL的苧麻葉水相萃取物對(duì)犬腎細(xì)胞（MDCK）的毒性作用；以利巴韋林為陽性對(duì)照，采用甲型流感病毒（H1N1）攻擊MDCK細(xì)胞，并采用Western blotting法檢測相同質(zhì)量濃度的苧麻葉石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物溶液（均為100 μg/mL），不同質(zhì)量濃度的苧麻葉水相萃取物溶液（50、100、200、400 μg/mL）以及不同質(zhì)量濃度的利巴韋林溶液（0.31、0.63、1.25 μg/mL）對(duì)病毒感染的細(xì)胞中核蛋白（NP）表達(dá)水平。以維生素C為陽性對(duì)照，采用羥基自由基（·OH）清除試驗(yàn)、DPPH自由基清除試驗(yàn)和還原試驗(yàn)考察各相萃取物的體外抗氧化活性。結(jié)果：苧麻葉水相萃取物質(zhì)量濃度在400 μg/mL以內(nèi)時(shí)對(duì)MDCK細(xì)胞無毒性；苧麻葉石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、水相萃取物質(zhì)量濃度在100 μg/mL時(shí)均能顯著降低甲型流感病毒（H1N1）感染的細(xì)胞中NP蛋白表達(dá)水平（P<0.01）；而不同質(zhì)量濃度（50～400 μg/mL）的水相萃取物均能顯著降低NP蛋白表達(dá)水平（P<0.01），且呈一定濃度依賴趨勢(shì)；其石油醚相和乙酸乙酯相萃取物的抗氧化活性與維生素C較為接近。結(jié)論：苧麻葉水相萃取物具有較好的體外抗甲型流感病毒（H1N1）作用；其石油醚相和乙酸乙酯相萃取物表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 苧麻葉；萃取物；甲型流感病毒（H1N1）；核蛋白；抗病毒；抗氧化

Detection of in vitro Inhibitory Effects of Boehmeria nivea Leaves Extracts on Influenza A Virus （H1N1） and Its Antioxidant Activity

RUI Ying1，XU Qing1，WEI Jingchen1，GAO Enyi1，GONG Hongfei1，TANG Kun2（1. School of Pharmacy， Guilin Medical College， Guangxi Guilin 541004， China； 2. Dept. of Pharmacy， the Affiliated Hospital of Guilin Medical College， Guangxi Guilin 541001， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the in vitro inhibitory effects and antioxidant activity of different solvent extracts of Boehmeria nivea leaves against influenza A virus（H1N1）， and to expand the medicinal parts of B. nivea and develop natural antiviral and antioxidant drugs. METHODS： The leaves of B. nivea were extracted with 95% ethanol. The ethanol extract was dissolved by water heating， and extracted with different solvents to obtain petroleum ether phase， trichloromethane phase， ethyl acetate phase， n-butanol phase and aqueous phase extracts of B. nivea leaves. The toxicity of aqueous extract of B. nivea leaves （50-400 μg/mL） on Madin-Darby canine kidney （MDCK） cell line was investigated. Using ribavirin as positive control， MDCK cells were attacked by influenza A virus（H1N1）. Western blotting assay was used to detect the expression of nucleoproteins （NP） in viral infected cells after treated with same concentrations of petroleum ether phase， trichloromethane phase， ethyl acetate phase， n-butanol phase and aqueous phase extracts of B. nivea leaves （100 μg/mL）， different concentrations of aqueous phase extract solution of B. nivea leaves （50， 100， 200， 400 μg/mL） and different concentrations of ribavirin solution （0.31， 0.63， 1.25 μg/mL）. Using vitamin C as a positive control， hydroxyl radical（·OH） scavenging test， DPPH radical scavenging test and reduction test were used to investigate in vitro antioxidant activity of the extracts. RESULTS： Aqueous phase extract of B. nivea leaves with concentration less than 400 μg/mL was nontoxic to MDCK cells. The petroleum ether phase， trichloromethane phase， ethyl acetate phase and aqueous phase extracts at 100 g/mL could significantly reduce the expression of NP protein in influenza A virus（H1N1） infected cells （P<0.01）. Different concentrations （50-400 μg/mL） of aqueous extract could significantly reduce the protein expression of NP （P<0.01） in concentration-dependent manner. The in vitro antioxidant activity of petroleum ether phase and ethyl acetate phase was similar to that of vitamin C. CONCLUSIONS： B. nivea leaves extract have better anti-influenza A virus（H1N1） effects in vitro， and the extracts of petroleum ether phase and ethyl acetate phase show good antioxidant activity in vitro.

