李志健 楊麗紅杜 飛 于之涵 李俊煒

（陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，陜西省造紙技術(shù)及特種紙品開發(fā)重點實驗室，輕化工程國家級實驗教學(xué)示范中心，陜西西安，710021）

抗菌紙的研究是近年來抗菌材料應(yīng)用的一個新領(lǐng)域，由于它與人們的工作、生活休戚相關(guān)，有很大的實用價值，引起了人們的普遍關(guān)注，因此發(fā)展十分迅猛，如醫(yī)療用紙、新生兒用紙等。單一的抗菌劑往往不能滿足抗菌紙的某種要求，抗菌劑的使用向著混合聯(lián)用的方向發(fā)展。

殼聚糖是天然多糖幾丁質(zhì)的脫乙酰產(chǎn)物[1-2]，具有良好的生物相容性和生物降解性，且本身無毒無害，具有抗菌能力，被廣泛用于服裝、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品包裝等領(lǐng)域。由于殼聚糖本身的抗菌能力較弱，因此研究者們對殼聚糖進行物理或化學(xué)改性，或者引入外源抗菌因子與殼聚糖混合聯(lián)用來提高殼聚糖復(fù)合材料的抗菌性能[3-6]。Zhang等人[7]將納米TiO2粉末混入殼聚糖溶液中制成薄膜用于食品包裝，來延長食物的保鮮時間。Simin等人[8]將殼聚糖納米纖維與纖維素納米纖維復(fù)合后制成薄膜涂覆于紙幣上來賦予紙幣抗菌性能。

納米銀具有殺菌作用，滲透性強且無任何耐藥性[9-11]，近年來，銀也作為一種功能性材料發(fā)展很快。李爽等人[12]綜述了將納米銀負載于纖維上制備抗菌紙，納米銀作為光催化氧化的催化劑可以用作造紙廢水處理等工業(yè)用途。Kofi等人[13]采用一步火焰法將納米銀粒子噴涂于纖維材料上制備抗菌紙。但銀作為一種重金屬，大量的使用對生產(chǎn)者和使用者均有一定的危害，因此在達到相同抗菌能力的前提下，減少銀的使用成為研究的重點。

本實驗通過將納米銀和殼聚糖有效混合后使用，使紙張獲得協(xié)同的抗菌性能，既減少了納米銀的使用量，也改善了單一殼聚糖抗菌性能弱的問題。為了滿足抗菌劑在抗菌紙中應(yīng)用的需求，對兩種抗菌劑最佳濃度和添加量進行了研究。

1 實 驗

1.1 實驗原料

闊葉木漿板，江蘇UPM公司；殼聚糖，脫乙酰度＞90%，上海展云化工有限公司；營養(yǎng)物質(zhì)（蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏、瓊脂粉），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硝酸銀（AgNO3），分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；檸檬酸鈉，分析純，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；大腸桿菌原液，國家微生物菌種保藏中心。

1.2 實驗設(shè)備

槽式打漿機（TD8-23，咸陽通達輕工設(shè)備有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)漿料疏解機（992304，瑞典L＆W）；紙樣抄取器（TD10-200，咸陽通達輕工設(shè)備有限公司）；手提式壓力蒸汽滅菌器（GMSX-280，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；微生物培養(yǎng)箱（DHP-9031，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；激光顯微拉曼成像光譜儀（DXRxi，賽默飛世爾科技（中國）分子光譜部）；環(huán)境掃描電子顯微鏡（Q45，美國FEI和EDAX）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9053A，上海一恒科技有限公司）；電子天平（MC249，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 納米銀抗菌劑的制備

將AgNO3白色晶體分別按0.05mmol/L、0.5mmol/L配成AgNO3溶液，將檸檬酸鈉白色粉末與去離子水按質(zhì)量比1︰99配成質(zhì)量分數(shù)為1%的檸檬酸鈉溶液。取100 mL硝酸銀溶液置于250 mL圓底燒瓶中，開啟電動攪拌器攪拌并打開冷凝回流裝置，油浴升溫并加熱，最終將溫度設(shè)定為120℃。待溶液開始沸騰后加入2 mL檸檬酸鈉溶液繼續(xù)加熱，回流1 h后停止反應(yīng)，得到納米銀（溶膠）抗菌劑[14-15]。避光常溫下保存。

1.3.2 殼聚糖抗菌劑的制備

（1）漿內(nèi)添加

稱取1 g聚乙烯醇（PVA）加入到20 mL去離子水中，加熱攪拌至溶化，然后稱取2 g殼聚糖加入到PVA溶液中，攪拌均勻，得到殼聚糖抗菌劑。PVA溶液具有一定的膠黏性，在漿內(nèi)添加抗菌劑的抄紙過程中加入可以防止抗菌劑的流失。

