孫 音 ，李兆鵬 ，2，房義福 *，姜楠南 ，王 媛

（1.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250014;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與林學(xué)院，山東 青島 266109）

大葉女貞 （Ligustrum compactum）別名高桿女貞，木犀科、女貞屬，灌木或小喬木，半常綠[1]。具有重要的園藝和藥用價值，有滯塵抗煙的功能，能吸收二氧化硫,常作行道樹和公園綠化樹種[2]。植物染色體是基因定位、構(gòu)建物理遺傳圖譜的重要前提，植物染色體研究最常用、最直觀的的方法是染色體制片，鏡檢進(jìn)行核型分析[3]。染色體核型分析技術(shù)可以將染色體逐一識別，對各項(xiàng)穩(wěn)定特征如染色體的數(shù)目、大小、相對長度、著絲點(diǎn)位置、不對稱系數(shù)等進(jìn)行分析，作為植物分類指標(biāo)被利用[4,5]。同時染色體研究對于基因定位、雜種分析、生物的遺傳機(jī)理研究和種族關(guān)系鑒定等方面具有重要參考價值[6]。已知木犀科植物染色體基數(shù)為x=11-24，但相關(guān)的核型分析較少，一方面是由于木本材料的制約，另一方面木犀科植物染色體小、形態(tài)不易觀察，制片技術(shù)有待于深入研究。目前僅限于幾個屬植物的研究，如木犀屬桂花染色體基數(shù)為X=23，核型公式為2n=46=30m+6sm+8st+2t，屬于“2B”類型[7]；白蠟屬絨毛白蠟染色體基數(shù)為X=22，核型公式為2n=22=20m+2sm，為“1A”類型[8]；茉莉花屬茉莉染色體基數(shù)為X=13,核型公式為2n=26=8m+16sm+2sm，為“3B”類型等[9]。已知女貞屬植物染色體基數(shù)為X=23，核型分析還未見報(bào)道，而大葉女貞作為女貞屬典型代表，對其進(jìn)行染色體核型分析，對女貞屬植物系統(tǒng)發(fā)育研究和親緣關(guān)系鑒定具有重重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料取自2017年濟(jì)南市唐王和長清苗圃采收的大葉女貞種子，選擇顆粒飽滿的種子消毒后剝胚放在墊有濕潤脫脂棉的培養(yǎng)皿中，于25℃組培室中萌發(fā)。

1.2 方法

1.2.1 染色體制片

分別選取大葉女貞根尖和莖尖[10]為材料，在7:00-12:00時間段內(nèi)分次取樣，每隔30min取材1次，確定最適宜的取材時間。材料分別經(jīng)0.02%秋水仙素、0.002mol/L 8-羥基喹啉、飽和對二氯苯、冰水[11,12,13]處理2～8h，2h為一個梯度，確定最適宜的預(yù)處理液和預(yù)處理時間。預(yù)處理后，蒸餾水漂洗2～3遍后于卡諾式固定液中室溫固定24小時。蒸餾水漂洗2-3遍，分別經(jīng)酶解法和酸解法解離，酸解時間分別為5～25min，5min為一個梯度。酶解法時，選擇有無0.075mol/L KCl低滲液兩組處理，酶解時間分別為90～150min，10min為一個梯度。以確定最適宜的解離方法和時間。解離后，蒸餾水沖洗2～3遍，將材料于載玻片上，濾紙吸干周圍的水分，滴加1～2滴醋酸洋紅或卡寶品紅染液，分別染色5min，15min，25min，以確定最佳染色時間。染色后，運(yùn)用常規(guī)壓片法和改良去壁火焰干燥法制片。

1.2.2 細(xì)胞學(xué)觀察及數(shù)據(jù)分析

選取5～10個植株的新生根尖進(jìn)行核型分析，使用OLYMPUS顯微鏡100倍油鏡進(jìn)行鏡檢并拍照。運(yùn)用Adobe Photoshop圖像處理軟件，對分裂中期的大葉女貞染色體進(jìn)行數(shù)據(jù)測量并計(jì)算染色體組總長度、染色體臂相對長度、臂比、臂指數(shù)、不對稱系數(shù)等參數(shù)[14]。染色體數(shù)目的確定和核型分析參照李懋學(xué)和陳瑞陽[15]關(guān)于植物核型分析標(biāo)準(zhǔn)化建議，參照Levan[16]等的染色體命名規(guī)則描述核型公式；按Arano[17]方法計(jì)算核不對稱系數(shù)；按Kuo[18]等等方法計(jì)算相對長度；按Stebbins[19]方法確定染色體類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體制片的優(yōu)化

