蘇海蘭 鄭梅霞 朱育菁 單寄坪

摘?要：【目的】分析水稻田、山垅和林下3種種植模式七葉一枝花土壤中芽胞桿菌資源多樣性，為七葉一枝花的栽培提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎梦妩c(diǎn)采樣法，分別采集水稻田、山垅田與林下種植模式七葉一枝花根際土壤與非根際土壤樣本6份，采用涂布法分離芽胞桿菌，采用16S rRNA基因同源性將其鑒定?！窘Y(jié)果】一共分離獲得了87株芽胞桿菌，13個(gè)屬、35個(gè)種，分別屬于芽胞桿菌屬Bacillus的16個(gè)種、賴氨酸芽胞桿菌屬Lysinibacillus、類芽胞桿菌屬Paenibacillus和假單胞菌屬Pseudomonas的各3個(gè)種、Bhargavaea、短桿菌屬Brevibacterium、Burkholderia、短芽胞桿菌屬Brevibacillus、代夫特菌屬Delftia、Paenarthrobacter、節(jié)桿菌屬Arthrobacter、伯克氏菌屬泛菌屬Pantoea、假單胞菌屬Pseudomonas的各1個(gè)種。根據(jù)分離頻度分析得知，七葉一枝花土壤中的芽胞桿菌優(yōu)勢菌群為圖瓦永芽胞桿菌B. toyonensis和假蕈狀芽胞桿菌B. pseudomycoides。其中，水稻田種植模式土壤中的芽胞桿菌的數(shù)量最多，且Margalef、Shannon-Wiener、Pielou和Simpson多樣性指數(shù)都最高。七葉一枝花根際土壤中的芽胞桿菌數(shù)量均大于非根際土壤?！窘Y(jié)論】水稻田蘊(yùn)藏著豐富的芽胞桿菌種類和數(shù)量，多樣性高，在七葉一枝花的種植中具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞： 芽胞桿菌;七葉一枝花;種植模式;多樣性;分離頻度

中圖分類號(hào)：Q 938文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384（2019）08-974-11

Abstract：【Objective】Distribution and diversity of Bacillus-like bacteria in soil of Paris polyphylla cultivation fields were studied. 【Method】 Using the five-points sampling methodology， soil specimens were collected from the rhizosphere and non-rhizosphere on the rice paddy， mountain ridge， and understory fields in Nanping， Fujian where P. polyphylla was cultivated. The bacteria were isolated using smear culture on petri dishes followed by 16S rRNA gene sequencing for identification. 【Result】 Of the 87 isolates obtained from 6 soil specimens， 35 belonged to 13 genera of Bacillaceae. They included 16 species of Bacillus， 3 species each of Lysinibacillus， Paenibacillus， and Pseudomonas， and one species each of Bhargavaea， Brevibacterium， Burkholderia， Brevibacillus， Delftia， Paenarthrobacter， Arthrobacter， Pantoea， and Pseudomonas. According to the frequencies of these microbes appeared in the isolation process， the dominant Bacillus spp. in the cultivation soils were B. toyonensis and B. pseudomycoides. Among the different field types， the paddy soil held the greatest quantity of Bacillus spp. as well as the highest Margalef， Shannon-Wiener， Pielou， and Simpson diversity indices. And， the rhizosphere soil was richer in the population than non-rhizosphere soil at all sites. 【Conclusion】 Paddy soil was rich and diverse in Bacillus-like bacteria which would benefit the cultivation of P. polyphylla.

