鄭嫩珠 章琳俐 李麗 辛清武 繆中緯 朱志明 黃一帆

摘?要：【目的】首次對(duì)半番鴨不同組織Cu/Zn-SOD基因表達(dá)、酶活性進(jìn)行研究，以期了解半番鴨不同組織抗氧化特性，為深入研究半番鴨對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)能力及相關(guān)分子機(jī)制提供參考?！痉椒ā客ㄟ^(guò)實(shí)時(shí)熒光定量法、黃嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法分別測(cè)定了半番鴨心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌胃和胸肌中的Cu/Zn-SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量、酶活力和MDA含量?！窘Y(jié)果】 Cu/Zn-SOD mRNA在胸肌中相對(duì)表達(dá)量最高，總體趨勢(shì)為胸肌>肝臟>肺>心臟>脾臟>腎臟/肌胃。酶活力測(cè)定結(jié)果顯示，肝臟和腎臟Cu/Zn-SOD酶活力顯著高于胸肌和肌胃。半番鴨胸肌MDA含量顯著高于肝臟、肌胃和腎臟，提示胸肌可能更易受到氧化應(yīng)激損傷。相關(guān)分析結(jié)果顯示Cu/Zn-SOD活力與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，而抗氧化酶活力與mRNA表達(dá)水平相關(guān)性不顯著?！窘Y(jié)論】半番鴨Cu/Zn-SOD基因表達(dá)和酶活力具有組織特異性。不同組織Cu/Zn-SOD活力差異可能與Cu/Zn-SOD自身的生理功能以及組織代謝水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞：Cu/Zn-SOD; mRNA表達(dá); 酶活力; 半番鴨

中圖分類號(hào)：X 131;X 53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384（2019）08-933-06

Abstract：【Objective】 Expressions of Cu/Zn-SOD gene and activities of the antioxidant enzyme in various organs of mule ducks were determined. 【Method】 The gene expression?in the heart， liver， spleen， lung， kidney， gizzard and chest muscles，antioxidant enzyme activities，and MDA contents of mule duck were determined by the qRT-PCR， xanthine-xanthine oxidase， and thiobarbituric acid methods. 【Result】 The greatest mRNA expression of Cu/Zn-SOD gene was found in the chest muscle followed by the tissues in the order of liver>lung> heart>spleen>gizzard/kidney of the ducks. The activities of Cu/Zn-SOD enzyme in the liver and kidney were significantly higher than those in the breasts and gizzard. The higher MDA content in the breasts than in the liver， gizzard or kidney indicated a greater susceptibility of the chest muscle to damage by oxidative stress. There was no significant correlation observed between the antioxidant enzyme activity and the mRNA expression level in different organs. However， the Cu/Zn-SOD enzyme activity was inversely correlated to MDA content in the tissues. 【Conclusion】 The Cu/Zn-SOD mRNA expression and enzyme activity were organ-specific. The differences in the enzymatic activities might stem from the diverse physiological functions of the enzymes and/or the tissue metabolism per se.

Key words：Cu/Zn-SOD; mRNA expression; enzyme activity; mule duck

0?引言

【研究意義】動(dòng)物機(jī)體有氧代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生自由基和其他活性氧。正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體能通過(guò)抗氧化系統(tǒng)清除自由基。抗氧化系統(tǒng)失衡或異常將導(dǎo)致自由基過(guò)度累積，引起脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA損傷、酶失活等氧化損傷[1]。畜禽生產(chǎn)中抗氧化系統(tǒng)失衡可表現(xiàn)為畜禽對(duì)運(yùn)輸或運(yùn)動(dòng)過(guò)程的應(yīng)激易感，使宰后組織氧化損傷、肉質(zhì)下降，甚至病理?yè)p傷[2]。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，家禽生產(chǎn)中的許多應(yīng)激都與氧化應(yīng)激有關(guān)[3]。禽類疾病如雞腎病、肉雞腹水綜合征、鴨病毒性肝炎發(fā)生過(guò)程中由于自由基清除系統(tǒng)失代償或衰竭使細(xì)胞內(nèi)累積過(guò)量自由基，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞成分的改變，引起病理性損傷[4-6]。了解組織抗氧化特性及相關(guān)基因表達(dá)的分子機(jī)制，對(duì)于研究如何減少家禽生產(chǎn)中各種應(yīng)激的負(fù)面影響具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】抗氧化酶是抗氧化系統(tǒng)重要組成成員之一，是清除自由基和活性氧的第一道防線，其中超氧化物歧化酶（SOD）是抗氧化酶類中的重要成員[7]，可快速歧化活性氧（·O-2），使其轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫和分子氧，從而特異性清除活性氧（·O-2） ?[8-9]。丙二醛（MDA）是自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用而形成，其含量可反映自由基的產(chǎn)生情況和器官組織中脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[10]。研究報(bào)道顯示不同物種和組織間SOD的活性和基因表達(dá)水平不同 [11-12]。Surai等[13]報(bào)道雞胚胎時(shí)期不同組織SOD活性變化趨勢(shì)不同，新生雛雞不同組織間酶活性也存在差異。【本研究切入點(diǎn)】目前對(duì)于動(dòng)物抗氧化酶的研究多集中于哺乳動(dòng)物以及禽類中的雞，關(guān)于鴨抗氧化酶的研究較少。半番鴨是繼北京鴨、番鴨后極具發(fā)展?jié)摿Φ娜庥螟?，是水禽肉用品種改良研究的熱點(diǎn)之一，具有瘦肉率高、脂肪少、耐粗飼、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，也是生產(chǎn)肥肝和羽毛的重要來(lái)源[14]。半番鴨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展速度雖然很快，但闡述其各性狀發(fā)展的資料還很少 [15-16]，針對(duì)抗氧化酶在半番鴨各組織器官的分布和活性的研究未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】因此，本研究通過(guò)測(cè)定半番鴨不同組織抗氧化酶基因表達(dá)、酶活力及丙二醛含量，探索半番鴨不同組織抗氧化特性，從而為半番鴨對(duì)環(huán)境因子（如應(yīng)激）響應(yīng)能力的研究提供理論參考，在科研和生產(chǎn)上都具有一定生物學(xué)意義。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