KEYWORDS Boehmeria nivea leaves； Extract； Influenza A virus （H1N1）； Nucleoproteins； Antiviral； Antioxidant

苧麻[Boehmeria nivea（Linn.）Gaudich.]是蕁麻科苧麻屬灌木植物，別稱野麻、青麻等，其在我國的產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的90%以上[1]。苧麻的莖和皮是重要的紡織原料，根則是傳統(tǒng)中藥[2]。李時(shí)珍在《本草綱目》中對(duì)苧麻根的藥用功能有著詳細(xì)記載，認(rèn)為其具有解毒、清熱、止血等功效。因苧麻根中含有黃酮及類黃酮、蕓香苷、綠原酸、超氧化物歧化酶（SOD）和多酚等活性成分[1]，故具有抗病毒[3]、抗菌[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]、抗腫瘤[2]等作用。苧麻葉占植株總重約40%，但卻常作為廢棄物不用，造成了其植物藥用資源的浪費(fèi)[1]。為探索苧麻葉是否與苧麻根同樣具有廣泛的藥理活性，本課題組前期研究證實(shí)，苧麻葉提取物具有抗乙型肝炎病毒（HBV）的作用，在體外可明顯抑制乙肝表面抗原、e抗原的表達(dá)并降低HBV的DNA表達(dá)水平[7]。甲型流感病毒（H1N1）近年在全球的蔓延對(duì)人類健康造成了極大危害[8]，其高遺傳變異性導(dǎo)致宿主對(duì)抗病毒藥物具有耐藥性[9]，使得疫苗的防治效果較差。核蛋白（NP）是病毒基因與宿主細(xì)胞蛋白相互作用過程中的重要蛋白，可作為診斷病毒的理想靶蛋白[10]。因此，本課題組通過考察苧麻葉不同溶劑萃取物對(duì)甲型流感病毒（H1N1）的NP蛋白水平表達(dá)的影響，進(jìn)而判斷其對(duì)該病毒的體外抑制作用。此外，機(jī)體代謝會(huì)產(chǎn)生自由基，易對(duì)機(jī)體造成傷害并誘發(fā)慢性疾病，如糖尿病、衰老和腫瘤等[11]，因此尋找天然、安全的抗氧化劑變得越來越重要。已有研究發(fā)現(xiàn)，苧麻根粗提物具有清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化等多種生理作用[12]。因此，本課題組采用經(jīng)典體外抗氧化試驗(yàn)考察苧麻葉不同溶劑萃取物的抗氧化活性。本研究旨在擴(kuò)大苧麻植物的藥用部位，以期為開發(fā)出高效安全、副作用小的天然抗病毒、抗氧化藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

N2300-2E型CO2培養(yǎng)箱（美國Shel Lab公司）；EX40型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；TDL-5型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；YP202型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；YJ-875型醫(yī)用凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；SY11-Ni 型電熱恒溫水浴鍋（北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、RE-52CS 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；UV-2550 型紫外-可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；JS-780型全自動(dòng)凝膠成像分析儀（上海迪奧生物科技有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鄭州中天實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；ELx800型酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BioTek公司）；電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；AFZ-4001-UT型超純化水器（美國Aquapro公司）。

1.2 藥品與試劑

利巴韋林原料藥（廣東肇慶鼎湖藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20111023，純度：99%）；維生素C原料藥（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20160403，純度：≥99.0%）；二苯代苦味?；杂苫鵞DPPH，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：20160407]；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青工程材料有限公司）；雙抗（美國Invi- trogen公司，批號(hào)：15070079）；二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶（美國Sigma公司）；鼠抗NP單克隆抗體（北京安諾倫生物科技有限公司）；GAPDH抗體（南寧市藍(lán)光生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗（北京康為世紀(jì)有限公司）；5×SDS-loading buffer、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；ECL發(fā)光試劑盒（美國Pierce Protein Biology公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；苯甲酰磺酰氟（PMSF，上海Sigma公司）；其余試劑均為分析純（上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司），水為超純水。