Key words：Bacillus spp.; Paris polyphylla; cultivation fields; diversity; isolation frequency

0?引言

【研究意義】植物根際是土壤-植物生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)交換的環(huán)境，土壤細(xì)菌既是土壤微生物區(qū)系的重要組成部分，也是土壤物質(zhì)流和能量流的主要推動(dòng)者，其中芽胞桿菌抗逆性強(qiáng)，是土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢微生物種群[1]。七葉一枝花具有止血、鎮(zhèn)靜止痛和免疫調(diào)節(jié)等作用，隨著需求量日益增加，人工栽培是解決七葉一枝花供需矛盾和保護(hù)野生資源的有效途徑[2]。其中，地理環(huán)境、栽培條件及根際土壤微生物數(shù)量影響七葉一枝花的生長及藥用價(jià)值[2-4]。藥用植物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物很豐富，在其生長過程中很容易將這類物質(zhì)釋放到土壤中，從而引起藥用植物根際土壤理化性質(zhì)的改變，導(dǎo)致根際微生物和土壤酶活性較非根際有更大的變化[5]。七葉一枝花與根際土壤微生物共生[1]，生產(chǎn)上七葉一枝花的栽培需要良好的土壤微生態(tài)環(huán)境，為此研究適宜七葉一枝花栽培模式的芽胞桿菌多樣性群落對(duì)促進(jìn)生產(chǎn)具體重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】崔瑩等[6]報(bào)道八門灣紅樹林土壤樣品中Bacillus為優(yōu)勢屬;周秋平等[7]報(bào)道熱帶雨林土壤樣品中其中優(yōu)勢屬為Bacillus;葛慈斌等[8]報(bào)道武夷山自然保護(hù)區(qū)土壤樣品中Bacillus為優(yōu)勢屬?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】七葉一枝花土壤中芽胞桿菌細(xì)菌群落的多樣性研究較少，不同生境的七葉一枝花根際與非根際細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)及多樣性分析比較有待闡明?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究對(duì)福建省南平地區(qū)水稻田、山垅和林下3種不同種植模式下七葉一枝花根際與非根際土壤芽胞桿菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行初步研究，了解七葉一枝花與土壤微生物之間的相互作用，為探討通過調(diào)控土壤微生物實(shí)現(xiàn)七葉一枝花優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

土壤樣品于2018年5月采集于福建省南平市光澤縣福建承天農(nóng)林科技發(fā)展有限公司七葉一枝花水稻田、山垅田與林下3種種植模式七葉一枝花根際土與非根際土壤，采用5點(diǎn)采樣法采集，裝入滅菌袋，采集后馬上帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)風(fēng)干、過篩后，裝瓶保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2?土壤中細(xì)菌的分離與保存

稱取土壤樣品10 g，加入到裝有90 mL無菌水的錐形瓶（150 mL）內(nèi)，振蕩30 min后，80℃水浴10 min，中間震蕩2～3次，即制成10-1土壤懸液，再逐級(jí)稀釋至10-2、10-3;吸取各梯度的土壤懸液100 μL，分別滴加到LB培養(yǎng)基平板上，溶液滴至平板中央，用無菌涂布棒涂勻并靜置1 h，使溶液完全滲透進(jìn)平板，每個(gè)濃度梯度3個(gè)重復(fù)。涂布后的平板30℃恒溫培養(yǎng)2 d，根據(jù)各平板上菌落的形態(tài)、大小、顏色、表明干濕情況、邊緣狀態(tài)和透明度等特征區(qū)分不同的菌落類別，分別編號(hào)和統(tǒng)計(jì)數(shù)量，挑取不同類型的單菌落在新的LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化，直至獲得純培養(yǎng)，保存?zhèn)溆?。每克土壤中芽胞桿菌的數(shù)量=同一稀釋度的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/土壤克數(shù)。