試驗(yàn)鴨飼養(yǎng)于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物養(yǎng)殖試驗(yàn)場(chǎng)。鴨飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致，自由采食，自由飲水，按常規(guī)操作程序?qū)υ囼?yàn)鴨進(jìn)行管理。飼料由福建華龍集團(tuán)飼料有限公司提供，不同生長(zhǎng)時(shí)期的飼料營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。70日齡時(shí)，隨機(jī)選取5只同批次健康的半番鴨（體重約3 kg），頸動(dòng)脈放血處死后，采集其組織樣品（心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌胃和胸肌），立即投入液氮中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2?總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法提取組織總RNA，超微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific， 美國(guó)）檢測(cè)RNA含量、純度及質(zhì)量，并調(diào)整總RNA濃度至1 μg·μL-1;利用Super ScriptTM III First-Strand Synthesis Super反轉(zhuǎn)試劑盒（Invitrogen， 美國(guó)）將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3?抗氧化酶基因的表達(dá)分析

根據(jù)GenBank已公布的鴨Cu/Zn-SOD（SOD1）和β-actin基因序列，應(yīng)用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8軟件設(shè)計(jì)引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表2。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，CFX384多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad， 美國(guó)）檢測(cè)半番鴨各組織Cu/Zn-SOD mRNA表達(dá)情況，每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)體系（20 μL）： Power SYBR?Green Master Mix 10 μL（Applied Biosystems，美國(guó)）、SDW 8.0 μL、1 μg·μL-1 cDNA 1.0 μL、10 μmol·L-1 PCR-F 0.5 μL、10 μmol·L-1 PCR-R 0.5 μL和ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)條件：95℃ 1 min，95℃15 s，63℃ 25 s，40個(gè)循環(huán);熔解曲線分析 55～95℃。通過(guò)熔解曲線判斷定量PCR的特異性。采用2-ΔΔCt值方法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4?抗氧化酶活力及MDA含量測(cè)定

超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）和丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒和考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。樣品用0.86%生理鹽水制成10%的組織勻漿液，離心取上清，測(cè)定蛋白濃度后，應(yīng)用相應(yīng)試劑盒和ELX800通用酶標(biāo)儀（BIO-TEK Instruments Inc， 美國(guó)）測(cè)定Cu/Zn-SOD活力和MDA含量，操作步驟按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Cu/Zn-SOD采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法（Thibabituric Acid， TBA）測(cè)定。

1.5?數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 17.0軟件對(duì)不同組織Cu/Zn-SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量、酶活力和MDA含量進(jìn)行描述性數(shù)據(jù)、多重比較、顯著性檢驗(yàn)及相關(guān)性分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?半番鴨Cu/Zn-SOD基因的qRT-PCR檢測(cè)

由圖1可知，β-actin和目的基因的擴(kuò)增曲線均呈 “S” 形，基線平緩并且未呈現(xiàn)明顯的上揚(yáng)趨勢(shì)，表明各基因的動(dòng)力學(xué)曲線整體平行性較好。各基因熔解曲線存在一個(gè)明顯的單峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，熒光強(qiáng)度均來(lái)自特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，未見(jiàn)有引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生。

