摘 要:研究內(nèi)生細(xì)菌CX15的活性作用及活性代謝物。采用HPLC法對CX15發(fā)酵液中活性代謝物進(jìn)行分析;采用濾紙片法對內(nèi)生細(xì)菌CX15進(jìn)行抑菌活性研究;結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16S rDNA序列同源性分析對該菌株進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明,內(nèi)生細(xì)菌CX15發(fā)酵液中含有咖啡酸;同時,該菌株具有較好的抑菌活性;經(jīng)鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),說明內(nèi)生細(xì)菌CX15為咖啡酸產(chǎn)生菌,該菌可能與宿主植物刺五加具有相同的代謝機(jī)制。
關(guān)鍵詞:內(nèi)生細(xì)菌;抑菌活性;鑒定;咖啡酸
中圖分類號:R932; Q939.97
文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A
刺五加(Acanthopanax sentcosus(Rupr.et Maxim.)Harms)為北方瀕危藥用植物[1],具有抗腫瘤[2],抗氧化、免疫調(diào)節(jié)[3],抗抑郁[4]、降血糖[5]等作用,現(xiàn)廣泛應(yīng)用于食品、藥品領(lǐng)域[6],其主要活性成分為黃酮類、簡單苯丙素類、有機(jī)酸類、香豆素類、三萜皂苷類、氨基酸類以及其他類化合物[7]。
本文基于內(nèi)生菌與宿主植物在長期協(xié)同進(jìn)化過程中形成了互惠共生關(guān)系理論,即:宿主植物為內(nèi)生菌生長發(fā)育提供必需的生態(tài)環(huán)境,避免外界生物或非生物的干擾等[8];同時,內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物能夠刺激植物生長發(fā)育,提供宿主植物對環(huán)境脅迫的抵抗能力[9],刺激宿主產(chǎn)生各種次生代謝產(chǎn)物以維護(hù)機(jī)體的健康[10]。以刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX15為研究對象,對其發(fā)酵液中次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析;同時也開展活性研究;并對其進(jìn)行了菌種鑒定。為綜合利用該菌株,采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)刺五加活性成分奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1 菌種與培養(yǎng)
供試菌:刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX15(黑龍江大學(xué)生物制藥專業(yè)實(shí)驗(yàn)惠贈)。
NA培養(yǎng)基由牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉組成;PDA培養(yǎng)基由馬鈴薯、葡萄糖組成[11]。
16Sr DNA序列擴(kuò)增引物(上海生工生物工程股份有限公司)。
1.2儀器與試劑
高效液相色譜儀(FL2 200型,浙江溫嶺)。
試劑:甲醇為色譜純級別,其他試劑均為分析純。
1.3內(nèi)生細(xì)菌CX15發(fā)酵液供試品的制備
取已活化的CX15菌株接種于NA液體培養(yǎng)基中,120r/min,37℃振蕩發(fā)酵培養(yǎng)5d,取出,于2000r/min離心10min,得發(fā)酵液,凍干,備用。
1.4內(nèi)生細(xì)菌CX15發(fā)酵液分析
采用HPLC法對CX15菌株發(fā)酵液中活性成分進(jìn)行分析。取內(nèi)生細(xì)菌CX15發(fā)酵液分析供試品液,甲醇溶解,微孔濾膜過濾( 0.45um),取濾液作為供試品溶液。分別精密吸取0.5mg/mL咖啡酸對照品液及供試品液各10uL注入色譜儀,色譜柱:Venusil XBP-C18柱;流動相:甲醇-水-磷酸(30:70: 0.2);流速:1 mL/min;檢測波長:254nm。
1.5抑菌活性檢測
取內(nèi)生細(xì)菌CXl-5發(fā)酵液的供試品,以適量甲醇溶解成1mg/mL的供試品液,過濾(0.22um無菌濾器),采用濾紙片法[12],進(jìn)行抑菌活性測定。