2.1.1 取材部位對制片效果的影響

正常萌動根尖和莖尖為染色體制片常用的取材部位，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以莖尖為取材部位時，成像不夠清晰，染色體難以計(jì)數(shù)，而大葉女貞播種苗待胚根長出2～3cm時取樣，所獲得染色體圖像清晰，染色體形態(tài)良好，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性高，見圖1。

圖1 大葉女貞莖尖、根尖及染色體圖像Figure1 The stem apex and the chromosomes

2.1.2 取材時間點(diǎn)對分裂相細(xì)胞數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)證明上午9:30-10:00是觀察大葉女貞染色體較好的時期，視野中的細(xì)胞分裂旺盛，分裂相較多，中期細(xì)胞的平均百分比為30%，其它時間段鏡檢也能觀察到分裂中期相，但比例相對較小。

圖2 根尖染色體不同取材時間中期細(xì)胞百分比Figure2 The apical chromosomes at 9:00-10:00 and the percentage of the divisition cells in mitosis metaphase at different sampling times

2.1.3 不同預(yù)處理液對制片效果的影響

通過對預(yù)處理液實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在8-羥基喹啉、飽和對二氯苯處理2-8h，染色體濃縮程度過高，不利于觀察；選用冰水處理的材料，染色體濃縮程度低，不利于染色體分散和計(jì)數(shù)；而經(jīng)秋水仙素處理6h時便于形態(tài)觀察和分析，制片效果較好，見圖3。

2.1.4 不同解離液對制片效果的影響

酸解法和酶解法都能獲得較好的染色體中期分裂相，通過對比試驗(yàn)得出：酶解法時，用1mol/L HCL處理15min效果最佳，見圖4。酶解法時，采用有無KCL低滲液兩個處理，對比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低滲過程對女貞染色體制片影響較小，因此為提高實(shí)驗(yàn)效率，省去前后低滲過程，酶解最佳時間為120min～130min。處理時間過短，細(xì)胞分散程度低，細(xì)胞重疊在一起；而處理時間過長，染色體遭到破壞，斷裂成片段，影響數(shù)目統(tǒng)計(jì)和分析，表1。

圖3 預(yù)處理6h對染色體長度的影響Figure3 Effect of pretreatment 6h on chromosome length

圖4 酸解法解離時間對染色體的影響Figure4 The effect of acid dissociation time on chromosomes

表1 不同解離時間的效果比較Table1 Effect of different dissociation time

用醋酸洋紅和改良石炭酸品紅 （卡寶品紅）染液分別著色，二者染色效果相差不大，且均染色15min為宜，染色時間過短，染色體不能完全著色，成像模糊，難以計(jì)數(shù)；染色時間過長，視野偏暗，染色體顏色太深，不易觀察。

圖5 染色時間對染色體成像的影響Figure5 The effect of dyeing time on chromosomes

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)條件的篩選，于上午10:00選取根尖1mm乳白色部分，秋水仙素預(yù)處理6h，卡諾固定液常溫固定24h，1mol/L HCL解離10min，壓片法和火焰干燥法制片。結(jié)果表明，兩種制片方法都能獲得良好的染色體分裂相，壓片法制片時，便于鏡檢觀察及拍照，但實(shí)驗(yàn)中，染色體分散效果差，獲得可用于計(jì)數(shù)及核型分析的細(xì)胞概率較低。而用火焰干燥法時，表面張力使染色體自行鋪展，分裂相清晰，同時無染色過程，方便進(jìn)行染色體后續(xù)研究。

2.2 染色體核型分析

鏡檢找到大葉女貞中期分裂相，染色體核型分析數(shù)據(jù)如表2。大葉女貞染色體總條數(shù)為46，基數(shù)為23，與早前國外報(bào)道的染色體數(shù)目一致。核型公式為 2n=2x=46=38+4sm+4st，1號和2號染色體長臂具隨體。中部著絲點(diǎn)（m）染色體19對，近中部著絲點(diǎn)（sm）的染色體2對，近端部著絲點(diǎn)（st）的染色體2對。臂比大于2的染色體有3對，占比為12%，最長染色體與最短染色體長度比為6.35，核型類型屬于Stebbins核型分類中的“2C”型，臂指數(shù)為88，核型不對稱系數(shù)為60.17%。較不對稱，屬于進(jìn)化的核型類型。