1.3 藥材

苧麻葉采于廣西桂林市靈川縣定江鄉(xiāng)，經(jīng)中國科學(xué)院廣西植物研究所黃定忠工程師鑒定為蕁麻科苧麻屬植物苧麻[Boehmeria nivea（Linn.）Gaudich.]的葉。

1.4 病毒株與細(xì)胞株

甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）病毒株由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；犬腎細(xì)胞（MDCK）為廣州醫(yī)學(xué)院呼吸道疾病研究所提供、本實(shí)驗(yàn)室凍存保種。

2 方法

2.1 苧麻葉不同溶劑萃取物的制備

取苧麻葉3.5 kg，置于圓底燒瓶中，加95%乙醇浸沒，70 ℃水浴加熱回流萃取3次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮制得乙醇提取物浸膏（120 g）。將該浸膏以水加熱溶解，分別用等體積的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，合并各自的萃取液，并保留最后的水相。各相萃取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，分別得到石油醚相（13.5 g）、三氯甲烷相（17.5 g）、乙酸乙酯相（12.5 g）、正丁醇相（37.5 g）及水相（17.0 g）的萃取物浸膏。

2.2 苧麻葉不同溶劑萃取物體外抗甲型流感病毒（H1N1）的作用考察

2.2.1 各相萃取物溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下各相萃取物浸膏適量，分別加入DMSO 100 μL溶解，制成質(zhì)量濃度均為5 mg/mL的母液（以浸膏計(jì)），經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，于4 ℃保存、備用。后續(xù)按試驗(yàn)要求以含雙抗的DMEM培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度使用。

2.2.2 陽性藥物溶液的制備 精密稱取利巴韋林原料藥0.50 g，用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成10 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，除菌，分裝后備用。后續(xù)按試驗(yàn)要求以含雙抗的DMEM培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度使用。

2.2.3 藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性考察 參照文獻(xiàn)[13]方法改良后進(jìn)行試驗(yàn)。將MDCK細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.1 mL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中（以下培養(yǎng)條件相同）培養(yǎng)。待細(xì)胞長成單層后，吸棄培養(yǎng)基，加入不同質(zhì)量濃度的苧麻葉水相萃取物[0（空白）、50、100、200、400 μg/mL]或利巴韋林溶液（25 μg/mL），每孔0.1 mL，各組均設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)細(xì)胞并每日觀察其形態(tài)，連續(xù)4 d。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)破碎、固縮、脫落等病變現(xiàn)象者判斷為有毒性，終止試驗(yàn)。按以下標(biāo)準(zhǔn)劃分細(xì)胞的病變程度：細(xì)胞生長正常、無病變發(fā)生（-）；病變細(xì)胞約占整個(gè)單層細(xì)胞的比例≤20%（+）；病變細(xì)胞約占整個(gè)單層細(xì)胞的比例>20%～50%（++）；病變細(xì)胞約占整個(gè)單層細(xì)胞的比例>50%（+++）。以細(xì)胞不出現(xiàn)病變的最小稀釋度為該藥物對(duì)細(xì)胞的無毒界限。

2.2.4 苧麻葉各相萃取物抗甲型流感病毒（H1N1）作用考察 參照文獻(xiàn)[14]方法改良后進(jìn)行試驗(yàn)。將MDCK細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，以5×105個(gè)/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，分別加入相同質(zhì)量濃度的苧麻葉石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物溶液（均為100 μg/mL），不同質(zhì)量濃度的苧麻葉水相萃取物溶液（50、100、200、400 μg/mL）以及不同質(zhì)量濃度的利巴韋林溶液（0.31、0.63、1.25 μg/mL），每孔2 mL，培養(yǎng)2 h；棄去上清，加入100倍半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）的甲型流感病毒（H1N1）懸液2 mL攻擊細(xì)胞2 h后，棄去上清，加入含雙抗的DMEM培養(yǎng)基；另均設(shè)Mock組（細(xì)胞+含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，不進(jìn)行病毒攻擊或藥物處理）和NC組（細(xì)胞+含雙抗的DMEM培養(yǎng)基，進(jìn)行病毒攻擊，但不作藥物處理）作為對(duì)照，每組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

