吳錦　楊茜　王久利　高慶波　張發(fā)起　陳世龍

摘要：? 利用葉綠體非編碼區(qū)片段研究分布于青藏高原地區(qū)的山生柳居群遺傳多樣性，對(duì)未來山生柳生態(tài)環(huán)境和青藏高原地區(qū)物種豐富度的保護(hù)具有指導(dǎo)意義。該研究設(shè)計(jì)并篩選出cpDNA引物5′trnG2G-3′trnG（UUC）和5′rpS12-rpL20，用擴(kuò)增出的片段和對(duì)應(yīng)的聯(lián)合片段進(jìn)行后續(xù)的遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：通過山生柳的聯(lián)合片段檢測(cè)到35種單倍型，單倍型多態(tài)性0.626，核苷酸多態(tài)性0.000 85。中性檢驗(yàn)Tajima’s D（-2.286 70， P<0.01）和Fu’s Fs（-5.298 05， P<0.02）都是顯著負(fù)值，推測(cè)山生柳個(gè)體數(shù)近期經(jīng)歷過擴(kuò)張。AMOVA分析顯示，居群內(nèi)和居群間遺傳變異分別為93.70%和6.30%，表明居群內(nèi)的變異是山生柳遺傳變異的主要來源。居群間遺傳分化程度中等偏低（FST=0.063），基因流（Nm）為7.439，說明山生柳各居群的基因交流非常頻繁，不同地理居群間存在一定的基因流動(dòng)。遺傳分化系數(shù)NST（0.075）大于GST（0.068）和基于遺傳距離和單倍型的UPGMA聚類分析，表明山生柳12個(gè)居群分為4組且與居群的地理分布沒有明顯相關(guān)性。山生柳是進(jìn)行有性繁殖還是無性繁殖主要受環(huán)境因素的影響，居群內(nèi)變異是山生柳遺傳變異性的主要來源，居群間基因交流頻繁。

關(guān)鍵詞： 山生柳， 基因流， 青藏高原， 葉綠體DNA， 遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：?; Q943文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A文章編號(hào)：? 1000-3142（2019）09-1180-11

Abstract：? We studied the genetic diversity of Salix oritrepha in the Qinghai-Tibetan Plateau using the non-coding region of chloroplast DNA fragments. The study will have? guiding significance for the protection of ecological environment and animal husbandry of S. oritrepha and species richness in Qinghai-Tibet Plateau in the future. We designed two useful primers 5′trnG2G-3′trnG （UUC） and 5′rpS12-rpL20. The amplified fragments and their combined fragments were used for subsequent genetic diversity analysis of S. oritrepha. The results showed that we detected 35 haplotypes by the combined sequences， haplotype diversity （Hd） was 0.626， nucleotide diversity （Pi） was 0.000 85. Neutrality tests of Tajima’s D （-2.286 70， P<0.01） and Fus Fs （-5.298 05， P<0.02） showed significantly negative values， which meant that S. oritrepha had expansion recently of its individual numbers. Analysis of molecular variance showed that within-population variance was described as 93.70% of the total variance， while among-population variance was 6.30%， which meant that within-population variance was the main resource of genetic variation of S. oritrepha. The fi-xation index （FST） was 0.063 and number of migrants （Nm） was 7.439， which meant that gene flow was very frequent among different geographical populations. An estimation of non-signification NST （0.075） was bigger than gene differentiation coefficient GST （0.068）. UPGMA tree based on genetic distance and haplotypes suggested that all populations were divided into four groups and had no significant correlation with the geographical distribution of the population. The mode of reproduction （sexual or asexual） of S. oritrepha mainly depended on environmental factors. The genetic variability mainly came from within-population and it has a frequently gene flow among populations.