2.2?Cu/Zn-SOD基因組織表達(dá)特點(diǎn)

qRT-PCR結(jié)果顯示（圖2），Cu/Zn-SOD mRNA在心臟、肝臟、脾臟、肺臟和胸肌5種組織中有表達(dá)，腎臟和肌胃無(wú)表達(dá)或者表達(dá)量極低，不同組織間表達(dá)差異明顯。其中胸肌表達(dá)量最高，其他組織間差異達(dá)到極顯著水平（P<0.01）， 總體趨勢(shì)： 胸肌>肝臟>肺臟>心臟>脾臟>腎臟/肌胃。

2.3?半番鴨組織Cu/Zn-SOD活力與MDA含量

選取肝臟、胸肌、腎臟、肌胃，檢測(cè)Cu/Zn-SOD活力和MDA含量。由表3可知，不同組織間Cu/Zn-SOD酶活力明顯不同，肝臟和腎臟Cu/Zn-SOD酶活力顯著高于胸肌和肌胃（P<0.01），肝臟的Cu/Zn-SOD酶活力約為胸肌的4.5倍;胸肌和肌胃間差異不顯著?？傮w情況為：肝臟>腎臟>肌胃>胸肌。MDA含量在胸肌中最高，肝臟、肌胃次之，腎臟最低。MDA含量胸肌極顯著高于其他組織（P<0.01），肝臟MDA含量與肌胃間差異不顯著，腎臟含量最低。2.4?Cu/Zn-SOD活力與mRNA表達(dá)量、MDA含量的相關(guān)性分析

利用SPSS17.0軟件對(duì)各組織抗氧化酶活力與mRNA表達(dá)、MDA含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，在半番鴨4個(gè)組織中，抗氧化酶活力與mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著相關(guān);Cu/Zn-SOD活力與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）（圖3）。

3?討?論

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）是清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的抗氧化酶，在機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中起到至關(guān)重要的作用。大量研究表明，自由基、活性氧增加或抗氧化物能力下降與基因表達(dá)的改變密切相關(guān)[17-18]。Cu/Zn-SOD是SOD家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)也是分布最廣泛的一種，活性中心包含銅離子和鋅離子，其基因序列和結(jié)構(gòu)從原核生物到真核生物高度保守，但基因表達(dá)在不同物種和組織間不同。本研究中半番鴨Cu/Zn-SOD mRNA在多數(shù)器官表達(dá)，在胸肌中表達(dá)最高，這與Xu等[19]在豬上的報(bào)道相似;另有報(bào)道哺乳動(dòng)物Cu/Zn-SOD mRNA在肝臟和腎臟高表達(dá)，如豚鼠Cu/Zn-SOD mRNA表達(dá)由強(qiáng)至弱順序?yàn)椋?肝>腎>肺 >脾>心[20-21]。

半番鴨不同組織的酶活力呈現(xiàn)出一定差異，肝臟和腎臟Cu/Zn-SOD活力高于胸肌和肌胃，這與朱子玉等[22]在絲毛烏骨雞和北京油雞上的報(bào)道類似;Marklund[23] 對(duì)豬、牛、羊等動(dòng)物研究也顯示肝臟和腎臟等代謝活躍的器官Cu/Zn-SOD活力較高，其他組織具有相似的中等酶活力。不同組織酶活力的差異可能與Cu/Zn-SOD自身的生理功能以及組織代謝水平有關(guān)。肝臟是動(dòng)物物質(zhì)、能量代謝的重要器官，也是體內(nèi)重要的解毒器官，對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)起著重要作用，可產(chǎn)生大量活性氧自由基，需要較強(qiáng)的抗氧化能力加以清除，防止過(guò)量活性氧自由基損害肝臟。腎臟是禽類重要排泄器官，也具有較高的生理代謝水平。本研究中半番鴨Cu/Zn-SOD活力與mRNA表達(dá)水平并不完全一致，并且兩者相關(guān)性不顯著，可能由于抗氧化酶基因表達(dá)可受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響[24]，而抗氧化酶活力會(huì)受底物水平、營(yíng)養(yǎng)等因素影響，因此抗氧化酶mRNA表達(dá)水平和其活力未呈現(xiàn)簡(jiǎn)單的相關(guān)性[19-20]。

半番鴨MDA含量與SOD 活力之間存在顯著負(fù)相關(guān)，與Zhang等[25]在雞上的報(bào)道類似，SOD活力的減少伴隨MDA含量增加。半番鴨胸肌MDA含量顯著高于肝臟、肌胃和腎臟，提示胸肌可能更易受到氧化應(yīng)激損傷。在養(yǎng)殖和運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)更注意減少應(yīng)激，降低其對(duì)肉品質(zhì)的影響。

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（責(zé)任編輯：張?梅）