1.3?分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

參照葛慈斌等[8]的方法，對(duì)獲得純培養(yǎng)的不同菌落類型芽胞桿菌進(jìn)行DNA提取和16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物由上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將測得的序列在Ez Taxon （http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/）進(jìn)行比對(duì)，初步確定各菌株的分類地位;并結(jié)合各菌株的菌落形態(tài)及方法1.2中對(duì)不同類型菌落的計(jì)數(shù)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)每個(gè)土壤樣品中分離出的同一種芽胞桿菌的數(shù)量及3個(gè)地點(diǎn)所有土壤樣品中分離出芽胞桿菌的種類和數(shù)量。根據(jù)對(duì)分離得到的芽胞桿菌16S rRNA基因序列測定的結(jié)果，選取不同芽胞桿菌的16S rRNA基因序列，并選擇相關(guān)參考菌株（模式菌株）的相應(yīng)基因序列，經(jīng)Clustal X對(duì)齊后，用軟件Mega 6.0進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4?生境分布多樣性分析

分離頻度是指某種芽胞桿菌在某個(gè)種植模式土壤樣品中被分離到的頻率，即分離頻度/%=（某個(gè)種出現(xiàn)的樣品數(shù)/總樣品數(shù)）×100。分離頻度大于50%為優(yōu)勢種，介于30%～50%的為最常見種，介于10%～30%的為常見種，小于10%的為稀有種。根據(jù)對(duì)芽胞桿菌進(jìn)行鑒定的結(jié)果，統(tǒng)計(jì)所有種類芽胞桿菌在不同種植模式土壤樣品中的分離頻度和數(shù)量，分析其生境分布的多樣性。

1.5?群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

采用常用的多樣性指數(shù)[9]計(jì)算公式如下：

其中，S表示某個(gè)種植模式土壤中細(xì)菌的種類數(shù)，N表示某個(gè)種植模式土壤中芽胞桿菌的總量，Pi表示第i種芽胞桿菌的數(shù)量占該種植模式土壤中芽胞桿菌總數(shù)的比例（即Pi=Ni/N，Ni為第i種芽胞桿菌的數(shù)量）。

2?結(jié)果與分析

2.1?細(xì)菌種類采集與鑒定

從水稻田、山垅田、林下采集的6份土壤樣品中分離、保存芽胞桿菌87株;經(jīng)16S rRNA基因序列測定、比對(duì)，可初步將這87個(gè)菌株鑒定為13個(gè)屬35個(gè)種（表1），其中部分典型的芽胞桿菌的菌落形態(tài)如圖1所示。在這35個(gè)種中，芽胞桿菌屬的種最多，有16種，占種總數(shù)的45.71%;其次是賴氨酸芽胞桿菌屬Lysinibacillus、類芽胞桿菌屬Paenibacillus和假單胞菌屬Pseudomonas各有3種;Bhargavaea、短桿菌屬Brevibacterium、Burkholderia、短芽胞桿菌屬Brevibacillus、代夫特菌屬Delftia、Paenarthrobacter、節(jié)桿菌屬Arthrobacter、伯克氏菌屬泛菌屬Pantoea、假單胞菌屬Pseudomonas均只有1種。

在水稻田七葉一枝花的非根際土（SDF）分離到17株細(xì)菌，含4個(gè)屬，12個(gè)種。其中，芽胞桿菌屬8個(gè)種：高地芽胞桿菌B. altitudinis、阿氏芽胞桿菌B. aryabhattai、扁平芽胞桿菌B. depressus、鉆特省芽胞桿菌B. drentensis、太平洋芽胞桿菌B. pacificus、圖瓦永芽胞桿菌B. toyonensis、短桿菌Brevibacterium frigoritolerans、假蕈狀芽胞桿菌B. pseudomycoides;賴氨酸芽胞桿菌屬2個(gè)種：賴氨酸芽胞桿菌L. mangiferihumi 和L. fusiformis;短芽胞桿菌屬1個(gè)種：耐寒芽胞桿菌B. frigoritolerans;Paenarthrobacter的1個(gè)種：P. ilicis;類芽胞桿菌屬1個(gè)種：P. silvae。