Key words：? Salix oritrepha， gene flow， Qinghai-Tibetan Plateau， chloroplast DNA， genetic diversity

山生柳（Salix oritrepha）是中國特有物種，落葉矮小灌木，高10～120 cm，藏藥中稱朗瑪，生于海拔3 000～4 700 m的高山地帶，繁衍方式以有性生殖為主，無性繁殖為輔，是青藏高原地區(qū)高寒柳灌叢的建群種和優(yōu)勢(shì)種，具有極高的藥用價(jià)值，對(duì)生態(tài)環(huán)境的保護(hù)也尤為主要。一方面對(duì)山生柳化學(xué)成分的研究，證明其可解熱、消炎止痛、治療婦科疾病和提高機(jī)體免疫力（封士蘭等，2001）;另一方面山生柳是深根性灌木，根深長度達(dá)到植株縱向高度的4 ～ 5倍，故可以抵抗干旱和低溫。由于耐高鹽高堿且生長繁殖快速，故能涵養(yǎng)水源、治沙和防沙，使其起到河岸防護(hù)、水土保持的作用（陳文業(yè)等，2008）。常與高山繡線菊（Spiraea alpina）、金露梅（Potentilla fruticosa）、沙棘（Hippophae rhamnoides）、窄葉鮮卑花（Sibiraea angustata）、大苞柳（Salix pseudospissa）等組成高寒灌叢（王芳等，2010），是藏民牲畜的夏季放牧地。

遺傳多樣性分析是評(píng)價(jià)和保護(hù)瀕危物種的主要指標(biāo)（Cires et al.， 2011），種內(nèi)遺傳多樣性越豐富，物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，保護(hù)了物種和生態(tài)系統(tǒng)的多樣化，也能減慢因?yàn)檫m應(yīng)、進(jìn)化所致的滅亡進(jìn)程。近幾十年來，對(duì)青藏高原地區(qū)植被的遺傳多樣性的研究越來越深入（Duan et al.， 2011; Khan et al.， 2014），這些都對(duì)保護(hù)青藏高原地區(qū)植被豐富度具有重要的指導(dǎo)意義。研究植物遺傳多樣性的方法中，葉綠體基因組DNA被廣泛使用（Demesure et al.， 1996;Rungis et al.， 2017;Wu， 2016）。葉綠體DNA的結(jié)構(gòu)緊湊簡單、分子量小，可從分子角度作比較精準(zhǔn)的分析，其比核DNA存在更加穩(wěn)定、進(jìn)化更加緩慢且編碼序列也保守，故廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性的剖析研究（Shaw et al.， 2014）。葉綠體DNA在大多數(shù)被子植物中為母系遺傳，只通過種子進(jìn)行遺傳，不受花粉遺傳的影響（Mogensen， 1996）。

目前，對(duì)高寒山生柳灌叢的群落特征、在畜牧業(yè)中的作用以及在防止沙漠化中起到的作用都有研究（Kang et al.， 2015;王緯和王盛，2015;楊路存，2013），但對(duì)山生柳遺傳多樣性的研究較少，郭敏等（2012）的研究表明山生柳種群具有較高的遺傳多樣性且隨著海拔梯度的升高而呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，且遺傳變異主要存在于居群內(nèi)，因其所研究的地理分布范圍僅限祁連山，不能準(zhǔn)確分析出山生柳遺傳結(jié)構(gòu)及種群動(dòng)態(tài)。本研究采集了青藏高原大部分地區(qū)的山生柳，設(shè)計(jì)并篩選出兩對(duì)特異性針對(duì)山生柳的cpDNA引物，用葉綠體非編碼區(qū)的聯(lián)合片段對(duì)山生柳進(jìn)行遺傳多樣性研究，將對(duì)山生柳生殖系統(tǒng)的研究、種質(zhì)資源的保護(hù)和生態(tài)環(huán)境的保護(hù)都有重要意義。