（2）表面涂布

稱取2 g殼聚糖加入到500 mL質(zhì)量分數(shù)約0.2%的稀醋酸溶液中，室溫下攪拌使其混合均勻。溶解7～8 h后配制成質(zhì)量分數(shù)約為0.4%的殼聚糖溶液。向殼聚糖溶液中滴加質(zhì)量分數(shù)為0.2%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.5，此時殼聚糖溶膠從溶液中析出，溶液由澄清透明變?yōu)榘咨闈嵋?。?00 mL殼聚糖乳濁液進行抽濾，得到殼聚糖抗菌劑。

1.3.3 殼聚糖/納米銀混合抗菌劑的制備

（1）漿內(nèi)添加

稱取1 g PVA加入到20 mL去離子水中，加熱攪拌至溶化，然后稱取2 g殼聚糖加入到PVA溶液中，攪拌均勻后滴加納米銀抗菌劑，繼續(xù)攪拌得到殼聚糖/納米銀混合抗菌劑。

（2）表面涂布

稱取2 g殼聚糖加入到500 mL質(zhì)量分數(shù)約0.2%的稀醋酸溶液中，室溫下攪拌使其混合均勻。溶解7～8 h后配制成質(zhì)量分數(shù)約為0.4%的殼聚糖溶液。向殼聚糖溶液中滴加質(zhì)量分數(shù)為0.2%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為7.5，此時殼聚糖溶膠從溶液中析出，溶液由澄清透明變?yōu)榘咨闈嵋骸Ｈ?00 mL殼聚糖乳濁液進行抽濾，得到殼聚糖抗菌劑，然后滴加納米銀抗菌劑，攪拌均勻后得到殼聚糖/納米銀混合抗菌劑。

1.3.4 抗菌紙的制備

（1）漿內(nèi)添加

設(shè)置漿料打漿度為50°SR，紙張定量為60 g/m2，制備不同抗菌劑添加量的抗菌紙。實驗室紙頁成型器的面積為0.0317 m2，抄片的絕干漿質(zhì)量為2 g，將所得抗菌紙剪切成直徑為20 mm的小圓片備用。

控制紙張定量不變，分別抄造添加單一殼聚糖抗菌劑的抗菌紙、添加單一納米銀抗菌劑的抗菌紙、添加殼聚糖/納米銀混合抗菌劑的抗菌紙，添加抗菌劑的配比如表1和表2所示（所用納米銀抗菌劑為0.5 mmol/L）

（2）表面涂布

設(shè)置漿料打漿度50°SR，紙張定量為60 g/m2，抄造空白紙（不加抗菌劑）10張。將空白紙裁剪至直徑為20 mm的圓紙片備用，圓紙片的絕干漿質(zhì)量為0.02 g；將圓紙片放置在平整的玻璃板上，用涂布棒進行涂布，待其晾干后，密封遮光保存，備用。

表1 漿內(nèi)添加單一抗菌劑的配比

表2 漿內(nèi)添加混合抗菌劑的配比

分別抄造涂布單一殼聚糖抗菌劑的抗菌紙、涂布單一納米銀抗菌劑的抗菌紙、涂布殼聚糖/納米銀混合抗菌劑的抗菌紙。添加抗菌劑的配比如表3和表4所示（所用納米銀抗菌劑為0.05 mmol/L）。

表3 表面涂布單一抗菌劑的配比

表4 表面涂布混合抗菌劑的配比

1.3.5 抗菌實驗

（1）制作生物培養(yǎng)基

稱取一定量的營養(yǎng)物質(zhì)放入燒杯中，將燒杯放在萬用爐上加熱，用玻璃棒攪拌直至溶質(zhì)溶解，用5 mol/L NaOH（約0.2 mL）調(diào)pH值至7.0，用去離子水定容至1 L，分裝入三個錐形瓶中，用棉塞塞住并用報紙包住瓶口，與所用的平板培養(yǎng)皿、鑷子、玻璃棒、接種環(huán)一起在121℃高壓滅菌20 min。滅菌后開始倒平板，冷卻至50℃左右，將培養(yǎng)基迅速倒入無菌平板培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿倒入約2/3的培養(yǎng)基，蓋上培養(yǎng)皿蓋后，輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平放在操作臺上，待瓊脂凝固后即制得平板，操作過程均為無菌環(huán)境。培養(yǎng)基成分如表5所示。

