姚 杰，劉 斐，高 艷，龐茜茜，郭 穎，滕金亮

0 引言

糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(Diabetic neuropathic pain，DNP)是一類(lèi)較難治療的疼痛類(lèi)型，大約有50%的糖尿病患者有不同程度的疼痛發(fā)生[1]。作為治療DNP的一線(xiàn)藥物，加巴噴丁的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制尚未明確。有研究表明，其可能的作用機(jī)制是抑制大鼠脊髓星狀膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，從而減輕神經(jīng)病理性疼痛[2]。但臨床上單獨(dú)應(yīng)用加巴噴丁的鎮(zhèn)痛效果不夠理想，需要聯(lián)合應(yīng)用其他治療慢性疼痛的藥物來(lái)達(dá)到較好的鎮(zhèn)痛效果以及減少大劑量使用加巴噴丁帶來(lái)的不良反應(yīng)。曲馬多是一種選擇性中樞μ受體激動(dòng)劑[3]。本研究通過(guò)建立1型糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型，分組給藥后觀察曲馬多復(fù)合加巴噴丁對(duì)DNP的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，以及對(duì)DNP大鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥因子表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討曲馬多聯(lián)合加巴噴丁治療DNP的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠，6～7周齡，體重200～220 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(滬)2017-0019，由中國(guó)人民解放軍海軍醫(yī)學(xué)研究所提供。

主要試劑：鏈脲佐菌素(STZ)，CAS號(hào)：18883-66-4，貨號(hào)：S6838，規(guī)格：100 mg/瓶，購(gòu)自北京諾博萊德科技有限公司。使用時(shí)采用檸檬酸鈉緩沖液(pH值4.2～4.5)配制成6 mg/ml STZ溶液，置于冰上避光保存，并于30 min內(nèi)使用；鹽酸曲馬多注射液(批號(hào)：105902，湖北潛江制藥股份有限公司)；加巴噴丁(批號(hào)：170206BD，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；水合氯醛，購(gòu)自成都嘉葉生物科技有限公司；小鼠抗大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞IBal抗體(北京中杉金橋公司)，兔抗大鼠星狀膠質(zhì)細(xì)胞GFAP抗體(北京中杉金橋公司)，山羊抗小鼠FITC熒光二抗(北京中杉金橋公司)；TNF-α和IL-1的ELISA試劑盒(批號(hào)：CSB-E13482、CSB-E14754，武漢博士德生物有限公司)。

主要儀器：電子Von Frey測(cè)痛儀 (North coast公司)，BME-410A熱照射疼痛刺激儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)，血糖測(cè)量?jī)x及試紙(三諾公司)。

1.2 動(dòng)物模型制備 選擇健康雄性SD大鼠48只，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境安靜，通風(fēng)良好，室溫約23 ℃，相對(duì)濕度50%，明暗周期交替，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可自由攝取食物及飲水，3 d后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1型糖尿病模型的建立是通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌(60 mg/kg)，注藥后第3天取大鼠尾部血液測(cè)定血糖，大鼠血糖高于15.5 mmol/L，視為1型糖尿病建模成功[4]。繼續(xù)飼養(yǎng)3周后，測(cè)定大鼠后足機(jī)械縮足閾值(PWT)，PWT<80%基礎(chǔ)值即為糖尿病神經(jīng)病理性疼痛模型建立成功，此次有40只大鼠造模成功，糖尿病大鼠發(fā)生神經(jīng)病理性疼痛的比例是87%。

1.3 動(dòng)物分組及給藥 采取隨機(jī)數(shù)字表的方法分成4組(每組10只)：A組(生理鹽水組)、B組(曲馬多20 mg/kg組)、C組(加巴噴丁60 mg/kg組)及D組(曲馬多10 mg/kg+加巴噴丁30 mg/kg組)。

1.4 行為學(xué)測(cè)定 測(cè)定給藥前1 d (T0)及給藥后3 d (T1)、7 d (T2)、11 d (T3)時(shí)PWT和熱縮足潛伏期(PWL)。參照文獻(xiàn)[4]采用的方法測(cè)定PWT。將準(zhǔn)備測(cè)試大鼠放置于帶金屬網(wǎng)格的有機(jī)玻璃籠，環(huán)境保持安靜，待其適應(yīng)環(huán)境30 min后，使用Von Frey測(cè)痛儀的刺激針刺激大鼠左側(cè)足底，記錄被測(cè)大鼠縮足前最大垂直壓力，即為大鼠的PWT。重復(fù)刺激3次，間隔大于10 s，取其平均值作為PWT。參照文獻(xiàn)[5]采用的方法測(cè)定PWL。將準(zhǔn)備測(cè)試大鼠放置于帶金屬網(wǎng)格的有機(jī)玻璃籠，環(huán)境保持安靜，待其適應(yīng)環(huán)境30 min后，使用BME-410A熱照射疼痛刺激儀照射大鼠左側(cè)足底，記錄被測(cè)大鼠從開(kāi)始照射至出現(xiàn)縮足反應(yīng)的時(shí)間，即為大鼠的PWL。重復(fù)刺激3次，間隔5 min，取其平均值作為PWL。