在水稻田七葉一枝花的根際土（SDG）分離到18株芽胞桿菌，含3個(gè)屬，14個(gè)種。其中，芽胞桿菌屬10個(gè)種：圖瓦永芽胞桿菌B. toyonensis、假蕈狀芽胞桿菌B. pseudomycoides、阿氏芽胞桿菌B. aryabhattai、高地芽胞桿菌B. altitudinis、白色桿菌B. albus、泰門芽胞桿菌B. timonensis、鉆特省芽胞桿菌B. drentensis、B. mobilis、科研中心芽胞桿菌B. cecembensis和扁平芽胞桿菌B. depressus;類芽胞桿菌屬2個(gè)種：樂金類芽胞桿菌P. elgii和蜂房類芽胞桿菌P. alvei;賴氨酸芽胞桿菌屬2個(gè)種：解木糖賴氨酸芽胞桿菌L. xylanilyticus和紡錘形賴氨酸芽胞桿菌L. fusiformis。

在林下七葉一枝花的非根際土（LXF）分離到12株芽胞桿菌，含6個(gè)屬，8個(gè)種。其中，芽胞桿菌屬3個(gè)種：B. paramycoides、B. proteolyticus和圖瓦永芽胞桿菌B. toyonensis;代夫特菌屬1種：胡生代夫特菌D. lacustris;賴氨酸芽胞桿菌屬1個(gè)種：解木糖賴氨酸芽胞桿菌L. xylanilyticus;類芽胞桿菌屬1個(gè)種：蜂房類芽胞桿菌P. alvei;短芽胞桿菌屬1種：側(cè)胞短芽胞桿菌B. laterosporus;伯克氏菌屬1種：穩(wěn)定伯克霍爾德菌B. stabilis。

在林下七葉一枝花的根際土（LXG）分離到11株芽胞桿菌，含4個(gè)屬，7個(gè)種。其中，芽胞桿菌屬3個(gè)種：假蕈狀芽胞桿菌B. pseudomycoides、B. paramycoides和圖瓦永芽胞桿菌B. toyonensis;賴氨酸芽胞桿菌屬1個(gè)種：解木糖賴氨酸芽胞桿菌L. xylanilyticus;假單胞菌屬2個(gè)種：霍氏假單胞菌P. rhodesiae和基爾假單胞菌P. koreensis;Bhargavaea的1個(gè)種：B. ginsengi。

在山垅七葉一枝花的非根際土（SLF）分離到12株芽胞桿菌，含3個(gè)屬，8個(gè)種。其中，芽胞桿菌屬6個(gè)種：圖瓦永芽胞桿菌B. toyonensis、假蕈狀芽胞桿菌B. pseudomycoides、賽門枝芽胞桿菌B. siamensis、阿氏芽胞桿菌B. aryabhattai、B. albus和維德曼芽胞桿菌B. wiedmannii;假單胞菌屬1個(gè)種：P. granadensis;泛菌屬1種：P. rodasii。

在山垅七葉一枝花的根際土（SLG）分離到17株芽胞桿菌，含5個(gè)屬，16個(gè)種。其中，芽胞桿菌屬9個(gè)種：B. proteolyticus、B. albus、圖瓦永芽胞桿菌B. toyonensis、維德曼芽胞桿菌B. wiedmannii、高地芽胞桿菌B. altitudinis、阿氏芽胞桿菌B. aryabhattai、吉氏芽胞桿菌B. gibsonii、扁平芽胞桿菌B. depressus和假蕈狀芽胞桿菌B. pseudomycoides;假單胞菌屬2個(gè)種：P. koreensis 基爾假單胞菌，霍氏假單胞菌P. rhodesiae;賴氨酸芽胞桿菌屬1個(gè)種：紡錘形賴氨酸芽胞桿L. fusiformis;代夫特菌屬1個(gè)種：D. acidovorans;綠芽胞桿菌屬1個(gè)種：田地綠芽胞桿菌V. arvi;節(jié)桿菌屬1個(gè)種：A. bambusae。

