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非洲豬瘟診斷技術(shù)研究進(jìn)展

2019-09-09 13:10:18張光磊邵軍軍常惠蕓
中國(guó)動(dòng)物檢疫 2019年9期
關(guān)鍵詞:抗原靈敏度特異性

高 瞻,張光磊,邵軍軍,?;菔|

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,

OIE/國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730046)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的豬的一種急性、烈性、高致死性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病,我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病[1-2]。因ASFV 存活時(shí)間長(zhǎng)、抵抗力強(qiáng),以及基因組龐大、易變異[3],至今仍無(wú)商業(yè)化疫苗可用,但有多種診斷技術(shù)可用于ASF 監(jiān)測(cè)和確診。本文論述了ASF 的病原學(xué)、血清學(xué)診斷技術(shù)并分析了其優(yōu)缺點(diǎn),以便為不同需求的診斷提供相應(yīng)的技術(shù)支持。

1 病原學(xué)診斷技術(shù)

1.1 病毒分離與檢測(cè)

1.1.1 病毒分離 ASFV 分離必須在BSL-3 級(jí)及以上生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。臨床樣本可采集豬血液或器官組織,需要大量病毒時(shí),可使用已建立的ASFV敏感細(xì)胞系,例如猴源的Vero和COS-1細(xì)胞,豬源的永生化豬肺泡巨噬細(xì)胞(IPAM)和野豬肺細(xì)胞(WSL)[4]。

1.1.2 紅細(xì)胞吸附(haemadsorption,HAD)試驗(yàn) HAD 是病毒感染巨噬細(xì)胞并在其中復(fù)制,導(dǎo)致紅細(xì)胞吸附的一種自然現(xiàn)象,由Hess 等[5]在1969 年首次發(fā)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)室用采集的發(fā)病豬血液或組織懸液,接種豬原代巨噬細(xì)胞,每天觀察細(xì)胞培養(yǎng)物中巨噬細(xì)胞表面是否有紅細(xì)胞附著,若最終呈現(xiàn)玫瑰花環(huán)狀或桑葚狀,判為陽(yáng)性結(jié)果并根據(jù)結(jié)果對(duì)樣本的病毒量進(jìn)行定量[6]。盡管該方法靈敏性高、特異性強(qiáng),但檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢出率低。自1968 年西班牙首次發(fā)現(xiàn)ASFV 以來(lái),截至1974 年,已分離出200 多株不具備紅細(xì)胞吸附能力的ASFV 毒株[7],因此HAD 不再是主要的ASFV 檢測(cè)方法。

1.2 核酸檢測(cè)

1.2.1 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction,PCR) PCR 是常用的核酸檢測(cè)方法,其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、特異性強(qiáng),對(duì)標(biāo)本純度要求低,并已廣泛用于ASF 的現(xiàn)場(chǎng)診斷[8]。該技術(shù)通常采用基因組高度保守區(qū)域vp72為引物,能夠鑒定出ASF 參考實(shí)驗(yàn)室提供的不同ASFV 基因型分離株的基因組。曾少靈等[9]基于ASFV 結(jié)構(gòu)蛋白基因vp73 序列設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物,比OIE 推薦的引物(ASFV-278F、ASFV-278R)和(ASFV-257F、ASFV-257R)的靈敏度分別高出100 倍和1 000 倍,并且特異性相當(dāng)。Basto 等[10]建立巢式PCR 用以檢測(cè)蜱體內(nèi)ASFV,敏感性高于OIE 推薦的PCR 檢測(cè)方法。多重PCR 反應(yīng)原理與一般PCR 相同,而區(qū)別在于在同一反應(yīng)體系中加入了兩對(duì)以上引物進(jìn)行擴(kuò)增,因此具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。Xiao 等[11]設(shè)計(jì)了7 對(duì)特異性引物和探針,并進(jìn)行了多重PCR、PCR 產(chǎn)物與偶聯(lián)探針雜交,然后通過(guò)Bio-Plex 懸浮陣列系統(tǒng)檢測(cè)新建立的方法,結(jié)果表明該方法具有高度的特異性和重復(fù)性,7 種病毒的同時(shí)檢測(cè)限達(dá)到103拷貝/μL。Bio-Plex 懸浮陣列是一種快速、特異、高通量的工具,可單獨(dú)或同時(shí)混合檢測(cè)7 種豬病毒,對(duì)于今后開(kāi)發(fā)用于診斷動(dòng)物疾病的液體芯片技術(shù)具有重要意義。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR) qPCR 利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)檢測(cè),不僅解決了傳統(tǒng)PCR 技術(shù)需要瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果的問(wèn)題,而且速度快、靈敏度更高,最低檢 測(cè) 限 為10 拷 貝/μL。Tignon 等[12]基 于ASFV p72 基因建立的方法,其敏感性高于OIE 推薦的常規(guī)PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。曾少靈等[13]基于ASFV vp73 基因保守序列建立的方法,其靈敏度與OIE 推薦的熒光PCR 方法相當(dāng),比普通PCR 方法高出至少10 倍,特異性與OIE 推薦的這兩種相當(dāng)。