表2 大葉女貞染色體核型參數(shù)Table2 Karyotype parametres of chromosomes of Ligustrum compactum

圖7 大葉女貞染色體核型模式圖Figure7 Karytope pattern of Ligustrum compactum

3 討論

一般來說，能進(jìn)行細(xì)胞分裂的植物組織、細(xì)胞等都可以為樣本進(jìn)行染色體制片[20]。高進(jìn)紅等[21]利用幼葉獲得了銀杏清晰的染色體標(biāo)本，陳勁楓等[22]利用卷須獲得了黃瓜、葡萄等植物清晰的染色體圖像，郝愛平和詹亞光等[23]利用植物愈傷組織進(jìn)行取材并優(yōu)化了白樺染色體制片。實(shí)驗(yàn)以大葉女貞根尖和莖尖為取材部位，發(fā)現(xiàn)莖尖為材料時，細(xì)胞易重疊，成像不夠清晰，可能是大葉女貞莖尖分生組織細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)力大，細(xì)胞難以分散。用根尖為實(shí)驗(yàn)材料，制片效果好，且易獲得大量實(shí)驗(yàn)材料，不受外界環(huán)境的限制。劉丹[24]認(rèn)為一天中植物分裂旺盛期一般出現(xiàn)在8:00-11:00，韓毅科[25]在對黃瓜的核型分析中得出8:40-9:10是取材的最佳時間，該實(shí)驗(yàn)得出上午9:00-10:00左右取樣，約30%的細(xì)胞處于分裂中期，分裂中期相占比高，與之前報(bào)道一致。預(yù)處理的目的在于阻止和破壞紡錘體微管形成，使細(xì)胞分裂停滯在中期階段，染色體濃縮變短，便于觀察[26]。對二氯苯處理染色體，分散效果好；秋水仙素處理能提高中期分裂相比例；8-羥基喹啉可使染色體及縊痕和次縊痕清晰，適合染色體較大的植物；冰水處理百合科植物的效果較好[27]。但不同植物中作用效果可能有差異，適宜處理時間也不同。大葉女貞經(jīng)秋水仙素6h處理的染色體形態(tài)良好，8-羥基喹啉、飽和對二氯苯處理，染色體濃縮程度高，冰水處理時，染色體之間相互交叉重疊，粘連不分散。說明對于像大葉女貞這種具小染色體且數(shù)目相對較多的植物，秋水仙素是較為溫和的預(yù)處理液。酸解法步驟簡便，易掌握，壓片后，多呈現(xiàn)單細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞壁包裹染色體。酶解法溶解細(xì)胞壁，原生質(zhì)體脫離，背景清晰[24]。在大葉女貞染色體制片中，酸解法和酶解法都能獲得良好的制片效果，且為簡化實(shí)驗(yàn)流程，去掉低滲步驟，但解離時間需要嚴(yán)格控制。楊寧等對百里香的核型分析中最佳酸解時間為15min[28]；陳晶鑫對梅花核型分析中最佳酶解時間為1h[29]。大葉女貞染色體較小，解離時間不宜太長。改良卡寶品紅適合大多數(shù)植物的染色，使染色體著色而細(xì)胞質(zhì)背景清晰，提高了對比度，而醋酸洋紅染液只作臨時鏡檢觀察。材料不同，染色時間也有差異[24]。實(shí)驗(yàn)中兩種染色液染色效果較理想，說明該植物材料較易染色。實(shí)驗(yàn)采用壓片法獲得清晰分裂相，為驗(yàn)證所試材料的可操作性，同時對火焰干燥法進(jìn)行改良，酶解省去低滲過程，制片效果好，為以后該方法的使用提高了效率。

實(shí)驗(yàn)得到的大葉女貞染色體數(shù)目與之前報(bào)道的女貞屬植物一致，核型公式為2n=2x=46=38m+4sm+4st，核型類型屬于Stebbins核型分類中的“2C”型，核型不對稱系數(shù)為60.17%。較不對稱，在木犀科報(bào)道的幾個屬的植物中，屬于較進(jìn)化的類型，說明女貞屬植物的起源相對較晚。

本文探討了大葉女貞染色體制片方法，簡化了實(shí)驗(yàn)流程，對女貞屬其它植物的染色體制片提供了技術(shù)支持。同時初步分析了大葉女貞的核型類型。但對于染色體顯帶、原位雜交、大葉女貞以及女貞屬在木犀科植物中的進(jìn)化關(guān)系等問題還有待于進(jìn)一步研究。