朱惠霞 陶興林 劉明霞

摘要：以松花菜F1代雜交種為材料，分別觀察自然發(fā)育和游離培養(yǎng)條件下小孢子的發(fā)育過(guò)程。結(jié)果表明，自然條件下，四分體釋放小孢子后，單核小孢子經(jīng)歷2次分裂，從雙核期到三核期，最后發(fā)育為成熟花粉粒，是配子體發(fā)育途徑;在游離培養(yǎng)條件下，小孢子經(jīng)過(guò)熱激（33 ℃）處理后，發(fā)生均等分裂或者不均等分裂，之后經(jīng)過(guò)一系列的細(xì)胞增殖，最終發(fā)育成為胚狀體，小孢子發(fā)育途徑是從配子體向胚胎發(fā)育轉(zhuǎn)換的途徑。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，并不是所有發(fā)生了分裂和增殖的細(xì)胞都能形成胚狀體，只有極少數(shù)小孢子最終形成正常胚。

關(guān)鍵詞：松花菜;小孢子;細(xì)胞學(xué)觀察

中圖分類(lèi)號(hào)：S653.3? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1001-1463（2019）08-0008-04

Abstract：Used the loose-curd cauliflower F1 hybrids as study material， microspore development process of in vivo was observed under natural development and free culture conditions， respectively. The results showed that under natural conditions， after the tetrad releases microspore， the mononuclear microspore undergoes two divisions， from binuclear to trinuclear stage， and finally develops into mature pollen grains， which is the way of gametophyte development. Under the condition of free culture， microspore undergoes equal or unequal division after heat shock treatment（33 ℃）. After a series of cell proliferation， microspore eventually develops into embryoid. The microspore development pathway is from gametophyte to embryo. At the same time， it was found that not all cells that divide and proliferate can form embryoids， only a few microspores eventually form normal embryos.

Key words：Loose-curd cauliflower;Microspore;Cytological observation

松花菜是十字花科甘藍(lán)屬花椰菜的一個(gè)類(lèi)型，其外形特點(diǎn)為花層薄蕾枝長(zhǎng)，花球膨大時(shí)呈松散狀，松花菜外形美觀、營(yíng)養(yǎng)豐富，葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素、可溶性糖含量均高于普通花椰菜[1 ]。食用時(shí)口感甜脆，風(fēng)味鮮美、深受消費(fèi)者喜愛(ài)。目前我國(guó)松花菜種植面積已達(dá)10萬(wàn)hm2以上[2 ]， 正逐步替代傳統(tǒng)緊實(shí)型花椰菜，成為新的消費(fèi)類(lèi)型。目前游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)已普遍應(yīng)用于松花菜新品種的選育過(guò)程[3 - 5 ]，該技術(shù)純合速度快，可以大大縮短育種年限、豐富育種資源，是一種快速、高效的育種途徑。但游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)除受材料基因型影響外，還易受培養(yǎng)過(guò)程中不確定因素的影響[6 - 7 ]。我們對(duì)松花菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)和胚胎發(fā)生過(guò)程進(jìn)行研究，對(duì)游離培養(yǎng)過(guò)程中小孢子的發(fā)育情況進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，以明確小孢子發(fā)育時(shí)期與細(xì)胞形狀及花蕾長(zhǎng)度的關(guān)系，為進(jìn)一步提高松花菜小孢子培養(yǎng)效率提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料

供試材料為甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所花椰菜課題組引進(jìn)的松花菜F1代雜交種雪美65。于2017年8月25日育苗， 9月30日定植于皋蘭日光溫室，常規(guī)管理。12月下旬植株抽薹開(kāi)花，選取健壯植株上的花蕾，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察和游離小孢子培養(yǎng)。

