仝倩倩 李亞亮 王順昌 顏守保

摘 要：基因組重排技術(shù)是21世紀(jì)初發(fā)展起來的基于全基因組的定向微生物菌種改良技術(shù).本文介紹了基因組重排技術(shù)的原理，并重點(diǎn)概述了基因組重排的具體過程，最后對(duì)基因組重排技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了展望.

關(guān)鍵詞：基因組重排;遞推;原生質(zhì)體融合;育種

中圖分類號(hào)：Q789? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2019）10-0018-02

基因組重排技術(shù)（genome shuffling）是一種基于整個(gè)微生物基因組重排的定向菌種改良技術(shù)，2002年，Zhang首先提出基因組重排這一概念：它無須提前知道菌株的代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制等遺傳背景，直接對(duì)微生物進(jìn)行全基因組重排[1]，現(xiàn)在已被視為一種有效的微生物育種方法.

1 基因組重排原理

基因組重排是在傳統(tǒng)誘變育種獲得突變株后，通過遞推式原生質(zhì)體融合技術(shù)，對(duì)突變株的原生質(zhì)體進(jìn)行基因組重排，將正突變的基因集中在一起，從而大大提升菌株的正向突變的頻率及突變的速率.基因組重排技術(shù)一般被用于改良甚至改造微生物的基因，從而獲得性狀更加優(yōu)良的表型.基因組重排技術(shù)與經(jīng)典的雜交育種技術(shù)不同之處在于，后者在每次重排時(shí)只有兩個(gè)親本，然而基因組重排技術(shù)卻是兩個(gè)以上的多親本雜交，并且通過反復(fù)的遞推式雜交，從而產(chǎn)生很多表型改良顯著的新突變株[1-3].

2 基因組重排具體方法

基因組重排技術(shù)通過模擬自然進(jìn)化過程，將突變菌庫中的帶有不同遺傳性狀的正變菌株基因進(jìn)行多親本融合，在全基因組范圍內(nèi)隨機(jī)交換基因，通過篩選，剔除基因組中的不利的變異基因，在遞推式融合中，將突變菌株庫中的有利基因逐漸積累，從而完成跳躍性人工進(jìn)化.基因組重排育種技術(shù)主要分五步：

2.1 突變菌株庫的建立

基因組重排育種技術(shù)首先會(huì)構(gòu)建一個(gè)包含不同遺傳特性的突變菌株庫，其中的親本擁有多種多樣的基因，在后續(xù)的遞推式原生質(zhì)體融合時(shí)，不同的優(yōu)良性狀可以進(jìn)行剪接，然后統(tǒng)一集中到融合體中.通常，突變菌株庫可借助自然分離、誘變育種等常見技術(shù)建立，從而獲得更多帶有多樣性基因的親本.

2.2 親本的篩選

當(dāng)利用誘變育種技術(shù)進(jìn)行微生物菌種選育時(shí)，“選”與“育”要結(jié)合起來，提高誘變效率.首先進(jìn)行“育”：通過各種誘變手段（如物理誘變、化學(xué)誘變等），使菌株產(chǎn)生基因型突變，但該突變是不定向的，只有極少部分是正突變;再進(jìn)行“選”：借助各種篩選方法篩選出具有某特定表型的突變株，如能夠耐受不良環(huán)境（如某種濃度的抗生素、前體或不同的pH等），從絕大部分的負(fù)突變中快速篩選出正突變，進(jìn)一步提高篩選效率.

2.3 親本原生質(zhì)體的制備

原生質(zhì)體融合技術(shù)是基因組重排技術(shù)的基礎(chǔ)，又很多因素會(huì)直接影響原生質(zhì)體制備及再生效果，如微生物的菌齡、制備原生質(zhì)體的酶種類及濃度、酶解溫度及時(shí)間、緩沖液及再生培養(yǎng)基的成分與設(shè)計(jì)等.李亮等[4]在利用基因組重排技術(shù)選育紅曲霉菌SH2-7生產(chǎn)治療心血管良藥的洛伐他汀時(shí)對(duì)原生質(zhì)體制備及再生條件進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，當(dāng)溶壁酶為1.0%，菌絲菌齡為66h，在酶解溫度為30℃下酶解3h，采用pH為6.0的高滲磷酸鹽緩沖液，0.6mo/L的NaCl作為再生培養(yǎng)基的滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)，原生質(zhì)體再生率高達(dá)1.45%.