表5 培養(yǎng)基成分

（2）接種大腸桿菌進行抗菌實驗

用滅菌后的接種環(huán)，將大腸桿菌均勻接種于凝固的培養(yǎng)基上，然后將抗菌紙放置于培養(yǎng)基表面，將培養(yǎng)基放置于微生物培養(yǎng)箱，在溫度30℃、濕度90%環(huán)境下培養(yǎng)48 h后觀察，并將抗菌實驗后所得抑菌環(huán)直徑從不同角度測量3次，取其平均值，進行分析。

1.3.6 抗菌紙抗菌機理的研究

（1）環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM）分析

在溫度30℃、濕度90%的微生物培養(yǎng)箱中進行48 h抑菌環(huán)實驗，選取培養(yǎng)皿中距抑菌環(huán)最遠處的大腸桿菌和相同培養(yǎng)皿中抑菌環(huán)邊緣大腸桿菌，制作ESEM樣本。用接種針分別將所選大腸桿菌從培養(yǎng)基中取下直徑為1.5 mm的菌落，在200 μL的生理鹽水中稀釋，充分分散后，吸取1滴在鋁箔紙上，將鋁箔紙放入30℃烘箱內(nèi)干燥后，用導(dǎo)電膠將其粘貼在載物片上進行觀察。

（2）激光顯微拉曼成像光譜分析

選取與ESEM制樣同組樣品的大腸桿菌進行制樣，用接種針分別將所選大腸桿菌從培養(yǎng)基中取下直徑為1.5 mm的菌落，放入200 μL生理鹽水中稀釋，離心15 min，吸取上清液后再次加水離心，重復(fù)3次，避免大腸桿菌懸液中培養(yǎng)基的干擾。振蕩均勻后，吸取1滴于鋁箔紙上，放入30℃烘箱內(nèi)干燥，將其用雙面膠固定于載物片上進行觀察。

激光顯微拉曼成像光譜儀的測試條件：激光器的激發(fā)波長532 nm；激光功率水平10 mW。特征拉曼光譜圖數(shù)據(jù)[16-17]如表6所示。

表6 特征拉曼光譜圖數(shù)據(jù)

（3）抗菌性能檢測

采用抑菌環(huán)實驗[18-19]對所得抗菌紙進行抗菌性能檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗菌實驗結(jié)果分析

2.1.1 抗菌劑用量對抗菌紙抗菌性能的影響

選取表1和表3所示殼聚糖抗菌劑配比進行分析。

圖1為不同殼聚糖添加量抗菌紙的抗菌效果圖。從圖1可以看出，抗菌紙的抗菌性能與殼聚糖的添加量成正比，隨著殼聚糖添加量的增加，抑菌環(huán)直徑增大，抗菌紙的抗菌性能增強。圖2為殼聚糖添加量對抗菌紙抑菌環(huán)直徑的影響。從圖2可以看出，隨著殼聚糖添加量的增加，抑菌環(huán)直徑不斷增大，當(dāng)殼聚糖添加量為7.5%時，抑菌環(huán)直徑變化不大，抗菌紙所體現(xiàn)出的抗菌性能變化趨于平緩，為了保證抗菌紙有良好的抗菌效果和抗菌穩(wěn)定性，選取10.0%為殼聚糖最佳添加量。

2.1.2 抗菌劑添加方式對抗菌紙抗菌性能的影響

選取殼聚糖添加量10.0%和納米銀溶膠添加量0.54%時不同添加方式的樣本進行分析。

抗菌劑添加方式對抗菌紙抗菌性能的影響如圖3、圖4所示。從圖3可以看出，漿內(nèi)添加與表面涂布兩種方式所得抗菌紙的抑菌環(huán)實驗均有抑菌環(huán)出現(xiàn)，而且抗菌紙遠處的大腸桿菌生長良好；從圖4可以看出，在抗菌劑添加量相對于絕干漿質(zhì)量相同時，表面涂布所得抗菌紙抑菌環(huán)的直徑均大于漿內(nèi)添加抗菌劑所得抗菌紙?；旌咸砑訒r，其中漿內(nèi)添加混合抗菌劑的抑菌環(huán)直徑為23.9 cm，表面涂布混合抗菌劑的抑菌環(huán)直徑為25.1 cm，表面涂布抑菌環(huán)的直徑相較于漿內(nèi)添加增大4.8%。