1材料與方法

1.1 材料

2006—2017年對(duì)分布于青藏高原地區(qū)的山生柳進(jìn)行廣泛的野外采集。對(duì)每個(gè)野外自然居群選取8～58個(gè)個(gè)體，個(gè)體間距超過100 m，共收集山生柳12個(gè)居群351個(gè)個(gè)體（表1）。采集山生柳生長良好的新鮮幼嫩葉片，迅速用硅膠進(jìn)行干燥，之后放于-20 ℃ 長期保存。所采集的憑證標(biāo)本存放于中國科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館（HNWP）中。

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

選取改良的CTAB法從干燥處理的山生柳嫩葉中提取基因組DNA（Porebski et al.， 1997）。參照序列選取已上傳到NCBI上的Salix arbutifolia、S. babylonica、S. interior、S. oreinoma、S. purpurea、S. suchowensis和S. tetrasperma等柳屬植物葉綠體基因組序列，引物片段的選取參考之前的研究（Hamilton， 1999; Scarcelli et al.， 2011; Shaw et al.， 2005），用軟件Primer Premier 5.0（Singh et al.， 1998）、BioXM 2.6（黃驥和張紅生，2004）和SnapGene 3.2.1（McKeone et al.， 2014）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)了21對(duì)引物用于PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：2.5 μL的10×PCR Buffer（含1.5 mmol·L-1 MgCl2）、0.5 μL的10 mmol·L-1 dNTP、正反引物各0.5 μL（10 pmol·L-1）、1個(gè)單位的Taq DNA酶（TaKaRa，大連）、15～50 ng的模板DNA，去離子水補(bǔ)齊到25 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性45 s;60 ℃退火45 s;72 ℃延伸30 s;35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物送至生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將獲得21對(duì)引物在12個(gè)居群24個(gè)個(gè)體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增預(yù)試驗(yàn)，篩選出獲得兩對(duì)遺傳多態(tài)性較高的引物 [5′trnG2G-3′trnG（UUC）和5′rpS12-rpL20]用于所有個(gè)體的擴(kuò)增測(cè)序（表2）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Chromas軟件（http：//technelysium.com.au/wp/chromas/）和MEGA 7.0.26（Kumar et al.， 2018）對(duì)所有測(cè)序序列進(jìn)行人工校對(duì)，并用MEGA軟件對(duì)校對(duì)好的所有個(gè)體的擴(kuò)增片段進(jìn)行對(duì)位排列。利用DnaSP 6.10.04（Rozas et al.， 2017）軟件確定山生柳單倍型，并統(tǒng)計(jì)中性檢驗(yàn)中的Tajima’s D和Fu’s Fs。運(yùn)用SPSS（George & Mallery， 2003）軟件獲得基于遺傳距離和單倍型分布的UPGMA聚類分析圖。利用Arlequin軟件包（Excoffier & Lischer， 2010）中的分子變異分析方法（analysis of molecular variance， AMOVA）檢測(cè)居群內(nèi)和居群間的遺傳變異水平，并對(duì)單倍型分布的FST進(jìn)行評(píng)價(jià)（1 000次重復(fù)置換檢測(cè)）。根據(jù)基因流（Nm）與遺傳分化系數(shù)（FST）之間的關(guān)系計(jì)算Nm值和居群平均等位基因數(shù)。失配分布（mismatch distribution）分析也在Arlequin中完成。通過PERMUT軟件計(jì)算居群內(nèi)平均遺傳多樣性（average gene diversity within populations，hS）、總遺傳多樣性（total gene diversity，hT）、居群間遺傳分化系數(shù)（GST）和（NST），并用U-統(tǒng)計(jì)方法對(duì)GST和NST進(jìn)行比較（1 000次重復(fù)置換檢測(cè)）以檢測(cè)山生柳單倍型的分布特點(diǎn)（Caraux & Pinloche， 2005）。利用TCS軟件（Clement et al.， 2000）來建立山生柳單倍型之間的TCS簡約網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2結(jié)果與分析