1.6內(nèi)生細(xì)菌CX15菌株鑒定
1.6.1內(nèi)生細(xì)菌CX15形態(tài)學(xué)觀察及生理生化指標(biāo)測定
形態(tài)學(xué)鑒定主要觀察內(nèi)生細(xì)菌CXl5菌株的菌落、細(xì)胞形態(tài),革蘭氏染色,有無鞭毛等;生理生化測定主要選取以下微生物常用的指標(biāo)進(jìn)行鑒定:生長溫度的測定,需氧性的測定,耐鹽性的測定,耐酸堿度的測定,生長曲線的測定,淀粉水解反應(yīng),明膠液化試驗(yàn),酶的測定,甲基紅試驗(yàn),運(yùn)動性試驗(yàn)等[13]。
1.6.2 16S rDNA序列擴(kuò)增和序列分析
利用細(xì)菌16S rDNA基因的通用引物對內(nèi)生細(xì)菌CX15菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測定。將獲得的序列與GenBank中相關(guān)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析,并利用最大簡約法構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹[14]。
2結(jié)果與分析
2.1 內(nèi)生細(xì)菌CX15發(fā)酵液分析結(jié)果
通過HPLC法,以咖啡酸為對照,對CX15發(fā)酵液中活性成分進(jìn)行分析,在CX15發(fā)酵液中檢測到咖啡酸,而陰性對照(培養(yǎng)基)無干擾;同時CX15發(fā)酵液中色譜峰采用對照品加入法,得到了較好的確認(rèn),其結(jié)果如圖1及圖2所示;同時,在CX15發(fā)酵液中還存在與刺五加生藥相同的未知成分x,說明在CX15發(fā)酵液中含有大量的與宿主植物刺五加相同或相似的活性代謝物。
2.2抑菌活性檢測結(jié)果
刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX15發(fā)酵液對11種致病菌均有不同程度的抑制作用,結(jié)果見表1。
2.3內(nèi)生細(xì)菌CX15菌株鑒定結(jié)果
2.3.1內(nèi)生細(xì)菌CX15菌株形態(tài)學(xué)觀察及生理生化指標(biāo)測定結(jié)果
CX15菌株形態(tài)學(xué)觀察及生理生化指標(biāo)測定結(jié)果見表2。
2.3.2 16S rDNA序列擴(kuò)增和序列分析結(jié)果
CX15菌株P(guān)CR擴(kuò)增后得到1條1603bp的特異性條帶,通過GENBANK比對,CX15(登錄號為:JQ756968)與枯草芽孢桿菌KT873853.1序列相似性達(dá)到92%,綜合生理生化和16S rDNA基因序列的分析結(jié)果,初步鑒定菌株CX15為枯草芽孢桿菌(Bacillus suhtilis)。菌株CX15系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。
3結(jié)論
本研究對刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX15發(fā)酵液進(jìn)行初步分析,發(fā)現(xiàn)在刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX15發(fā)酵液中存在與宿主植物刺五加相同的活性成分咖啡酸,說明內(nèi)生細(xì)菌CX15為咖啡酸產(chǎn)生菌;同時也說明刺五加內(nèi)生細(xì)菌CX15在次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生機(jī)制方面與宿主植物刺五加有著相似之處。為了深入開發(fā)應(yīng)用內(nèi)生細(xì)菌CX15,對其進(jìn)行了抑菌活性研究,也同時對其進(jìn)行了菌株鑒定。若開展系統(tǒng)提取分離法,對CX15發(fā)酵液中咖啡酸等活性代謝物進(jìn)行分離、鑒定等研究將具有重要意義。以CX15為發(fā)酵菌株,開展微生物發(fā)酵法生產(chǎn)咖啡酸原料及CX15菌株的綜合利用研究工作還在繼續(xù)進(jìn)行中。
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作者簡介 :康勛 ( 1978- ),男,江省濱人,高級藝師,現(xiàn)從事業(yè)技術(shù)推廣與服務(wù)工作。