徐美蓉 漆永紅 李婷 李曉蓉 寇相龍

摘要：研究了不同的預(yù)處理方法及多糖提取方法對(duì)黨參多糖提取效果的影響。結(jié)果表明，提取黨參多糖最佳的預(yù)處理方法為低溫冷凍干燥粉碎，與烘干粉碎提取法相比，多糖含量和產(chǎn)率分別提高了14.00%、49.58%。黨參多糖提取最佳組合方式為低溫冷凍干燥粉碎預(yù)處理與堿提取相結(jié)合，與常規(guī)熱水提取相比，黨參粗產(chǎn)量、多糖含量、多糖產(chǎn)率分別提高44.74%、61.32%、133.43%。通過高效液相色譜法檢測(cè)低溫冷凍干燥粉碎預(yù)處理后得到的黨參多糖屬性，發(fā)現(xiàn)處理方法對(duì)黨參多糖的性質(zhì)影響不大，但低溫冷凍干燥粉碎預(yù)處理可以大大提高多糖的提取效率。

關(guān)鍵詞：預(yù)處理;低溫冷凍干燥粉碎;黨參多糖;提取效果;多糖性質(zhì)

中圖分類號(hào)：S567? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? 文章編號(hào)：1001-1463（2019）11-0059-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2019.11.015

Experimental study on tissue culture of Dendrobiumo fficinale in Tianshui area

LEI Ying， REN Yuxing， WU Lihong

（Gansu Forestry Professional Technology College， Tianshui Gansu 741020， China）

Abstract：The top bud of Dendrobium officinale potted in greenhouse were used as explants， the method of cross-grouping design was adopted. and cultured in MS + mashed bananas puddle. The different concentrations of plant growth regulators 2.4-D， NAA， IBA and 6-Ba were added in MS medium to induce the bushy buds of Dendrobium officinalis， and the effects on the proliferation and rooting of bushy buds were observed. The results showed that the best medium for inducing cluster buds of Dendrobium officinale were MS+6-BA 2.0 mg/L+2.4-D 1.0 mg/L and MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L. The optimum medium for multiplication of cluster buds was MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L. The optimum medium for multiplication of cluster buds was MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L. The transplanting matrix was perlite， forest leaf mould and pine needle mass ratio 1：1：1.

Key words：Tianshui area;Dendrobium officinale;Tissue culture ;Cross group design

黨參在我國具有悠久的應(yīng)用歷史，也是常用大宗藥材。全世界黨參屬植物有40余種，我國是世界黨參的主要產(chǎn)區(qū)和分布中心，主要產(chǎn)地為四川、貴州、陜西、山西等地，商品規(guī)格分為川黨參、東黨參、潞黨參、白黨參、西黨參等[1 ]。黨參除臨床上用于中藥飲片外，民間還常用于保健藥品，可用來燉肉、煲湯。黨參作為藥食同源的中藥材，所含的成分主要有多糖、皂苷、甾醇、三萜，生物堿、倍半萜及香豆素類等，其中多糖含量最大。研究表明，黨參多糖在調(diào)節(jié)免疫力、抗衰老、抗缺氧、抗應(yīng)激、抗氧化等很多方面具有較好的生物活性[2 - 9 ]，其保健功效也越來越為人們所關(guān)注[10 - 13 ]。

黨參主要糖類成分為菊糖和果糖，且細(xì)胞壁多糖含量較高。干燥的黨參主要表現(xiàn)柔軟木質(zhì)化，并且多年生黨參根周皮的木栓層為1層，木栓層細(xì)胞呈長方形，排列整齊，細(xì)胞壁栓質(zhì)化，因此采用熱水直接浸提多糖提取率不高。黨參中多糖含量為19.27%～40.92%[14 ]，且其木栓層由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)組成，不容易將黨參充分干燥粉碎成微細(xì)顆粒，使有效物質(zhì)能夠得到充分的提取溶出。目前，有關(guān)黨參多糖提取方法改進(jìn)的報(bào)道較多，通過改進(jìn)提取方法提高了黨參多糖產(chǎn)量，但對(duì)黨參的預(yù)處理方法研究較少。我們對(duì)比了不同預(yù)處理方法對(duì)黨參多糖的提取效果的影響，旨在尋找一種最佳的預(yù)處理方法，為黨參多糖的提取和利用提供新的思路。

1? ?材料和方法

1.1? ?供試材料

供試黨參（Codonopsis）為一年生，當(dāng)年10月收獲，產(chǎn)地為甘肅省岷縣。

供試試劑葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購自中國計(jì)量科學(xué)院，纖維素來自諾維新公司，食用菌水解酶A01和木瓜蛋白酶購自廣西南寧龐博生物工程有限公司。磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、五水硫酸銅（II）、檸檬酸鈉、無水硫酸鈉、氨、無水乙醇、濃硫酸和苯酚均為分析純。

