萬繼鋒 李娟 楊為海 曾輝 張漢周 陳杰忠

摘?要：【目的】研究柑橘果實響應高溫、強光脅迫的活性氧代謝，為預防柑橘果實發(fā)生日灼以及果品優(yōu)質生產(chǎn)提供依據(jù)?！痉椒ā吭诃h(huán)境調控生長室中模擬高溫、強光誘導柑橘果實發(fā)生灼傷，并從果實灼傷病程的不同階段入手，分析了果實灼傷病程中果皮活性氧代謝的變化規(guī)律。【結果】高溫、強光脅迫使果皮中O·-2大量積累，LOX活性增強，脂質過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著上升。灼傷初期果皮呈現(xiàn)深黃色小斑點，SOD、POD和PPO活性均顯著上升;隨著灼傷病情的加劇，果皮變褐，POD活性仍增強，SOD活性顯著下降且顯著低于正常果，而PPO活性顯著下降，但仍顯著高于正常果;AsA和GSH含量在整個灼傷病程中均逐步下降。【結論】在高溫、強光脅迫初期果皮呈現(xiàn)深黃色小斑點，柑橘果實果皮組織維持較高的活性氧清除能力，減緩了高溫、強光對細胞膜的損傷。果皮呈現(xiàn)深黃色小斑點是預防柑橘果實果皮褐變的重要時間節(jié)點。

關鍵詞：柑橘果實;高溫脅迫強光脅迫;活性氧代謝

中圖分類號：S 666文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）08-920-05

Abstract：【Objective】 The reactive oxygen species （ROS） metabolism of citrus fruits under high temperature and intense light was studied in search for means to mitigate sunburn damage on the fruits. 【Method】 Sweet oranges， An-liu （Citrus sinensis Osbeck）， grown in pots in an environmentally controlled chamber were exposed to artificial high-temperature-intense-light to create simulated burns on the fruits. Change on the ROS metabolism of the fruits as burn symptoms developed in normality and stages with appearance of dark yellow spots， slight browning， and seriously burnt coloration on the peel were monitored.【Result】Under the imposed stress， the O·-2 and MDA contents and LOX activity in pericarp significantly increased. The activities of SOD， POD， and PPO were significantly raised with the appearance of dark yellow spots on the peels. As the browning intensified， SOD significantly fell below the normal level， POD continued to increase， and PPO significantly decreased but remained to be higher than normal. Under the stress， AsA and GSH in the fruits decreased continuously. 【Conclusion】 In the early stages， the high-temperature-intense-light stress began generating dark yellow spots on the orange pericarp. However， the fruit was able to sufficiently remove ROS diminishing or preventing damage on the cell membrane. Hence， it was the crucial time for implementation of measures to avoid sunburns on the fruits.

Key words：citrus fruit; high-temperature-intense-light stress; reactive oxygen species

0?引言

【研究意義】自然條件下高溫、強光脅迫會引起柑橘果實向光面果皮發(fā)生灼傷，受害部位初呈灰青色或深黃色小斑點，后擴大為黃褐色斑塊，凹陷呈深褐色，輕者僅灼傷果皮，重者傷及汁胞，果汁極少且味淡，果肉呈海綿狀，完全失去食用價值，每年均給柑橘果品優(yōu)質生產(chǎn)帶來了一定損失[1-3]。高溫、強光脅迫引起的果實向光面果皮灼傷屬于氧化脅迫的結果[4]，果實灼傷的發(fā)生與果實響應高溫、強光脅迫的活性氧代謝密切相關。因此，研究柑橘果實響應高溫、強光脅迫的活性氧代謝，對預防高溫、強光脅迫引起柑橘果實灼傷以及果品優(yōu)質生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】高溫、強光是引起柑橘果實灼傷的主要原因，果實灼傷也與果實著生方位、相對濕度有關，著生在樹冠西南面的果實易被灼傷，在高溫和20%相對濕度下的果實易被灼傷[1-2，5]，可通過果實貼白紙及噴白、樹盤覆蓋、合理施肥、適當密植、合理修剪、適時灌溉等措施防治柑橘果實灼傷[1-2]。萬繼鋒等[6]通過分析柑橘正常果和日灼褐變果果皮抗氧化代謝，發(fā)現(xiàn)褐變果皮組織中超氧陰離子自由基（O·-2）大量積累，脂氧合酶（LOX）活性顯著增強，脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量顯著上升，而超氧化物歧化酶（SOD）活性、抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）含量均顯著下降，過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性均顯著增強?！颈狙芯壳腥朦c】目前對自然條件下高溫、強光脅迫引起柑橘果實灼傷的研究主要涉及發(fā)生原因、防治措施以及褐變果皮抗氧化代謝，尚未從柑橘果實灼傷病程上系統(tǒng)研究其活性氧代謝?！緮M解決的關鍵問題】通過高溫、強光脅迫誘導柑橘果實灼傷，并從果實灼傷病程的不同階段入手，研究果實灼傷病程中果皮活性氧代謝的變化規(guī)律，有助于探討高溫、強光脅迫引起柑橘果實灼傷的作用機制，也從側面進一步驗證和完善自然條件下高溫、強光脅迫引起柑橘果實灼傷作用機制的理論，從而為預防柑橘果實發(fā)生日灼以及果品優(yōu)質生產(chǎn)提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