2.2?芽胞桿菌資源系統(tǒng)發(fā)育

采用Neighbour-Joining方法對(duì)從七葉一枝花土壤中分離到的芽胞桿菌和35株參考菌株構(gòu)建進(jìn)化樹，如圖2所示，主要聚為2大類。第1大類群為芽胞桿菌科的種類，包括芽胞桿菌屬Bacillus、短桿菌屬Brevibacillus、Bhargavaea、綠芽胞桿菌屬Viridibacillus、賴氨酸芽胞桿菌屬Lysinibacillus、短芽胞桿菌屬Brevibacillus、Paenarthrobacter和節(jié)桿菌屬Arthrobacter;第2大類群為非芽胞桿菌科，包括代夫特菌屬Delftia、伯克氏菌屬Burkholderia、泛菌屬Pantoea和假單胞菌屬Pseudomonas。

2.3?芽胞桿菌類群的生境分布

對(duì)3種種植模式的七葉一枝花土壤中分離出的芽胞桿菌的分離頻度、數(shù)量進(jìn)行分析（表2）， 結(jié)果表明圖瓦永芽胞桿菌B. toyonensis和假蕈狀芽胞桿菌B. pseudomycoides為土壤中芽胞桿菌的優(yōu)勢種。

不同種植模式土壤中芽胞桿菌的優(yōu)勢種存在差別：B. altitudinis、B. pseudomycoides、B. drentensis、B. aryabhattai、L. fusiformis、B. depressus和B. toyonensis為水稻田土壤中細(xì)菌的優(yōu)勢種，B. pseudomycoides、B. aryabhattai、B. toyonensis、B. albus和B. wiedmannii為山垅田的優(yōu)勢種，B. toyonensis、L. xylanilyticus和B. paramycoides為林下的優(yōu)勢種。B. pseudomycoides和B. toyonensis這2個(gè)種在3種種植模式的土壤樣品中均有分離到，是該地區(qū)土壤中廣泛存在的細(xì)菌。但也有相當(dāng)部分的種類只在1個(gè)種植模式地點(diǎn)的土壤中分離到，為該地點(diǎn)的特有種類，如B. frigoritolerans、B. drentensis、L. mangiferihumi、B. pacificus、P. ilicis、P. silvae、B. timonensis、B. mobilis、P. elgii和B. cecembensis等10個(gè)種只在水稻田有分離到，B. siamensis、P. granadensis、B. wiedmannii、Pantoea rodasii、A. bambusae、B. gibsonii、D. acidovorans和V. arvi等8個(gè)種只在山垅田有分離到，B. paramycoides、D. lacustris、B. laterosporus、B. stabilis、B. ginsengi等5個(gè)種在林下有分離到。

不同種植模式地點(diǎn)土壤中芽胞桿菌數(shù)量存在差異：林下芽胞桿菌數(shù)量最少，只有32.5×105 cfu·g-1，水稻田土壤中最多，達(dá)36.4×105cfu·g-1。不同地點(diǎn)土壤中數(shù)量較多的芽胞桿菌種類也不一樣，如水稻田土壤中數(shù)量最多的芽胞桿菌是B. pseudomycoides，山垅田土壤中數(shù)量最多的芽胞桿菌是A. bambusae，林下土壤中數(shù)量最多的芽胞桿菌是B. toyonensis。

3種種植模式地點(diǎn)的七葉一枝花的根際土的芽胞桿菌數(shù)量均大于非根際土壤中芽胞桿菌的數(shù)量。

2.4?芽胞桿菌多樣性

3種種植模式七葉一枝花土壤中芽胞桿菌的物種多樣性如圖3所示。水稻田種植的七葉一枝花土壤中芽胞桿菌的物種豐富度指數(shù)最高，為3.05，山垅田種植的七葉一枝花土壤其次，為2.92，林下種植的七葉一枝花土壤的物種豐富度最低，僅為1.90。水稻田種植的七葉一枝花土壤中芽胞桿菌的物種多樣性指數(shù)最高，達(dá)2.52，山垅田其次，為2.09，林下最低，為1.83。水稻田種植的七葉一枝花的土壤中芽胞桿菌均勻度指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)最高，分別為0.72和0.77。