1.2? ?方法

1.2.1? ? 小孢子發(fā)育過(guò)程觀察? ? ?利用DAPI（4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽）熒光染色法觀察小孢子發(fā)育時(shí)期。DAPI染色液的配制參照孫繼峰等[8 ]的方法，稱取5 mg的DAPI，加入5 mL ddH2O溶解，配成1 mg/mL的母液，用離心管分裝后置于-24 ℃冰箱保存。將完全溶化后的染色液用ddH2O稀釋成10 μg/μL的工作液，選取不同大小的花蕾，用鑷子小心摘取2～3枚花藥，置于滴有DAPI染液的載破片上，輕輕擠壓出花粉，挑出雜質(zhì)，蓋上蓋玻片，在避光條件下染色10 min，用Olympus CKX53熒光倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，隨機(jī)觀察5個(gè)視野。觀察游離培養(yǎng)小孢子發(fā)育時(shí)期時(shí)，取1個(gè)培養(yǎng)皿小孢子培養(yǎng)液在1 000 r/min條件下離心5 min，取1滴沉淀于載玻片上，加1滴DAPI染色10 min后進(jìn)行觀察，也可直接將培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡下觀察。

1.2.2? ? 小孢子分離與培養(yǎng)? ? 選取單核靠邊期的花蕾，用75%的乙醇消毒30 s，之后用7%的次氯酸鈉溶液消毒10～12 min，再用無(wú)菌水沖洗3次，每次3～5 min。將花蕾放入無(wú)菌小燒杯中，加入適量B5液體培養(yǎng)基，用玻璃棒輕輕擠壓，使小孢子游離到溶液中，用350目孔徑尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液在1 000 r/min條件下離心3次，每次5 min。最后1次離心后將沉淀懸浮于NLN-13（pH=5.9）培養(yǎng)基中，調(diào)整小孢子密度為10×104個(gè)/mL，分裝到60 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿加4 mL懸浮液（每皿約為4個(gè)花蕾），并加入100 uL的活性炭（1.0 g/L）。在33 ℃熱激培養(yǎng) 24～48 h后轉(zhuǎn)入25 ℃恒溫箱暗培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每天觀察小孢子發(fā)育情況，當(dāng)肉眼可見(jiàn)胚狀體時(shí)轉(zhuǎn)入搖床（60 r/min）震蕩培養(yǎng)，約20 d后形成子葉型胚。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?松花菜小孢子體內(nèi)發(fā)育過(guò)程

觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)育初期花粉母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成四分體（圖1-A）;然后小孢子從四分體中釋放出來(lái)，形成體積較小的單核小孢子，此時(shí)花粉壁較薄，細(xì)胞核位于中央，外形呈梅花形（圖1-B）。此后，小孢子逐漸生長(zhǎng)，細(xì)胞壁開(kāi)始加厚，內(nèi)部形成大液泡，細(xì)胞核靠近邊緣，為單核靠邊期;外形為不明顯的三棱狀（圖1-C），此時(shí)是進(jìn)行松花菜小孢子培養(yǎng)的適宜時(shí)期。隨著花蕾的發(fā)育，小孢子形狀接近正圓，進(jìn)入雙核早期，具有1大1小2個(gè)細(xì)胞核。此后生殖核分裂成2個(gè)精核，小孢子進(jìn)入三核期（圖1-D），較大的為營(yíng)養(yǎng)核，染色質(zhì)松散，DAPI染色后亮度較弱;較小的2個(gè)為生殖核，染色后亮度較高，體積由圓形變?yōu)闄E圓，形成熟花粉粒。在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中，小孢子的大小、形態(tài)以及染色深淺明顯不同，這為準(zhǔn)確判斷小孢子發(fā)育時(shí)期和精確取樣提供了依據(jù)。

2.2? ?小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾大小的關(guān)系

細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，松花菜小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾長(zhǎng)度大小的關(guān)系基本為：四分體時(shí)期1.00～1.80 mm;單核中期1.81～2.59 mm;單核靠邊期2.60～3.60 mm;雙核期3.61～4.20 mm;成熟期4.21 mm以上。在松花菜小孢子培養(yǎng)中，處于單核靠邊期至雙核早期的小孢子才具備胚狀體發(fā)生能力。在本研究條件下，處于2.90～3.80 mm的花蕾中單核靠邊期小孢子所占比例較大，在此范圍內(nèi)精確取樣更易獲得較高的出胚率。但不同品種花蕾略有差異，因此花蕾長(zhǎng)度不能作為取樣的唯一標(biāo)準(zhǔn)。