試驗材料為3年生生長較為一致、掛果適量的盆栽暗柳橙Citrus sinensis Osbeck，其砧木為紅橘Citrus tangerine Hort ex Tanaka。

1.2?試驗方法

1.2.1?試驗處理

試驗在華南農(nóng)業(yè)大學園藝學院環(huán)境調控生長室進行，于晴天11∶00～15∶00采用高溫（35℃）、氙氣燈強光（20 000～30 000 lx）處理試驗樹外圍裸露果實，誘導向光面果皮出現(xiàn)深黃色小斑點，隨后逐漸發(fā)展為黃褐色斑塊。高溫強光處理5～7 d后，向光面果皮呈現(xiàn)深黃色小斑點，隨后2～3 d向光面果皮顯現(xiàn)輕度黃褐色斑塊，隨后7～10 d向光面果皮顯現(xiàn)重度黃褐色斑塊。根據(jù)灼傷病程選取正常果、深黃色小斑點果（斑點果）、輕度黃褐色斑塊果（輕度褐變果）、重度黃褐色斑塊果（重度褐變果），削取相應的果皮，用液氮固定后帶回實驗室，置于-80℃低溫冰箱備用。高溫、強光處理期間每天傍晚給予盆栽植株緩慢灌水至水從盆底溢出，以消除水分脅迫。1株樹為1個重復，試驗設3次重復。

1.2.2?指標測定

O·-2含量的測定采用羥胺氧化法，AsA含量的測定采用高效液相色譜法，GSH含量的測定采用DTNB顯色法[6]，LOX活性的測定參照Mao等[7]的方法，MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法，SOD活性的測定采用氮藍四唑（NBT）光化還原法，POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚比色法[8]，PPO活性的測定參照張建光等[9]的方法。

1.3?數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Office Excel統(tǒng)計分析，采用Duncan新復極差作顯著性測驗。

2?結果與分析

2.1?高溫、強光誘導果實灼傷病程中果皮細胞的膜脂過氧化

灼傷初期斑點果的O·-2含量顯著增加，約為正常果的2.4倍;當果皮變褐時，O·-2含量先下降后上升，顯著高于正常果，但與斑點果無顯著差異（圖1-A）。灼傷初期果皮呈深黃色小斑點時，膜脂過氧化作用產(chǎn)生的MDA含量顯著增加;果皮變褐時，MDA含量仍顯著增加（圖1-B）。隨著灼傷病情的加劇，LOX活性呈上升趨勢，斑點果的LOX活性與正常果無顯著差異，輕度褐變果和重度褐變果的LOX活性顯著高于正常果（圖1-C）。說明果實發(fā)生灼傷后，細胞膜系統(tǒng)過氧化加劇。

2.2?高溫、強光誘導果實灼傷病程中果皮抗氧化酶活性的變化

在果實灼傷初期果皮呈深黃色小斑點，SOD、POD和PPO活性均顯著增強，分別比正常果的增加14.7%、36.3%、52.1%。果皮變褐時， SOD活性顯著下降，最終顯著低于正常果;POD活性仍有所增強，但無顯著增加;PPO活性顯著下降，仍顯著高于正常果（圖2）。

2.3?高溫、強光誘導果實灼傷病程中果皮抗氧化劑的變化

在果實灼傷初期果皮呈深黃色小斑點，AsA和GSH含量均顯著下降，分別比正常果下降21.5%、30.2%;隨著灼傷病情的加劇，AsA含量繼續(xù)下降，輕度褐變果的AsA含量與斑點果無顯著差異，重度褐變果的AsA含量顯著低于斑點果;GSH含量顯著下降，輕度褐變果與重度褐變果間無顯著差異（圖3）。