1.2.3 微滴數(shù)字PCR(ddPCR) ddPCR 是第三代PCR 技術(shù),是一種對(duì)核酸分子進(jìn)行絕對(duì)定量的技術(shù)。鄔旭龍等[14]基于ASFV K205R 基因建立ddPCR 檢測(cè)技術(shù),最低檢測(cè)限為0.36 拷貝,在20 μL 反應(yīng)體系中約為10 拷貝/反應(yīng),檢測(cè)靈敏度是qPCR 的10 倍,并且不與其他豬病陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng),特異性強(qiáng),具有很好的應(yīng)用前景。

1.2.4 原位雜交(in situ hybridization,ISH)ISH 是利用標(biāo)記探針與目的核酸結(jié)合后再檢測(cè)的一種技術(shù)方法,不僅能檢測(cè)出待檢核酸,還能在細(xì)胞中精確定位。Oura 等[15]建立了針對(duì)ASFV 衣殼蛋白vp73 的原位雜交技術(shù),檢測(cè)效果良好。

1.2.5 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP) LAMP 是 日 本Notomi[16]發(fā)明的一種敏感性很高的DNA 擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)已成功應(yīng)用于SARS、禽流感、艾滋病等疾病的檢測(cè)。Heather 等[17]以ASFV 拓?fù)洚悩?gòu)酶II 基因?yàn)榘悬c(diǎn)建立了LAMP 方法,其靈敏度不低于330 個(gè)基因組拷貝數(shù),能夠檢測(cè)到具有代表性的ASFV 分離株(n = 38),且不與經(jīng)典的豬瘟病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。楊吉飛等[18]基于ASFV 結(jié)構(gòu)蛋白vp72 基因建立了LAMP 檢測(cè)技術(shù),并成功應(yīng)用于ASF 參考實(shí)驗(yàn)室提供的17 個(gè)ASFV 毒株的基因組,與豬病的其他病原及傳染媒介之間均沒(méi)有交叉反應(yīng),只是LAMP 中引物的相互作用可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性信號(hào)[19]。該技術(shù)對(duì)設(shè)備要求低,適合基層診斷使用。

1.2.6 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA) RPA 是一種等溫DNA 擴(kuò)增技術(shù),已成為用于分子診斷的有吸引力的PCR 替代方法。RPA 反應(yīng)在恒定溫度下即可進(jìn)行,不需要昂貴的熱循環(huán)儀,對(duì)粗制樣品具有高度抗性,并且反應(yīng)可在約20 min 內(nèi)完成。與實(shí)時(shí)PCR 相比,簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì),快速[20]。Wang 等[21]設(shè)計(jì)靶向p72 基因保守區(qū)域引物和外切探針,以含有p72 基因的重組質(zhì)粒為模板建立RPA 方法。此方法最低限度可檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)102個(gè)拷貝,靈敏度與RT-PCR 相當(dāng),與常見(jiàn)豬病毒無(wú)交叉反應(yīng),特異性良好。Miao 等[22]以ASFV p72 基因建立RPA 與側(cè)向流試紙方法(RPA-LFD),對(duì)ASFV 的敏感性為38 ℃ 10 min 內(nèi)每次反應(yīng)達(dá)150 個(gè)拷貝,與其他豬病毒無(wú)交叉反應(yīng),但易出現(xiàn)核酸污染,因此操作需要小心,而其簡(jiǎn)單、便捷、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),為ASFV 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了新的替代方案。

1.3 小結(jié)