2.1 山生柳遺傳多樣性分析

對(duì)351個(gè)個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單向測(cè)序，利用MEGA軟件對(duì)位排列且刪除poly結(jié)構(gòu)后，5′trnG2G-3′trnG（UUC）和5′rpS12-rpL20片段矩陣長度分別為481 bp、730 bp，共檢測(cè)到36個(gè)變異位點(diǎn)，其中17個(gè)為簡約性信息位點(diǎn)，變異率為2.97%。從山生柳的聯(lián)合片段中檢測(cè)出35個(gè)單倍型（Haplotype， H01～H35），將5′trnG2G-3′trnG（UUC）片段的單倍型序列和5′rpS12-rpL20片段的單倍型序列提交至GeneBank（MK602662～MK602696和MK606373～MK606407）。聯(lián)合片段的單倍型多樣性為0.626 1，單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差為0.029（表3）。各居群聯(lián)合片段之間的多態(tài)性表現(xiàn)不同，居群的平均等位基因數(shù)（Na）依次為1.067、1.078、1.278、1.022、1.656、1.089、1.067、1.100、1.056、1.078、1.089、1.033、1.134。遺傳多樣性最豐富的是居群YS，其具有最高的核苷酸多樣性（0.001 45）、平均核苷酸差異（1.722）和最多的單倍型數(shù)目（13）（表4）。

由各居群的單倍型分布可知，僅H01被全部12個(gè)居群所共享;H04、H05、H06和H07是GZ所擁有的特有單倍型;H11是MQ所擁有的特有單倍型;H17、H18、H19、H20、H21和H32是YS所擁有的特有單倍型;H27、H28、H29和H30是GD所擁有的特有單倍型;H16是MY所擁有的特有單倍型;H15是DR所擁有的特有單倍型;H24、H25和H26是BM所擁有的特有單倍型;H31是NQ所擁有的特有單倍型;H33是QL所擁有的特有單倍型;H34和H35是SN所擁有的特有單倍型;H02，H03，H08，H09，H10，H12，H13，H14，H16，H17，H22，H23是2～10個(gè)居群所共有的單倍型（圖1，表4）。

2.2 山生柳遺傳結(jié)構(gòu)分析

分子變異分析（AMOVA）結(jié)果表明，居群間遺傳變異為6.30%，居群內(nèi)遺傳變異為93.70%（P<0.01），說明居群內(nèi)遺傳變異為山生柳遺傳變異的主要來源（表5）。遺傳分化系數(shù)FST=0.062 98，居群間遺傳分化很小。根據(jù)基因流Nm與FST之間的關(guān)系（Kirk & Freeland， 2011），Nm =（1-FST）/2FST，得到Nm為7.439， 基因流很強(qiáng)。用PERMUT和DnaSP軟件計(jì)算得出山生柳居群內(nèi)平均遺傳多樣山生柳各居群間的遺傳距離大部分都較小，其中QM和NQ之間出現(xiàn)了最大遺傳距離0.977，YS和SN出現(xiàn)了最小遺傳距離0.000，大多數(shù)居群之間的遺傳距離差異性不大，總的平均遺傳距離為0.424;居群間的遺傳分化指數(shù)（FST）顯示有18個(gè)負(fù)值，占27.28%。其中QM和NQ之間出現(xiàn)了最大的FST=0.255 0（表6）。

山生柳12個(gè)居群的遺傳距離的范圍為0.000～1.234，表明山生柳居群內(nèi)遺傳多樣性豐富?；谶z傳距離的UPGMA聚類分析，得到山生柳的12個(gè)居群分為I（YS， SN， MY， DT， QL， BM）、Ⅱ（GZ， MQ， DR）、Ⅲ（GD， NQ）和IV（QM）共四組（圖2）。基于單倍型的UPGMA聚類分析，得到12個(gè)居群分為I（YS， GD， MY）、II（NQ）、III（BM， GZ）和IV（QM， SN， QM， QL， DT， DR）共四組（圖3）。兩者均沒有表現(xiàn)出與12個(gè)居群的地理分布相對(duì)應(yīng)的聚類關(guān)系。