采用Western blotting法檢測細(xì)胞中NP蛋白表達(dá)水平。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.6）洗2次，加入適量冰上預(yù)冷的SDS裂解液與PMSF混合物（100 ∶ 1），冰上裂解30 min；輕輕刮取細(xì)胞并收集至EP管中，4 ℃條件下12 000×g離心5 min；吸棄上清，加入5×SDS-loading buffer，95 ℃加熱5 min進(jìn)行蛋白變性，BCA法測定蛋白濃度。所得蛋白以80 V電泳分離，待其進(jìn)入分離膠后升電壓至120 V繼續(xù)電泳，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后于室溫下在含5%脫脂奶粉的TBST溶液中搖床封閉1 h；棄去封閉液，TBST溶液清洗5 min×5次，將PVDF膜放入鼠抗NP單克隆抗體稀釋液（1 ∶ 1 000）中，4 ℃孵育過夜；TBST清洗5 min×5次，放入二抗稀釋液（1 ∶ 5 000）中，室溫孵育1 h。采用ECL發(fā)光試劑顯色，采用發(fā)光圖像分析器檢測熒光強(qiáng)弱。以Image J 1.46r軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行圖像分析，以GADPH為內(nèi)參計(jì)算相對(duì)灰度值，用來表示蛋白表達(dá)水平。

2.3 苧麻葉各相萃取物體外抗氧化活性的測定

2.3.1 對(duì)羥基自由基（·OH）的清除能力 參照文獻(xiàn)[15]的方法改良后進(jìn)行試驗(yàn)。取“2.1”項(xiàng)下苧麻葉各相萃取物浸膏，加70%乙醇制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 mg/mL（以生藥量計(jì)）的供試溶液；同法配制等質(zhì)量濃度梯度的維生素C陽性對(duì)照溶液。在EP反應(yīng)管中加入6 mmol/L水楊酸乙醇溶液50 μL、6 mmol/L FeSO4溶液（新制）50 μL，再分別加入上述各相萃取物供試溶液或陽性對(duì)照溶液50 μL，最后加入6 mmol/L H2O2溶液50 μL，于37 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)完畢后，4 000 r/min離心3 min，取上清液，在510 nm波長處測定吸光度（A1）。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，以水50 μL代替FeSO4溶液同法操作，測定吸光度（A2）。以70%乙醇作為參比溶液，測定吸光度（A0）。按公式計(jì)算·OH的清除率（P）：P（%）=[A0-（A1-A2）]/A0×100%。

2.3.2 對(duì)DPPH自由基的清除能力 參照文獻(xiàn)[16]的方法改良后進(jìn)行試驗(yàn)。取“2.1”項(xiàng)下苧麻葉各相萃取物浸膏，加70%乙醇制成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL（以生藥計(jì)）的供試溶液；同法配制等質(zhì)量濃度梯度的維生素C陽性對(duì)照溶液。在EP反應(yīng)管中分別加入上述各相萃取物供試溶液或陽性對(duì)照溶液100 μL、0.2 mmol/L DPPH溶液100 μL，搖勻，室溫下置于黑暗處反應(yīng)30 min。以70%乙醇為參比溶液，在517 nm波長處測定各供試品溶液反應(yīng)后的吸光度（A1）；以70%乙醇100 μL代替DPPH溶液，同法反應(yīng)后在517 nm波長處測定吸光度（A2）；以0.2 mmol/L DPPH溶液100 μL代替供試溶液，同法反應(yīng)后在517 nm波長處測定吸光度（A0）。按公式計(jì)算DPPH自由基的清除率（K）：K（%）=[1-（A1-A2）/ A0]×100%。