3?討論與結(jié)論

芽胞桿菌是典型的土壤微生物，能夠利用植物根系的分泌物和脫落物進(jìn)行快速生長繁殖，所以可以從植物根際中分離獲得[10]。土壤中的芽胞桿菌可作為生物肥料和生物農(nóng)藥[11]。巨大芽胞桿菌等可降解、活化土壤中難溶的含磷化合物，使之成為作物易吸收的可溶形態(tài)[12];巨大芽胞桿菌和球形芽胞桿菌具有固氮作用，可以提高固氮菌在水稻根表的定殖能力[13];蘇云金芽胞桿菌形成過程中可以產(chǎn)生一種對(duì)鱗翅目、雙翅目和鞘目幼蟲具有高毒力的伴孢晶體，有殺蟲效果[14];枯草芽胞桿菌能防治植物病害和促進(jìn)植物生長[15]。本研究較系統(tǒng)地分析了南平市光澤縣福建承天農(nóng)林科技發(fā)展有限公司不同種植模式七葉一枝花土壤中芽胞桿菌的群落狀況，結(jié)果表明水稻田土壤中芽胞桿菌種類豐富、數(shù)量最大，其次為山垅田，最后為林下。水稻田土壤微生物多樣性是構(gòu)成土壤生態(tài)功能的基礎(chǔ)，是土壤生態(tài)系統(tǒng)中C、N、S、P等物質(zhì)和能力循環(huán)的主要參與者[16]，是土壤中微生物群落演替與土壤有機(jī)碳動(dòng)態(tài)協(xié)同反饋[17]。施用化肥會(huì)影響碳氮轉(zhuǎn)化[18]，影響水稻田土壤的微生物多樣性[19]。林下土壤微生物多樣性低可能是因其為種植時(shí)間較長的竹子林，林下植物多樣性低，主要植物已與土壤微生物形成穩(wěn)定的微生物生態(tài)系統(tǒng)。3種種植模式的七葉一枝花根際土壤中芽胞桿菌的數(shù)量和多樣性高于非根際土壤。因?yàn)橹参锔荡x產(chǎn)生分泌物，其中一些物質(zhì)可直接影響根際土壤細(xì)菌生長、發(fā)育和繁殖，使根際細(xì)菌數(shù)量、種類不同于非根際土壤，形成根際效應(yīng)[20]，如安韶山等[21]報(bào)道了寧南山區(qū)9種典型植物的根際土壤中微生物多樣性指數(shù)和微生物均勻度指數(shù)均比非根際土壤高;李巖等[22]報(bào)道了黑枸杞根際土壤中細(xì)菌的多樣性高于非根際土壤。 南平市光澤縣福建承天農(nóng)林科技發(fā)展有限公司3種種植模式的土壤中的芽胞桿菌優(yōu)勢菌群為圖瓦永芽胞桿菌B. toyonensis和假蕈狀芽胞桿菌B. pseudomycoides，其中圖瓦永芽胞桿菌是一種益生菌[23]，可減少病原體[24];假蕈狀芽胞桿菌具有固氮能力，可產(chǎn)纖溶酶[25]、丙氨酸消旋酶[26]和用于生物防治的黃曲霉毒素[27]。另外，在七葉一枝花的根際土壤中，共分離到26種可培養(yǎng)的芽胞桿菌，種類豐富;其中解木糖賴氨酸芽胞桿菌對(duì)尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum等具有拮抗作用[28]，P. koreensis等具有促生作用[29]。

本研究分析了水稻田、山垅和林下3種種植模式下七葉一枝花土壤中根際和非根際芽胞桿菌資源多樣性，為七葉一枝花不同生境的栽培提供良好的理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：黃愛萍）