2.3 山生柳種群動(dòng)態(tài)

中性檢驗(yàn)結(jié)果表明，山生柳各個(gè)引物片段和聯(lián)合片段的Tajima’s D（-2.286 70， P<0.01）和Fu’s Fs（-5.298 05， P<0.02）均為顯著的負(fù)值（表3）。失配分析結(jié)果顯示，在山生柳分布范圍內(nèi)其分布曲線整體呈現(xiàn)單峰分布， 其SSD（sum of square devia-tions）值 （0.003 8， P=0.68）和HRag （Harpending’s raggedness index）值（0.047 9， P=0.72）均不顯著（P>0.05），這與中性檢驗(yàn)的結(jié)果相一致（圖4）。

用山生柳葉綠體基因所檢測(cè)出的35個(gè)單倍型，建立單倍型多樣性的簡約網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）?；芈方Y(jié)構(gòu)是趨同演化的結(jié)果，矩形框代表祖先（或根部）單倍型即H01（Saltonstall， 2002）。圖5中略去了單倍型的頻率數(shù)值。圖5中“o”表示理論分析出的，但沒有實(shí)際觀測(cè)到的單倍型。除YS（H32）和DG（H27，H29）的單倍型同其它單倍型關(guān)系較遠(yuǎn)外，大部分單倍型之間僅有一到兩步突變，演化關(guān)系呈現(xiàn)星狀輻射結(jié)構(gòu)（楊玉慧等，2004）。

3討論

3.1 山生柳的居群遺傳多樣性

篩選出的山生柳特異性條帶為山生柳無性系鑒定提供可操作性。山生柳的聯(lián)合片段共檢測(cè)到36個(gè)變異位點(diǎn)和17個(gè)簡約性的信息位點(diǎn)，插入缺失變異位點(diǎn)19個(gè)，占總變異的52.78%。插入缺失是山生柳變異位點(diǎn)出現(xiàn)的主要來源，與DNA在進(jìn)行復(fù)制時(shí)存在高頻率的點(diǎn)突變有關(guān)。在殘酷的高山圖 4基于山生柳單倍型的失配分析山地冰雪寒溫帶生存環(huán)境中，山生柳的DNA復(fù)制發(fā)生堿基錯(cuò)配的可能性更大，機(jī)體的自我修復(fù)功能會(huì)受到一定阻礙，說明惡劣的生存環(huán)境可能在一定程度上影響DNA復(fù)制過程（Baccarelli & Bollati， 2009; Chinnusamy & Zhu， 2009; Dubrova， 2003）。

對(duì)山生柳居群的聯(lián)合片段進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢測(cè)到35個(gè)單倍型。數(shù)據(jù)分析的結(jié)果總體呈現(xiàn)出較低的遺傳多樣性（Hd=0.626 1， Pi=0.000 85）。山生柳每個(gè)居群間的單倍型多樣性（Hd）表現(xiàn)不同，推測(cè)可能是由于在青藏高原地區(qū)的山生柳分布范圍廣，各居群所在的自然生存環(huán)境條件具有差異，經(jīng)過長期不同的生態(tài)環(huán)境和自然選擇，會(huì)導(dǎo)致具有一定地理隔離的山生柳居群存在差異的遺傳多樣性。根據(jù)之前對(duì)山生柳在祁連山上不同海拔種群的遺傳多樣性水平的研究結(jié)論（郭敏等，2012），推測(cè)不同的地理位置、生存環(huán)境和海拔高度都體現(xiàn)山生柳不顯著的分子水平的差異性，但是差異性不會(huì)太大。

3.2 山生柳的居群遺傳結(jié)構(gòu)