2.3.3 還原能力 參照文獻(xiàn)[17]的方法改良后進(jìn)行試驗(yàn)。取“2.1”項(xiàng)下苧麻葉各相萃取物浸膏，加70%乙醇制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL（以生藥計(jì)）的供試溶液；同法配制等質(zhì)量濃度梯度的維生素C陽性對(duì)照溶液。在EP反應(yīng)管中分別加入上述各相萃取物供試溶液或陽性對(duì)照溶液0.5 mL、PBS 2.5 mL、1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，于50 ℃反應(yīng)20 min后，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL。3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入水2.5 mL、0.1%氯化鐵溶液1 mL，混勻后反應(yīng)10 min。在700 nm波長處測定吸光度，吸光度越高，則表明藥物還原能力越強(qiáng)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以上試驗(yàn)均重復(fù)3次。采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 苧麻葉各相萃取物的體外抗甲型流感病毒（H1N1）作用

3.1.1 藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性 當(dāng)苧麻葉水相萃取物質(zhì)量濃度為0～400 μg/mL時(shí)，均未對(duì)MDCK細(xì)胞產(chǎn)生毒性；陽性藥物利巴韋林質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)對(duì)MDCK細(xì)胞也無毒性。苧麻葉水相萃取物和利巴韋林對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用見表1。

3.1.2 苧麻葉各相萃取物的抗甲型流感病毒（H1N1）作用 在相同質(zhì)量濃度（100 μg/mL）時(shí)，與苧麻葉其他各相萃取物比較，甲型流感病毒（H1N1）感染的MDCK細(xì)胞經(jīng)水相萃取物處理后NP蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明水相萃取物對(duì)該病毒有較好的抑制作用。進(jìn)一步考察該萃取物不同質(zhì)量濃度（0～400 μg/mL）的作用時(shí)顯示，隨著質(zhì)量濃度的增加，甲型流感病毒（H1N1）感染的MDCK細(xì)胞中NP蛋白表達(dá)水平呈降低趨勢(shì)，且50～400 μg/mL作用后NP蛋白水平較0 μg/mL時(shí)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。利巴韋林不同質(zhì)量濃度（0.31、0.63、1.25 μg/mL）對(duì)甲型流感病毒（H1N1）均有明顯的抑制作用。不同藥物處理后各組細(xì)胞中NP蛋白表達(dá)電泳圖見圖1，蛋白表達(dá)水平見圖2。

3.2 苧麻葉各相萃取物的體外抗氧化作用

3.2.1 對(duì)·OH的清除能力 苧麻葉各相萃取物對(duì)·OH的清除率測定結(jié)果見表2。由表2可知，苧麻葉各相萃取物對(duì)·OH自由基的清除率隨著藥物質(zhì)量濃度的增加而升高，但不同溶劑萃取物的·OH清除率存在較大差異，其中以苧麻葉石油醚萃取物為最高。當(dāng)苧麻葉石油醚萃取物質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，其對(duì)·OH的清除率高達(dá)82.2%，與維生素C接近。其余各相萃取物對(duì)·OH的清除能力相對(duì)較弱，清除率均在25%以下。

3.2.2 對(duì)DPPH的清除能力 苧麻葉各相萃取物對(duì)DPPH的清除率測定結(jié)果見表3。由表3可知，苧麻葉各相萃取物對(duì)DPPH自由基均有一定的清除效果，但彼此之間差異較大。其中苧麻葉乙酸乙酯相萃取物質(zhì)量濃度在0.15 mg/mL以上時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率與維生素C較為接近，且高于其余各相萃取物；石油醚相萃取物對(duì)DPPH自由基的清除率遠(yuǎn)低于其余各相萃取物；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時(shí)，石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相萃取物和維生素C對(duì)DPPH的清除率分別為41.47%、67.30%、93.87%、82.33%、74.79%、96.82%。

3.2.3 苧麻葉各相萃取物的還原能力 苧麻葉各相萃取物的還原能力測定結(jié)果見表4。由表4可知，苧麻葉各相萃取物的還原能力均隨藥物質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，其中乙酸乙酯相萃取物還原能力明顯強(qiáng)于其余各相萃取物，并與維生素C最為接近。其還原能力排序?yàn)椋壕S生素C>乙酸乙酯相萃取物>正丁醇相萃取物>三氯甲烷相萃取物>石油醚相萃取物>水相萃取物。