病原學(xué)檢測(cè)是針對(duì)病原體自身的檢測(cè),能夠在ASF 暴發(fā)早期,檢測(cè)出動(dòng)物體內(nèi)是否帶毒,相較于抗體檢測(cè)更快一些。病毒分離操作復(fù)雜,適用于病毒分子研究;核酸PCR 類(lèi)檢測(cè)比較普遍,靈敏性很高,操作便捷,但核酸污染易出現(xiàn)假陽(yáng)性,可用作鑒別診斷;LAMP、RPA 等等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)單,不依賴復(fù)雜儀器,現(xiàn)有專為戶外使用而設(shè)計(jì)的RPA 類(lèi)便攜式設(shè)備Genie Ⅲ,輕便易于攜帶,更適用于現(xiàn)場(chǎng)診斷。病原學(xué)診斷方法各有特點(diǎn)(表1),檢測(cè)人員可根據(jù)其優(yōu)缺點(diǎn)選擇合適方案進(jìn)行診斷。

表1 ASFV 病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)及其優(yōu)缺點(diǎn)

2 血清學(xué)診斷技術(shù)

2.1 抗原檢測(cè)

2.1.1 熒光抗體技術(shù)(fluorescent antibody test,F(xiàn)AT) FAT 是常用的抗原檢測(cè)方法之一,具有快速、敏感、特異性高等優(yōu)點(diǎn),對(duì)急性病例的檢出率較高。FAT 能夠檢測(cè)組織涂片或HAD 陰性白細(xì)胞培養(yǎng)物中的ASFV 抗原[23-24]。采用丙酮固定樣本10 min 后,滴加異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)抗ASFV 抗體,再用熒光顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞的胞漿中是否有熒光,即可據(jù)此判斷是否為陽(yáng)性[25-26]?,F(xiàn)已證明,此種技術(shù)可用于鑒定12 種非血細(xì)胞吸附ASFV 毒株[7]。但此技術(shù)所需的冷凍組織切片要求在BSL-3 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,所以不能用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。此外,該技術(shù)對(duì)亞急性和慢性ASF 病例敏感性較差,因在慢性感染過(guò)程中形成的抗原抗體復(fù)合物可競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷ASFV 抗原和抗體的結(jié)合,從而出現(xiàn)假陰性[24],因此一般只用作輔助檢測(cè)方法。此外,熒光抗體技術(shù)通常也用于ASFV 的體外細(xì)胞培養(yǎng),通過(guò)病毒定位檢測(cè)復(fù)制類(lèi)型等。

2.1.2 雙抗夾心ELISA 或捕獲ELISA 這種方法是在特異性單抗包被的酶標(biāo)板中加入抗原,使抗原與單抗特異性結(jié)合,再加入抗原另一表位的酶標(biāo)單抗,結(jié)合后加底物顯色,根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。Vidal 等[27]建立了抗ASFV vp73 蛋白特異單克隆抗體的雙夾心ELISA 方法。該測(cè)定法能檢測(cè)到的最低全病毒顆粒為2.3×102PFU/mL,最低能檢測(cè)到的vp73 抗原濃度為0.05 μg/mL。西班牙INGENASA 夾心ELISA 試劑盒,通過(guò)包被p72(p73)蛋白特異單克隆抗體來(lái)檢測(cè)病毒抗原,其特異性、敏感性均很好,并被OIE 指定為參考的ASF 診斷試劑盒。

2.1.3 側(cè)向流動(dòng)免疫色譜分析(lateral flow assay,LFA) LFA 是利用生物學(xué)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)相互特異性附著的性質(zhì),快速對(duì)分析物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析的方法。Sastre 等[28]基于vp72 蛋白的單抗建立LFA 方法,結(jié)果表明病毒的最低檢測(cè)限度為104PFU/mL,雖敏感性不如RT-PCR,但其快速便攜、經(jīng)濟(jì)易用,為現(xiàn)場(chǎng)診斷提供了一種選擇。此外,Sastre 等[29]還基于vp72 蛋白建立雙重側(cè)向流動(dòng)測(cè)定法,用于同時(shí)檢測(cè)針對(duì)ASFV 和CSFV 的抗體,結(jié)果顯示也具有良好的靈敏度和特異性水平。

2.2 抗體檢測(cè)