AMOVA分子變異結(jié)果表明，山生柳居群內(nèi)的遺傳變異占總變異的93.70%（P<0.01），居群間的遺傳變異僅為6.30%，揭示了山生柳居群內(nèi)的遺傳變異比居群間的遺傳變異要大，居群內(nèi)的遺傳變異是山生柳遺傳變異的主要來源。推測(cè)的原因：（1）35個(gè)單倍型中僅有H01為12個(gè)居群都擁有的共享單倍型，共有208個(gè)個(gè)體擁有，所占比例為59.26%，由于H01在居群中是無規(guī)律分布，因此山生柳居群間的遺傳差異并不明顯;（2）35個(gè)單倍型中有22個(gè)單倍型是各個(gè)居群所獨(dú)有，甚至某一居群會(huì)同時(shí)固定多個(gè)特有單倍型，這就說明山生柳的某些居群內(nèi)部會(huì)有可辨別的遺傳變異。特有單倍型比例較高的物種往往不能揭示出明顯的譜系地理格局（Geng et al.， 2018）。繁育系統(tǒng)和遺傳變異分布之間存在著密切的聯(lián)系（Hogbin & Peakall， 1999），即異交物種的遺傳變異大多分布在群體之內(nèi)，群體間的遺傳變異通常占27%以下（趙景奎等，2008），與本研究結(jié)果相符。

植物居群的遺傳結(jié)構(gòu)受群體進(jìn)化歷史、基因流等影響，群體進(jìn)化歷史一般通過遺傳分化指數(shù)（FST）來反映，其大小可在一定程度上揭示種群間基因流和遺傳漂變的程度（楊艷婷等，2018）。一般來講，當(dāng)FST∈[0，0.05），群體間沒有遺傳分化;當(dāng)FST∈[0.05，0.15），群體分化程度中等;當(dāng)FST∈[0.15，0.25），群體間高度分化;FST∈[0.25，1]，群體間分化程度非常高（Wright，1950，1970）。山生柳自然居群的遺傳分化指數(shù)（FST）為0.062 98，表明居群分化程度為中等。山生柳各居群間的遺傳分化指數(shù)（FST）有19個(gè)負(fù)值，占28.79%（正常情況下FST∈[0，1]），表明少部分居群間沒有分化，但總體上反映出的是大部分居群間出現(xiàn)非常普遍的基因交流（Wright， 1950， 1970， 1982），其中QM和NQ之間的FST值最大為0.255 0。山生柳一般為有性生殖，花粉量大隨風(fēng)飄散，但在嚴(yán)酷的生存環(huán)境下會(huì)進(jìn)行無性繁殖，本研究所選的山生柳材料地理分布較廣、地理環(huán)境高度復(fù)雜，導(dǎo)致居群間遺傳變異的差異性較大，有的居群幾乎無遺傳分化（QM， DT），有的居群分化程度非常高（QL），但總體還是表現(xiàn)為分化程度中等偏低。

根據(jù)基因流公式，算得Nm=7.438，當(dāng)Nm=7.438>1，屬于較高水平（Wright，1982），表明不同的居群之間存在頻繁的基因流動(dòng)，增大群體間遺傳差異的表現(xiàn)一般為自然選擇以及遺傳漂變，而基因流可以“弱化”群體之間不易察覺的遺傳差異使居群間趨向統(tǒng)一。

對(duì)山生柳單倍型變異的地理結(jié)構(gòu)檢驗(yàn)結(jié)果為GST值（0.068）和NST值（0.075）（NST>GST，P>0.05），表明山生柳不同居群間出現(xiàn)了大量的親緣關(guān)系靠近的單倍型，可以證明山生柳不存在明顯的譜系地理學(xué)的關(guān)系?；谶z傳距離和單倍型的UPGMA聚類分析，得到山生柳的12個(gè)居群各分為四組且與12個(gè)居群地理分布沒有明顯相關(guān)性，進(jìn)一步驗(yàn)證了山生柳居群不具有譜系地理結(jié)構(gòu)。