2.4 原生質(zhì)體遞推式融合

基因組重排技術(shù)是基于原生質(zhì)體融合技術(shù)的多輪遞推式融合[5]，此種方式的融合不僅能提高不同遺傳特征細(xì)胞之間的基因頻率，還能進(jìn)一步提高基因組重排的高效性.第一輪融合后，篩選出若干株性狀比較優(yōu)良的菌株作為親本，按照相同的操作方法進(jìn)行第二輪融合.根據(jù)研究人員的原始意圖和融合子最終顯示的特性，可以實(shí)施若干輪融合.

原生質(zhì)體融合的方法主要包括化學(xué)法及電誘導(dǎo)融合等方法.化學(xué)法是利用聚乙二醇促進(jìn)融合，如Zhang等[6]建立了一種優(yōu)化的聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，用于黑曲霉ATCC 20611高效生產(chǎn)低聚果糖.電誘導(dǎo)融合法是基于電學(xué)和生物化學(xué)的理論.在電場(chǎng)作用下，原生質(zhì)體向電極方向泳動(dòng)，同時(shí)，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生偶極化，以促進(jìn)原生質(zhì)體的粘附，最終使原生質(zhì)體在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生融合.Ye等[7]為了讓蘋果酒更富有風(fēng)味和香氣，對(duì)釀酒酵母和克魯氏假絲酵母的滅活原生質(zhì)體進(jìn)行電誘導(dǎo)融合，最終獲得一株感官評(píng)分和香氣成分含量得分最高的雜交R4.

2.5 融合子的篩選

融合子的檢出和鑒定在基因組重排中占據(jù)非常重要的地位.通常可依據(jù)基因組重排的目的進(jìn)行重組子的篩選，可借助菌株對(duì)環(huán)境的不同耐受力，或設(shè)計(jì)一些選擇性培養(yǎng)基來實(shí)現(xiàn).Wang等[8]以分離到的Lactobacillus plantarum IMAU10014及Lactobacillus helveticus IMAU40097為材料，以Penicillium digitatum KM08模式菌為指示菌，通過基因組重排技術(shù)提高乳酸菌抗真菌活性.Gérando[9]等利用隨機(jī)誘變及基因組重排技術(shù)，提高了厭氧菌Clostridium beijerinckii DSM溶劑耐受性及異丙醇/丁醇/乙醇的產(chǎn)量，極大改善自然異丙醇產(chǎn)生菌的表型.

另外，還可通過滅活法來篩選重組體.如Yin等[10]為了提高釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae YS86產(chǎn)谷胱甘肽的產(chǎn)量，利用紫外照射和加熱處理獲得致死的原生質(zhì)體，并對(duì)其進(jìn)行兩輪基因組重排，最終獲得高產(chǎn)的重組子YSF2-19，其在搖瓶和發(fā)酵罐中谷胱甘肽產(chǎn)量分別增加了3.2及3.3倍.筆者[11]利用紫外線照射及加熱滅活處理Streptomyces virginiae原生質(zhì)體，在鏈霉素抗性壓力下，并對(duì)其進(jìn)行五輪基因組重排，最終獲得一株維吉尼亞霉素產(chǎn)量穩(wěn)定的重組子G5-103，產(chǎn)量約為251mg/L，比親本UV-1150及野生株提高3.1及11.6倍.

3 基因組重排技術(shù)存的問題與展望

目前，基因組重排技術(shù)面臨很多瓶頸，其中融合子的高通量篩選是最難攻克的環(huán)節(jié)，現(xiàn)尚無快速高效的篩選方法，需要研究者借助已有知識(shí)及技術(shù)深入挖掘.另外，由于跨種屬親本之間同源性較差，重組概率較低，因此基因組重排技術(shù)很少用于不同種親本的融合.

基因組重排技術(shù)自2002年問世以來便受到人們的廣泛關(guān)注，并應(yīng)用在各種微生物菌種改良中，取得了巨大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益.隨著自身技術(shù)的發(fā)展及生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等生物技術(shù)的成熟，基因組重排技術(shù)必然成為日后開發(fā)新產(chǎn)品、新物種的有力技術(shù)，為加速微生物菌種改良，進(jìn)一步促進(jìn)產(chǎn)業(yè)化做出貢獻(xiàn).

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