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) ELISA 是OIE 指定的非洲豬瘟首選血清學(xué)診斷方法,其方便快速、敏感特異,并可使用自動(dòng)化設(shè)備檢測(cè)大量樣本,為目前最廣泛的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)。國(guó)內(nèi)外常用作檢測(cè)ASFV 抗原的蛋白有p73、p72、p54、p32/p30等,ELISA 方法通過(guò)這些蛋白能夠直接檢測(cè)出較低或中等毒力的感染豬抗體。常規(guī)ELISA 使用來(lái)源于感染猴腎細(xì)胞(Vero 或 MS 細(xì)胞系)的病毒蛋白p72 抗原[30]。Wardley 等[31]在1979 年首次使用ELISA 鑒別ASFV 抗原和抗體,重復(fù)性好,能夠檢測(cè)到50~500 HAD50/mL 的有限抗原濃度。靳雯雯等[32]以ASFV vp73 蛋白作為包被抗原,建立間接ELISA 方法檢測(cè)豬血清中抗ASF vp73 蛋白的抗體,對(duì)ASFV 陽(yáng)性血清靈敏度高達(dá)1:2 560,具有良好的特異性和敏感性、較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。曹琛福等[33]基于vp54 蛋白作為包被抗原建立競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法,結(jié)果特異性達(dá)到100%,靈敏度達(dá)到96.22%,與西班牙INGENASA 試劑盒符合率為98.13%。但此方法不能診斷低毒力和高毒力菌株,因此對(duì)此類(lèi)毒株檢測(cè)要配合其他診斷方法。

2.2.2 膠體金快速免疫層析法(goldimmunochromatography assay,GICA) GICA 是 近年來(lái)發(fā)展迅速的一項(xiàng)診斷技術(shù)。Beggs 等[34]首次用GICA測(cè)定人絨毛膜促性腺激素,該方法具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn),尤其適合臨床的快速診斷。張?chǎng)斡畹萚35]建立的p54 抗體檢測(cè)膠體金免疫層析試紙,具有高度特異性,與豬其他病毒抗體陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng),在ASF 防控中具有良好的應(yīng)用前景。

2.2.3 間接熒光抗體試驗(yàn)(indirect fluorescent anti-body test,IFA) IFA 是用熒光標(biāo)記的二抗與抗原抗體復(fù)合物特異結(jié)合,最后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果的一種方法[36]。

2.2.4 免疫印跡檢測(cè)(immunoblotting test,IBT) IBT 是一種將蛋白質(zhì)電泳技術(shù)和血清學(xué)結(jié)合的免疫生化技術(shù),其特異性高,可檢測(cè)出弱陽(yáng)性樣本[37]。IBT 可做為IFA 診斷技術(shù)的替代方法。

2.3 小結(jié)

血清學(xué)診斷是通過(guò)檢測(cè)血清中的抗原或抗體來(lái)確定體內(nèi)是否存有ASFV。此類(lèi)診斷方法繁多,也很成熟,主要優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表2。FAT 一般作為輔助性檢測(cè)方法,當(dāng)用于亞急性或慢性疾病檢測(cè)時(shí),其靈敏性不如ELISA 或熒光定量PCR;ELISA 診斷技術(shù)雖然已經(jīng)很成熟,但操作繁瑣,要求較高;GICA、LFA 檢測(cè)迅速,但只能用于初步診斷,不能定量,適用于基層診斷;IBT 成本較高,操作復(fù)雜,適用于實(shí)驗(yàn)室定性定量等專業(yè)測(cè)定。實(shí)際診斷運(yùn)用中,常常聯(lián)合應(yīng)用多種診斷方法,各取所長(zhǎng)。

表2 ASFV 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)及其優(yōu)缺點(diǎn)

3 展望

ASF 是外來(lái)動(dòng)物疫病,但已在全球流行近百年,一旦暴發(fā)便會(huì)對(duì)疫區(qū)造成災(zāi)難性打擊。目前尚未研制出有效商業(yè)化疫苗,用于ASF 早期預(yù)防,這就需要效率更高的診斷技術(shù)用于ASF 排查。綜上不難發(fā)現(xiàn),病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷技術(shù)應(yīng)用廣泛,其中qPCR、RPA、GICA、LAMP 等技術(shù)靈敏快速,近年來(lái)發(fā)展迅速,在ASF 暴發(fā)前能起到高效排查作用,具有很好的發(fā)展前景。各種診斷方法雖很成熟,但各有優(yōu)缺點(diǎn),今后的發(fā)展趨勢(shì)在于不同診斷技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用,如RPA-LFD、多重PCR聯(lián)合自動(dòng)電子芯片[38]等。

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