2.2 抗菌劑對大腸桿菌的抗菌機理分析

2.2.1 抑菌環(huán)遠處大腸桿菌結(jié)果分析

圖5所示為ESEM的結(jié)果。由圖5可以看出，大腸桿菌呈橢圓形的枕頭狀，形狀飽滿，并且其尺寸大小均一，分布密集。

激光顯微拉曼成像光譜測試結(jié)果如圖6所示。從圖6(a)可以看出，大腸桿菌維持著完整的細胞結(jié)構(gòu)，核膜結(jié)構(gòu)完整。圖6(b)結(jié)果顯示，拉曼位移在858 cm－1的吸收為酪氨酸吸收峰，在1308 cm－1處的吸收為酰胺Ⅲ、β-回折、腺嘌呤吸收峰，在1442 cm－1處的吸收峰為脫氧核糖吸收峰，在1667 cm－1處的吸收為胸腺嘧啶，C＝＝O伸縮振動，酰胺Ⅰ吸收峰。拉曼成像結(jié)果表明，大腸桿菌的核膜結(jié)構(gòu)完整。ESEM與激光顯微拉曼成像光譜測試結(jié)果均說明抑菌環(huán)遠處的大腸桿菌并未受到抗菌劑的影響。

圖1 不同殼聚糖添加量抗菌紙的抗菌效果圖

圖2 殼聚糖添加量對抗菌紙抑菌環(huán)直徑的影響

圖3 抗菌劑不同添加方式所得抗菌紙的抗菌效果

圖4 抗菌劑的添加方式對抗菌紙抑菌環(huán)直徑的影響

圖5 抑菌環(huán)遠處大腸桿菌的ESEM圖像

圖6 抑菌環(huán)遠處大腸桿菌拉曼光譜圖

2.2.2 抑菌環(huán)邊緣大腸桿菌結(jié)果分析

抑菌環(huán)邊緣大腸桿菌的ESEM圖像如圖7所示。從圖7可以看出，與圖5相比，其中部分細菌的形態(tài)已經(jīng)發(fā)生了變化。出現(xiàn)了偏圓形和細長桿狀的大腸桿菌，大腸桿菌形態(tài)的大小不一，形狀皺癟，不飽滿，細菌分布的密集程度較低并且很多細菌已經(jīng)出現(xiàn)粘連現(xiàn)象。

圖7 抑菌環(huán)邊緣大腸桿菌的ESEM圖像

激光顯微拉曼成像光譜儀測試結(jié)果如圖8所示。從圖8(a)可以看出，抑菌環(huán)邊緣大腸桿菌未顯示出完整的細胞結(jié)構(gòu)，且有物質(zhì)流出；圖8(b)為整個大腸桿菌拉曼光譜圖，其中代表細胞膜的位置未出峰，表明大腸桿菌的細胞膜已經(jīng)破裂，此外還出現(xiàn)了新的特征峰；在541 cm－1處的吸收為二硫鍵的色氨酸吸收峰，并且二硫鍵有反式-扭曲反式構(gòu)象；圖8(c)和圖8(d)表示細胞的流出物；圖8(d)所示在541 cm－1處的吸收為色氨酸吸收峰，在1442 cm－1處的吸收為脫氧核糖吸收峰，即代表大腸桿菌擬核結(jié)構(gòu)破碎，說明在抑菌環(huán)邊緣的大腸桿菌核膜結(jié)構(gòu)已經(jīng)破裂，不能維持細胞原有狀態(tài)。

ESEM與激光顯微拉曼光譜結(jié)果均驗證了抑菌環(huán)邊緣大腸桿菌中部分細菌的形態(tài)已發(fā)生了變化?？咕鷦┎粌H阻礙大腸桿菌的生長，而且會使細菌的核膜結(jié)構(gòu)受損，細菌不能維持正常的生長發(fā)育，從而死亡。

3 結(jié)論

將納米銀溶膠和殼聚糖混合后作為抗菌劑，并采用漿內(nèi)添加和表面涂布兩種方法制備抗菌紙，分析殼聚糖與納米銀溶膠的添加量對抗菌紙抗菌性能的影響。

3.1 殼聚糖添加量與抗菌紙的抗菌性能成正比，隨著殼聚糖添加量的增加，抑菌環(huán)的直徑增大，抗菌紙的抗菌性能增加；殼聚糖添加到一定量時，繼續(xù)增大殼聚糖的添加量，抗菌性能變化趨于不變，因此殼聚糖最佳添加量為10.0%。

3.2 表面涂布抗菌劑所制得的抗菌紙抗菌性能均強于漿內(nèi)添加抗菌劑的抗菌紙；當(dāng)殼聚糖添加量為10.0%和納米銀溶膠添加量為0.54%時，表面涂布混合抗菌劑的抑菌環(huán)直徑可達到25.1 mm，相比于漿內(nèi)添加混合抗菌劑，抑菌環(huán)直徑增大4.8%。

圖8 抑菌環(huán)邊緣大腸桿菌拉曼光譜圖

3.3 殼聚糖/納米銀的協(xié)同抗菌能力強于單一抗菌劑的抗菌能力，與添加單一抗菌劑所達到相同抗菌效果的前提下，可減少納米銀的添加量。