1.5 膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光雙染 大鼠行為學(xué)PWT和PWL測(cè)試結(jié)束后，在各組隨機(jī)抽取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，開(kāi)胸，經(jīng)心臟生理鹽水快速灌注，4%多聚甲醛灌注固定，分離并取脊髓腰膨大段組織，標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定3 h后，30%蔗糖梯度脫水，石蠟包埋，冰凍，制成10 μm石蠟切片，漂洗后封閉。二甲苯脫蠟，組織抗原修復(fù)，雙氧水封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；滴加5%的BSA常溫封閉1 h，分別滴加一抗(Iba-1，濃度1∶200)和一抗(GFAP，濃度1∶200)，4 ℃過(guò)夜。次日PBS沖洗，加二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，陰性對(duì)照用PBS代替，樹(shù)膠封片后顯微鏡下拍片觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，含有棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。采用LEICAQ500MC圖像分析系統(tǒng)，在脊髓背角深層和淺層分別選取脊髓內(nèi)側(cè)固定區(qū)域250 μm×250 μm范圍，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，反映星狀膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化水平。

1.6 ELISA法檢測(cè)TNF-α和IL-1含量 取清洗后的大鼠脊髓腰膨大段組織，加入5 ml預(yù)冷PBS沖洗研磨，離心5 min后取上清液，采用相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)脊髓提取液中的TNF-α、IL-1含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 不同治療組各時(shí)間點(diǎn)PWT的比較 各組大鼠T0時(shí)PWT比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與T0時(shí)比較，A組T1～T3時(shí)PWT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B組T1～T3時(shí)PWT略有上升，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。C組T2時(shí)PWT升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D組T2、T3時(shí)PWT升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與A組比較，C組和D組PWT升高(P<0.05)；與B組比較，C組和D組PWT升高(P<0.05)；與C組比較，D組T3時(shí)PWT升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 不同治療組各時(shí)間點(diǎn)PWL的比較 各組大鼠T0時(shí)PWL比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與T0時(shí)比較，A組T1～T3時(shí)PWL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。B組T2時(shí)PWL延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組T1、T2時(shí)PWL均延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。D組T1～T3時(shí)PWL延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與A組比較，B組T2時(shí)PWL延長(zhǎng)；C組T1、T2時(shí)PWL延長(zhǎng)；D組T1～T3時(shí)PWL延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與B組比較，D組T3時(shí)PWL延長(zhǎng)(P<0.05)；與C組比較，D組T3時(shí)PWL延長(zhǎng)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠PWT比較(mN)

注：△與T0時(shí)比較，P<0.05；*與A組比較，P<0.05；#與B組比較，P<0.05；&與C組比較，P<0.05

表2 不同治療組糖尿病神經(jīng)病理性疼痛大鼠PWL比較(s)

注：△與T0時(shí)比較，P<0.05；*與A組比較，P<0.05；#與B組比較，P<0.05；&與C組比較，P<0.05

2.3 不同治療組脊髓內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞活化水平的比較 與A組比較，B組、C組、D組大鼠脊髓內(nèi)星狀膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與B組比較，C組大鼠脊髓內(nèi)星狀膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化水平略降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組大鼠脊髓內(nèi)星狀膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與C組比較，D組大鼠脊髓內(nèi)星狀膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同治療組脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化水平比較(個(gè))

注：*與A組比較，P<0.05；#與B組比較，P<0.05；&與C組比較，P<0.05

2.4 不同治療組大鼠脊髓TNF-α、IL-1含量的變化 與A組比較，B組、C組、D組大鼠脊髓TNF-α、IL-1的表達(dá)降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與B組、C組比較，D組大鼠脊髓TNF-α、IL-1的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同治療組大鼠脊髓TNF-α、IL-1含量變化(ng/ml)