2.3? ?游離培養(yǎng)小孢子發(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察

經(jīng)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)之前的新鮮小孢子發(fā)育整齊一致，大小相同，形狀為不明顯三棱狀或基本接近圓形（圖2-A）。培養(yǎng)皿置于33 ℃黑暗條件下熱激培養(yǎng)1～2 d后，部分小孢子體積膨大，部分小孢子對(duì)熱擊反應(yīng)不敏感，未發(fā)生膨大（圖2-B）。膨大細(xì)胞在培養(yǎng)2～3 d內(nèi)發(fā)生第1次分裂，分裂方式一般為對(duì)稱分裂和不對(duì)稱分裂，發(fā)生對(duì)稱分裂時(shí)形成2個(gè)體積大小相同的細(xì)胞（圖2-C）;發(fā)生不對(duì)稱分裂時(shí)形成2個(gè)體積不同的細(xì)胞（圖2-D）。之后經(jīng)過(guò)多次分裂和細(xì)胞增殖（圖2-E）。培養(yǎng)28 d左右時(shí)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)白色胚狀體，大多為心形胚（圖2-F）。將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到搖床上（60 r/min）培養(yǎng)3～5 d之后，發(fā)育成子葉形胚（圖2-G）。將培養(yǎng)的子葉胚轉(zhuǎn)接在B5固體培養(yǎng)基上12～21 d后，部分胚可直接分化成苗，部分形成愈傷組織進(jìn)行再分化，分化好的小苗轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)7～14 d即長(zhǎng)成幼苗。

2.4? ?游離小孢子培養(yǎng)過(guò)程的細(xì)胞學(xué)觀察

觀察發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過(guò)程中，游離小孢子經(jīng)過(guò)一系列的分裂和增殖過(guò)程，最終形成小孢子胚。但不是所有小孢子都能形成胚胎，部分小孢子在熱擊后并不發(fā)生膨大，有一些只發(fā)生體積膨大而細(xì)胞核不進(jìn)行增殖（圖3-A）;有一些發(fā)生分裂和增殖，在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)形成3細(xì)胞和4細(xì)胞以及多細(xì)胞團(tuán)（圖3-B、C、D），但培養(yǎng)多日也未發(fā)育成胚狀體，細(xì)胞壁不發(fā)生破裂。觀察還發(fā)現(xiàn)，小孢子胚在培養(yǎng)過(guò)程的任何時(shí)候都可能停止發(fā)育，只有極少數(shù)膨大細(xì)胞最終形成胚狀體。

3? ?小結(jié)與討論

本研究通過(guò)DAPI熒光染色和普通光學(xué)顯微觀察比較了自然條件和游離培養(yǎng)條件下小孢子的發(fā)育過(guò)程。結(jié)果表明，自然條件下，正?；ǚ坌℃咦影l(fā)育是配子體發(fā)育途徑，單核小孢子進(jìn)行2次減數(shù)分裂，最終形成具有3個(gè)核的成熟花粉粒。游離培養(yǎng)小孢子胚胎發(fā)生的途徑是：小孢子在熱擊處理后膨大，之后發(fā)生均等分裂或不均等分裂產(chǎn)生2細(xì)胞，再經(jīng)一系列分裂增殖過(guò)程形成胚狀體。在胚胎發(fā)生過(guò)程觀察中發(fā)現(xiàn)，有一些小孢子只發(fā)生體積膨大，細(xì)胞核不進(jìn)行增殖;有一些發(fā)生增殖，在培養(yǎng)過(guò)程中能夠形成3細(xì)胞和4細(xì)胞以及多細(xì)胞團(tuán)，但細(xì)胞壁不發(fā)生破裂，最終只有極少數(shù)膨大細(xì)胞最終形成正常胚狀體，這大大影響了松花菜小孢子培養(yǎng)的成功率。即使發(fā)生了膨大和增殖的小孢子，在培養(yǎng)過(guò)程的任何時(shí)候都有可能停止發(fā)育，導(dǎo)致這些小孢子胚胎停止發(fā)育的原因目前還不明確，因此，松花菜小孢子培養(yǎng)過(guò)程中造成細(xì)胞的停止發(fā)育的原因，以及繼續(xù)改善培養(yǎng)條件，促進(jìn)小孢子胚胎的發(fā)生，提高成胚率，是今后研究的重點(diǎn)。

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（本文責(zé)編：楊? ? 杰）