儀器設(shè)備：WJX-305高速多功能粉碎機(jī)，上海緣沃工貿(mào)有限公司;低溫冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司;HR3653型破壁機(jī)，飛利浦公司生產(chǎn);KQ2200DA型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山超聲儀器有限公司;P70D20TP-C6（WO）格蘭仕微波爐，廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司有限公司;SQP千分之一電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）公司;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋，上海柏欣儀器設(shè)備廠;RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D（III）循環(huán)水多用途真空泵，河南裕華儀器有限公司有限公司;DHG-9245A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海柏欣儀器設(shè)備廠;LD5-10高速臺(tái)式離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠;Cary50紫外可見分光光度計(jì)，美國瓦里安公司;沃特世2695高效液相色譜儀，美國沃特世公司。

1.2? ?樣品處理

1.2.1? ? 冷凍干燥處理? ? 將黨參樣品清洗處理干凈，切片處理，切片厚度為1～2 mm，放入冰柜冷凍4 h以上。將冷凍好的黨參樣品放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥24 h以上。黨參樣品經(jīng)過冷凍干燥，取出一揉即碎即可，用破壁機(jī)打成粉末狀，干燥儲(chǔ)藏待用。

1.2.2? ? 樣品烘干粗粉碎處理? ? 將黨參清洗處理干凈，切片處理，切片厚度為1～2 mm，放進(jìn)恒溫60 ℃烘箱烘至恒重，粉碎機(jī)打成粉末狀，干燥儲(chǔ)藏待用。

1.3? ?烘干預(yù)處理和提取

1.3.1? ? 直接提取? ? 取烘干粗粉碎處理樣品4份，每份5 g，分別加水100 mL，沸水浴提取2.5 h，過濾后收集濾液。在相同條件下重復(fù)提取濾渣，最后合并濾液。通過真空濃縮蒸餾（溫度為60 ℃）得到黨參多糖粗提取物，測(cè)定多糖含量并計(jì)算粗產(chǎn)率、得率。

1.3.2? ? 浸泡預(yù)處理和提取? ? 取烘干粗粉碎處理樣品4份，每份5 g，分別加水100 mL，攪拌1 min后靜置，在室溫下浸泡16 h后沸水浴提取2.5 h，重復(fù)提取2次，其他處理同1.3.1。

1.3.3? ? 微波預(yù)處理和提取? ? 取烘干粗粉碎處理樣品4份，每份5 g，分別滴加15%乙? ? ?醇[6 ]。攪拌均勻后，在中火和低火下放入微波爐中加熱3 min。然后取出加水100 mL，沸水浴提取2.5 h。其他同1.3.1。

1.3.4? ? 低溫冷凍干燥粉碎預(yù)處理和提取? ? 將200 g樣品置于破壁機(jī)中進(jìn)行研磨粉碎。過40目篩后取粉碎后的黨參樣品4份，每份5 g，并加水100 mL。沸水浴提取2.5 h，其他處理同1.3.1。經(jīng)試驗(yàn)確定，該方法為最佳預(yù)處理方法。

1.4? ?低溫冷凍干燥粉碎處理不同提取方法提取黨參多糖

1.4.1? ?熱水提取? ? 同1.3.4。

1.4.2? ? 酒精提取? ? 取黨參粉末樣品4份，每份5 g，按1.3.4的方法處理。根據(jù)先前實(shí)驗(yàn)獲得的最佳條件，加入100 mL的2%乙醇，在70 ℃下萃取2.5 h。收集濾液，并在相同條件下再次處理濾渣，合并濾液。其他處理同1.3.1。

1.4.3? ? 堿提取? ? 取黨參粉末樣品4份，每份5 g，按1.3.4的方法進(jìn)行處理。根據(jù)先前實(shí)驗(yàn)獲得的最佳條件，加入100 mL的1%氨溶液，并通過微煮沸提取2.5 h。收集濾液，并在相同條件下再次提取濾渣。合并濾液。其他處理同1.3.1。

1.4.4? ? 超聲波結(jié)合酶提取? ? 取黨參粉末樣品4份，每份5 g，按1.3.4的方法進(jìn)行處理。根據(jù)先前實(shí)驗(yàn)獲得的最佳條件，加水100 mL、復(fù)合纖維素酶0.03 g，果膠酶0.01 g、木瓜蛋白酶0.03 g，超聲提取1 h，收集濾液，相同的條件下再次萃取濾渣，將濾液合并。其他處理同1.3.1。

1.4.5? ? 微波萃取? ? 取黨參粉末樣品4份，每份5 g，按1.3.4的方法進(jìn)行處理。根據(jù)先前實(shí)驗(yàn)獲得的最佳條件，加水100 mL，在微波爐中低火（150 W）下提取15 min，收集濾液，并在相同條件下再次提取濾渣，合并濾液。其他處理同1.3.1。