3.3 山生柳的種群擴(kuò)張

基因流分析結(jié)果證實(shí)山生柳的12個(gè)居群存在頻繁的基因交流，山生柳居群間不存在明顯的基因流限制。通過對(duì)所有地理居群單倍型進(jìn)行失配分析，所有的山生柳單倍型呈現(xiàn)只有一個(gè)明顯頂峰的單峰型曲線，表示不能拒絕居群擴(kuò)張的假說。中性檢驗(yàn)的結(jié)果表明，Tajima’s D （-2.286 70， P<0.01）和Fu’s Fs（-5.298 05， P<0.02）均為顯著的負(fù)值，這與失配分析的單峰型曲線結(jié)果相一致。TCS網(wǎng)絡(luò)圖顯示H01單倍型為祖先單倍型，由于H01為種群的共享單倍型，故不能確定山生柳種群的擴(kuò)散中心。TCS網(wǎng)絡(luò)圖呈星狀輻射分布，且新衍生出的單倍型與原始單倍型組成一個(gè)“星狀”輻射結(jié)構(gòu)，說明該群體曾經(jīng)在遇到瓶頸后迅速擴(kuò)增（Arbogast， 2000）。通過單倍型多樣性與核苷酸多樣性分析得到單倍型多樣性高（Hd>0.5）而核苷酸多樣性低（Pi<0.005），預(yù)示著群體曾經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)后，伴隨了迅速的種群擴(kuò)張與變異的積累。綜上所述，推測(cè)山生柳在其分布范圍或者其個(gè)體數(shù)近期經(jīng)歷過擴(kuò)張。

對(duì)青藏高原地區(qū)相同生境的高山繡線菊（Khan et al.， 2014）、金露梅（Ma et al.， 2014）、沙棘（Bartish et al.， 2006）、窄葉鮮卑花（Duan et al.， 2011）等灌木的種群動(dòng)態(tài)研究表明其遺傳分組曾經(jīng)歷過快速的種群擴(kuò)張事件。這與山生柳的種群擴(kuò)張結(jié)果一致，推測(cè)物種生境和繁育方式的相似性會(huì)出現(xiàn)物種為了營養(yǎng)、繁殖、保護(hù)、擴(kuò)散以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)出現(xiàn)協(xié)同進(jìn)化的現(xiàn)象（Morgan et al.， 2005; Thompson & Burdon， 1992）。有研究表明山生柳種群可能以有性和無性兩種繁殖方式進(jìn)行更新以鞏固其優(yōu)勢(shì)地位（李毅等，2002），年齡結(jié)構(gòu)分布圖呈正三角形，種群動(dòng)態(tài)表現(xiàn)為增長型（李毅等，2002），這與本研究中居群近期出現(xiàn)過擴(kuò)張相吻合。花粉和種子的擴(kuò)散是自然植物種群最主要的基因流方式（李海生和陳桂珠，2004），故山生柳生殖方式的多樣化會(huì)導(dǎo)致其基因交流頻繁，預(yù)期未來山生柳居群會(huì)處于進(jìn)一步擴(kuò)張狀態(tài)。

山生柳頻繁的基因交流和經(jīng)歷過近期擴(kuò)張，猜測(cè)此結(jié)果可能的原因如下：（1）cpDNA是母系遺傳，估算的基因流大小與花粉傳播無關(guān)，與其多樣化的繁育方式有關(guān);（2）山生柳一般以有性生殖為主，其生存環(huán)境是長期積雪（低溫）、干燥風(fēng)大等氣象特點(diǎn)，使其種子可以隨處傳播;（3）由于種子的傳播距離遠(yuǎn)，故青藏高原地區(qū)和橫斷山脈錯(cuò)綜復(fù)雜地形也只能在很小的程度上阻隔山生柳居群間的基因交流;（4）在嚴(yán)酷環(huán)境壓力下，山生柳種子活力極低，幼苗補(bǔ)充量受限，從而有性生殖受限，此時(shí)主要依托無性繁殖來鞏固其物種數(shù)量的穩(wěn)定（陳文業(yè)等，2008）。

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