4 討論

苧麻目前主要作為原料用于紡織工業(yè)，其莖皮是優(yōu)良的紡織原料，而苧麻葉作為工業(yè)廢棄品被丟棄，這不僅浪費(fèi)了資源，對(duì)環(huán)境也造成了污染，因此有必要對(duì)苧麻葉進(jìn)行更深入的開發(fā)利用。除了本課題組曾證實(shí)苧麻葉具有體外抗HBV的作用外[7]，目前對(duì)苧麻葉相關(guān)藥理活性的研究開展較少。

甲型流感病毒基因組為8個(gè)節(jié)段的單股負(fù)鏈 RNA，可分別編碼不同的蛋白，其中流感病毒NP蛋白由第5節(jié)段編碼，是流感病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白[18]。NP蛋白參與病毒RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，也是病毒基因與宿主細(xì)胞蛋白相互作用過程中的重要蛋白；而且其抗原性穩(wěn)定，不會(huì)發(fā)生抗原漂移，可作為診斷甲型流感病毒的理想靶蛋白[10]。本研究結(jié)果顯示，以100 μg/mL的苧麻葉各相萃取物處理甲型流感病毒（H1N1）感染的MDCK細(xì)胞后，水相萃取物組細(xì)胞中NP蛋白表達(dá)水平最低，說明其對(duì)該病毒的體外抑制作用最好，效果與陽性藥利巴韋林接近。細(xì)胞毒性試驗(yàn)考察結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度升高至400 μg/mL時(shí)，苧麻葉水相萃取物仍未對(duì)MDCK細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，表明其對(duì)MDCK細(xì)胞毒性較弱，具有開發(fā)為藥物的潛力；且隨著質(zhì)量濃度的增加（50～400 μg/mL），病毒感染的細(xì)胞中NP蛋白表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，提示水相萃取物對(duì)甲型流感病毒（H1N1）的體外抑制作用較好且呈一定的劑量依賴趨勢(shì)。

機(jī)體在生命活動(dòng)過程中產(chǎn)生的羥基自由基是導(dǎo)致有機(jī)大分子如DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等氧化損傷的主要原因，且已有研究表明機(jī)體內(nèi)自由基積累過多與癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化及其他心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而抗氧化劑可有效清除自由基，對(duì)抗上述病理變化過程[19]。 ·OH是活性氧中最活潑、毒性最大的自由基之一，對(duì)機(jī)體內(nèi)各種生物大分子如糖類、核酸、脂質(zhì)及氨基酸等均可產(chǎn)生損害，因而清除·OH對(duì)于活細(xì)胞體系而言相當(dāng)重要[12]。DPPH自由基在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定且在517 nm波長處有強(qiáng)吸收峰[20]，因此可通過自由基清除劑加入后吸光度值的降低程度來評(píng)價(jià)藥物對(duì)DPPH自由基的清除效果，并以此來評(píng)價(jià)其抗氧化能力。在還原反應(yīng)中，鐵氰化鉀中的Fe3+被抗氧化試劑還原為Fe2+，在700 nm波長處的吸光度值越高，則藥物的還原能力越強(qiáng)，即表示其抗氧化能力越強(qiáng)[20]。本研究結(jié)果顯示，在苧麻葉各相萃取物中，以石油醚相萃取物對(duì)·OH的清除能力最強(qiáng)，乙酸乙酯相萃取物對(duì)DPPH自由基的清除能力及還原能力最強(qiáng)。

中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)是各種活性成分，其作用靶點(diǎn)多，表現(xiàn)出多重效應(yīng)，因此苧麻葉萃取物的抗病毒及抗氧化活性是由不同有效功能組分組合作用的結(jié)果。但目前尚未分離鑒定出具體的有效成分，尚需進(jìn)一步對(duì)苧麻葉萃取物進(jìn)行分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定，以獲得明確的活性單體成分，并進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索其抗病毒及抗氧化的藥效作用及機(jī)制，以期將苧麻葉開發(fā)為治療甲型流感病毒（H1N1）感染的候選藥物和天然抗氧化劑。

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（收稿日期：2018-03-01 修回日期：2019-03-03）

（編輯：段思怡）