1.5? ?分析方法

1.5.1? ? 高效液相色譜法的檢測(cè)多糖? ? 液相色譜法用于檢測(cè)并分析樣品中的多糖。色譜條件：Ultra-hydrogel TM 250 GPC色譜柱，氫氣流量7.8 mL/min，流動(dòng)相為純凈水，柱溫為30 ℃，流速為0.6 mL/min，注射量為20 μL，檢測(cè)器是示差檢測(cè)器。

1.5.2? ? 樣品溶液制備? ? 取試驗(yàn)樣品（黨參多糖提取物）1 g，用去離子水定容至100 mL。搖勻并過濾，取濾液5 mL，加入無水乙醇20 mL。靜置5 min，然后5 000 r/min下離心15 min。除去上清液，用80%乙醇洗滌沉淀1次。將沉淀物用去離子水定容至5 mL，作為測(cè)試樣品溶液，過0.45 μm的水相針式過濾器，上機(jī)。

1.5.3? ?多糖粗產(chǎn)量的計(jì)算? ? 粗產(chǎn)量=（黨參提取物的重量/黨參稱樣量）×100%。

采用分光光度法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算多糖含量。

多糖產(chǎn)率=（粗產(chǎn)量×多糖含量）/100%。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?不同預(yù)處理方法對(duì)黨參多糖提取效果的影響

從表1可以看出，與直接提取相比，浸泡預(yù)處理和微波預(yù)處理提取的粗產(chǎn)物，多糖含量和產(chǎn)率變化不大。也就是說，浸泡預(yù)處理和微波預(yù)處理對(duì)黨參多糖的提取效果沒有明顯影響。低溫冷凍干燥粉碎預(yù)處理可以大大提高提取物中的黨參多糖含量和多糖產(chǎn)量，相比直接提取，多糖含量和產(chǎn)率分別提高了14.00%、49.58%。

2.2? ?低溫冷凍干燥粉碎處理不同提取方法對(duì)黨參多糖提取的影響

從表2可以看出，通過低溫冷凍干燥粉碎預(yù)處理與堿提取相結(jié)合提取的黨參多糖產(chǎn)率最高，為8.31%。與粗粉碎后直接熱水提取相比，粗產(chǎn)物提高了44.74%，多糖含量提高了61.32%，多糖產(chǎn)量提高了133.43%;與傳統(tǒng)的熱水提取方法相比，低溫冷凍干燥粉碎預(yù)處理結(jié)合乙醇提取、超聲波結(jié)合酶法提取、微波提取對(duì)黨參多糖提取率無明顯改善。超聲波結(jié)合酶提取和微波萃取甚至引起多糖含量下降，可能是因?yàn)樘幚項(xiàng)l件沒有達(dá)到最佳。

2.3? ?黨參多糖的液相色譜

從圖1可以看出，通過低溫冷凍干燥粉碎預(yù)處理與熱水提取相結(jié)合提取的多糖物質(zhì)的峰形特征（b）接近直接提?。╝）。峰出現(xiàn)時(shí)間和峰面積比例相似，總峰面積b > a。據(jù)推測(cè)，可能是低溫冷凍干燥粉碎預(yù)處理后熱水提取改善了黨參多糖的總含量。在有提取物的前提下，與直接提取相比，提取的多糖類型和比例沒有明顯變化，從而改善了黨參多糖的產(chǎn)量，使提取更充分和完整。低溫冷凍干燥粉碎預(yù)處理與堿提取相結(jié)合提取的多糖特征譜（c）與直接提取相比變化較大，峰形明顯變化，表明提取的黨參多糖改變了性質(zhì)。

3? ?結(jié)論和討論

通過浸泡、微波、低溫冷凍干燥粉碎等預(yù)處理方法，對(duì)黨參多糖提取結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，其中低溫冷凍干燥粉碎可以極大地提高黨參多糖的提取率，與烘干粉碎后直接提取相比，多糖含量和產(chǎn)率分別提高了14.00%、49.58%。采用低溫冷凍干燥粉碎預(yù)處理結(jié)合堿提法，較常規(guī)熱水提取可使黨參粗產(chǎn)量、多糖含量、多糖產(chǎn)率分別提高44.74%、61.32%、133.43%。比較分析特征光譜通過不同處理獲得的黨參提取物中的多糖，發(fā)現(xiàn)低溫冷凍干燥粉碎預(yù)處理主要提高了黨參多糖的總含量，在提取物中，使得多糖產(chǎn)量增加和提取足夠，提高了多糖的提取率，但它對(duì)提取的多糖類型及其比例影響不大。

低溫冷凍干燥粉碎預(yù)處理可以大大改善黨參多糖的提取效果，但很少影響提取的多糖的性質(zhì)?？梢酝茰y(cè)，低溫冷凍干燥粉碎預(yù)處理主要破壞黨參組織使其結(jié)構(gòu)松散易于粉碎成粉末狀，使細(xì)胞內(nèi)功能物質(zhì)的溶解更加完整，這將在隨后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行研究。

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（本文責(zé)編：陳? ? 偉）