3?討論與結論

超氧陰離子自由基（O·-2）是活性氧的主要成員，可啟動膜脂過氧化[10]。LOX在植物組織細胞膜脂產(chǎn)生過氧化損傷中發(fā)揮主要作用[11]。MDA是膜脂過氧化分解的主要產(chǎn)物，其積累能對細胞膜造成進一步傷害，可作為細胞膜受損程度的衡量指標[12]。本試驗研究表明，灼傷初期果皮呈現(xiàn)深黃色小斑點，O·-2大量積累，而O·-2的積累可反饋激活LOX活性[13]，使LOX活性增強，脂質過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著上升，這與郝燕燕等[14]在蘋果上的研究結果相似。隨著蘋果果皮變褐，O·-2含量迅速下降，LOX活性和MDA含量仍有所上升[14]。但在本試驗中，隨著柑橘果皮變褐，O·-2含量沒有顯著增加，而LOX活性仍明顯增強，MDA含量仍顯著增加，說明高溫、強光脅迫下由活性氧積累引發(fā)的細胞膜脂過氧化加劇。

SOD為植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，催化O·-2發(fā)生歧化反應而生成O2和H2O2，清除細胞中多余的O·-2[15-16]。本試驗研究表明，灼傷初期果皮呈深黃色小斑點，SOD活性顯著上升，這與郝燕燕等[14]在蘋果上的研究結果相似;隨著柑橘果皮變褐，SOD活性顯著下降且最終顯著低于正常果，這與張建光等[17]在蘋果上的研究結果相似，與郝燕燕等[14]在蘋果上的研究結果不同。SOD活性在脅迫期間呈現(xiàn)“先升后降”的變化趨勢，這說明高溫、強光脅迫初期果實機體產(chǎn)生大量的O·-2，顯著激活SOD的清除能力，是果實應對高溫、強光脅迫的積極保護機制。隨著脅迫的加重，SOD活性明顯下降，而O·-2、MDA含量和LOX活性仍維持較高水平，這意味著SOD清除O·-2的能力下降，致使膜脂過氧化作用加劇。原因可能是隨著果實灼傷程度的加重，SOD受到破壞，活性下降[6，17]。

H2O2的過量累積加劇對細胞的傷害，POD是植物細胞中清除H2O2的主要酶類[16，18]。本試驗研究表明，灼傷初期果皮呈現(xiàn)深黃色小斑點，POD活性顯著增強;隨著果皮變褐，POD活性仍有所增強且顯著高于正常果。這與張建光等[17]及郝燕燕等[14]在蘋果上的研究結果相似。原因可能是POD抗氧化脅迫的能力相對較強，或隨著果實灼傷程度的加重，細胞組織被分解，過氧化物底物繼續(xù)增多，在底物的誘導下POD活性繼續(xù)增強[17]。

多酚氧化酶（PPO）是引起褐變的主要酶。果實灼傷褐變與高溫、強光脅迫下果皮細胞PPO活性大幅度提高有密切關系[9]。本試驗研究表明，灼傷初期果皮呈現(xiàn)深黃色小斑點，PPO活性顯著增強;隨著果皮變褐，PPO活性顯著下降，仍顯著高于正常果。這與郝燕燕等[14]在蘋果上的研究結果相似。原因可能是隨著褐變癥狀出現(xiàn)，反應底物逐漸減少，或者與PPO“自殺抑制”作用有關[19]。高溫、強光誘導柑橘果實發(fā)生灼傷，最初癥狀是向光面果皮呈現(xiàn)深黃色小斑點，隨后呈現(xiàn)褐變斑塊。由此可推斷，在向光面果皮呈深黃色小斑點階段，PPO活性受到高溫、強光脅迫誘導而顯著增強，參與了酚類物質轉化為醌類物質的過程，最終導致果皮褐變而呈現(xiàn)黃褐色癥狀。

抗壞血酸和谷胱甘肽通過GSH-AsA循環(huán)清除活性氧，在活性氧的清除過程中起重要作用[16，20]。本試驗研究表明，灼傷初期果皮呈現(xiàn)深黃色小斑點，AsA和GSH含量顯著下降;隨著果皮變褐，AsA和GSH含量仍明顯下降，這與Andrews等[21]在蘋果上的研究結果相似。原因可能是高溫、強光脅迫降低了AsA和GSH的合成速率;AsA和GSH參與了自由基的猝滅[3，6]。

總之，在高溫、強光脅迫下柑橘果實初期果皮呈現(xiàn)深黃色小斑點，果皮組織維持較高的活性氧清除能力，減緩了高溫、強光對細胞膜的損傷。果皮呈現(xiàn)深黃色小斑點是預防柑橘果實果皮褐變的重要時間節(jié)點。

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（責任編輯：黃愛萍）