注：*與A組比較，P<0.05；#與B組比較，P<0.05；&與C組比較，P<0.05

3 討論

糖尿病已經(jīng)成為我國(guó)重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，DNP作為糖尿病的常見(jiàn)慢性并發(fā)癥，其臨床表現(xiàn)主要為自發(fā)疼痛和痛覺(jué)敏化[6]。目前，臨床上DNP的患者數(shù)量增加，長(zhǎng)期的疼痛不適對(duì)患者的身心造成嚴(yán)重的損害。DNP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)有效的治療方案。以往對(duì)于DNP治療的研究大多集中在單獨(dú)應(yīng)用加巴噴丁[7]，作為推薦使用的治療DNP的一線(xiàn)藥物[8]，其作用機(jī)制可能是通過(guò)中樞性鎮(zhèn)痛與抑制影響損傷后外周神經(jīng)異位放電的作用[9-11]；通過(guò)激活類(lèi)膽堿通路參與鎮(zhèn)痛作用[12-14]。但效果不夠理想，患者常處于鎮(zhèn)痛不全的狀態(tài)，并且同時(shí)伴有不同程度的眩暈、行走不穩(wěn)、嗜睡、疲勞感等不良反應(yīng)[15]。曲馬多是中樞性鎮(zhèn)痛藥，可以選擇性地激動(dòng)μ受體，有鎮(zhèn)痛效果確切、成癮性低、抗膽堿以及鎮(zhèn)靜不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)[16]。但曲馬多是中效鎮(zhèn)痛藥物，對(duì)癥狀較重的患者鎮(zhèn)痛不完善，增大劑量雖可提高療效，但隨之增加的抗膽堿、鎮(zhèn)靜等不良反應(yīng)使患者無(wú)法長(zhǎng)期耐受。為了解決在DNP治療上藥物療效和不良反應(yīng)之間的矛盾，本研究通過(guò)將這兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用治療1型糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛，觀察不同濃度藥物組合對(duì)DNP大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，以及對(duì)DNP大鼠脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥因子表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討曲馬多聯(lián)合加巴噴丁治療DNP的作用機(jī)制。

本研究選擇6～7周齡、體重200～220 g的雄性SD大鼠作為研究對(duì)象。一是因?yàn)榈妄g和低體重的大鼠對(duì)于傷害性刺激較敏感，二是因?yàn)樾坌源笫笙鄬?duì)于雌性大鼠在疼痛行為學(xué)監(jiān)測(cè)方面不受雌激素周期影響。

本研究中，DNP模型痛閾檢測(cè)結(jié)果顯示，腹腔注射20 mg/kg曲馬多對(duì)DNP大鼠機(jī)械縮足閾值無(wú)明顯影響，給藥后7 d熱縮足潛伏期延長(zhǎng)，而腹腔注射60 mg/kg加巴噴丁后可產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，與汪一等[17]報(bào)道結(jié)果相似。20 mg/kg曲馬多在單獨(dú)應(yīng)用時(shí)對(duì)糖尿病大鼠機(jī)械縮足閾值無(wú)明顯影響，而在聯(lián)合加巴噴丁后則可產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。與60 mg/kg加巴噴丁組比較，聯(lián)合曲馬多后在第7天、第11天時(shí)機(jī)械縮足閾值升高，熱縮足潛伏期延長(zhǎng)，提示小劑量曲馬多和加巴噴丁聯(lián)合應(yīng)用后，能夠有效減輕糖尿病神經(jīng)病理性大鼠的痛覺(jué)過(guò)敏，使加巴噴丁的有效鎮(zhèn)痛時(shí)間延長(zhǎng)，聯(lián)合用藥后10 mg/kg曲馬多同樣出現(xiàn)鎮(zhèn)痛效果。

近年來(lái)，大量研究表明，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞在DNP的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[18-19]，而小膠質(zhì)細(xì)胞是炎癥因子TNF-α、IL-1的主要來(lái)源[20]。本研究結(jié)果表明，與生理鹽水組比較，各組大鼠脊髓內(nèi)星狀膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化水平降低，脊髓TNF-α、IL-1的表達(dá)降低。與60 mg/kg加巴噴丁組比較，聯(lián)合用藥組大鼠脊髓內(nèi)星狀膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化水平以及脊髓TNF-α、IL-1的表達(dá)降低更明顯。提示曲馬多復(fù)合加巴噴丁可以抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞激活，減少炎癥因子釋放，從而緩解糖尿病神經(jīng)病理學(xué)疼痛的發(fā)生，但是具體通過(guò)何種通路影響脊髓膠質(zhì)細(xì)胞及炎癥因子的表達(dá)，還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，曲馬多復(fù)合加巴噴丁的鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用曲馬多或加巴噴丁，其機(jī)制可能與抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化，并減少TNF-α、IL-1的表達(dá)有關(guān)。