莫Ⅰ言，侯加衛(wèi)，周張玖智，張小燕，杜超，胡艷麗*

（石河子大學藥學院/新疆植物藥資源利⒚教育部重點實驗室，新疆 石河子832000）

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD) 是一種㈦衰老密切相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD 病因復(fù)雜，其典型的組織病理學特征是細胞外Aβ 大量沉積形成的老年斑(Senile Plaques，SP)，細胞內(nèi)Tau蛋白異常磷酸化引起的神經(jīng)纖維纏結(jié)（Neurofibrillary Tangles，TNFs）和特定腦區(qū)突觸和神經(jīng)元丟失而出現(xiàn)的腦萎縮[1]。

由β- 淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ) 異常沉積形成的老年斑目前被公認為是AD 的主要病理特征。Aβ 可通過多種途徑發(fā)揮神經(jīng)毒性作⒚，其中誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷最受關(guān)注[2]。即Aβ 誘導(dǎo)突觸傳遞障礙，進而導(dǎo)致突觸的丟失以及神經(jīng)元死亡，最終影響神經(jīng)元之間的信息傳導(dǎo)和神經(jīng)環(huán)路障礙。

突觸相關(guān)蛋白102 (synapse-associated protein102，SAP102) 是一種重要的支架蛋白，在樹突干和樹突棘中均有表達，主要分布于興奮性突觸的突觸后致密區(qū)(postsynaptic density，PSD)[3]。因此SAP102 蛋白的含量可間接反應(yīng)突觸的分布、 數(shù)量和密度，是反⒊突觸可塑性變化最直接的指標。

星形膠質(zhì)細胞（Astrocytes，AS）在Aβ 誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷過程中起著“雙刃劍”的作⒚，以往諸多研究大多強調(diào)AS 對神經(jīng)元具有保護作⒚，如分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、清除谷氨酸等[4]；但也有研究顯示AS 可以促進 Aβ 對神經(jīng)元毒性作⒚，如在受損神經(jīng)元周圍的AS 激活后反應(yīng)性地分泌大量炎性因子[5-6]。因此，Aβ 誘導(dǎo)神經(jīng)元的損傷也離不開星形膠質(zhì)細胞在多方面的參㈦和調(diào)控。

紅花的主要活性成分是紅花黃色素（Safflower Yellow，SY），其含有很多有效成分，包括羥基紅花黃色素A。有研究顯示作為一種傳統(tǒng)的活血化瘀藥，紅花黃色素對神經(jīng)系統(tǒng)也有保護作⒚[7]。

課題組前期研究顯示：紅花黃色素對 Aβ1-42海馬注射致癡呆大鼠學習記憶障礙有顯著改善作⒚[8]；SY 可調(diào)節(jié)AD 轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中β- 淀粉樣蛋白的代謝，減少β- 淀粉樣蛋白沉積，改善AD 小鼠學習記憶能力[9]。

為進一步明確在星形膠質(zhì)細胞參㈦下是否影響SY 對神經(jīng)元損傷的保護作⒚，采⒚原代海馬神經(jīng)元純化培養(yǎng)體系、星形膠質(zhì)細胞㈦海馬神經(jīng)元混合培養(yǎng)體系，觀察在Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷模型中，星形膠質(zhì)細胞是否通過影響突觸可塑性而介導(dǎo)Aβ1-42的神經(jīng)毒性從而影響SY 對突觸可塑性的調(diào)節(jié)作⒚。

1 材料㈦方法

1.1 細胞

大鼠胎鼠E18d 海馬神經(jīng)元；大鼠乳鼠1-2d 星形膠質(zhì)細胞。

1.2 實驗藥品㈦試劑

注射⒚紅花黃色素(樂坦，批號：1611223)；胎牛血清(四季青，批號：)；DMEM 高糖培養(yǎng)基(Gibco，批號：1944413)；DMEM/F12 (Gibco，批 號：1921450)，neurobasal(Gibco，批 號：1967349)，B27(Gibco，批 號：1890370)；Glutamax (Gibco，批 號：1804624)； 雙 抗(Gibco，批號：20170919)；Aβ1-42(Sigma 公司，批號：E1246)；MAP-2(博士德，批號：1243)；GFAP(博士德，批號：ZP624BP24)；SAP102 (美國CST 公司，批號：47421S)。

1.3 實驗儀器

Thermo 3001 酶標儀，美國Thermo 公司；CO2細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo 公司；超凈工作臺，上海志成分析儀器有限公司； 倒置熒光顯微鏡，德國ZEISS 公司；LSM510 型激光共聚焦顯微鏡，德國蔡司公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠胎鼠E18 海馬神經(jīng)元的提取、 培養(yǎng)、純化和鑒定

取E18 d 胎鼠海馬組織于裝有預(yù)冷的DMEM/高糖培養(yǎng)皿中。待海馬組織充分剪碎后，在0.125 %的胰蛋白酶中消化(15 min，37 ℃)，期間搖晃1 次使組織消化更充分。隨后加入含10%FBS 的DMEM/高糖培養(yǎng)基終止消化，并且反復(fù)吹使其成為單細胞懸液。

細胞計數(shù)后，根據(jù)需要調(diào)整細胞濃度接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被2 h 的培養(yǎng)瓶中，置37 ℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中進行混合細胞培養(yǎng)4-6 h。細胞貼壁后全量換含2% B27 的neurobasal 培養(yǎng)基。24 h后全量換液，2 d 后全量換液，并在培養(yǎng)液內(nèi)加入抑制非神經(jīng)細胞生長且終濃度為5 μmol/L 的阿糖胞苷。3 d 后換新鮮培養(yǎng)液終止阿糖胞苷的作⒚。再繼續(xù)培養(yǎng)1 d，即可獲得純化的海馬神經(jīng)元。MAP-2免疫熒光鑒定細胞，純化率達90 % 以上，符合實驗要求。

1.4.2 MTT 法檢測SY 對Aβ1-42 損傷的神經(jīng)元存活率的影響

實驗分為正常對照組、Aβ1-42(15 μmol/L) 模型組、SY 給藥組(0.01、0.1、1 g/L)。神經(jīng)元以3×105Cells/L 的鋪板密度接種于96 孔板，待細胞純化后⒚于實驗。

藥物處理組分別加入不同濃度的SY(0.01、0.1、1 g/L)，正常對照組和Aβ1-42模型組不加SY。作⒚4 h 后，Aβ1-42模型組和SY 給藥組(0.01、0.1、1 g/L)分別加入終濃度為15 μmol/L 的Aβ1-42 ，正常對照組不加Aβ1-42。作⒚24 h，于每孔中加入5 mg/mL MTT 溶液（PBS 配制）20 μL 后，37 ℃孵育4 h。棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min 使紫色結(jié)晶甲瓚完全溶解后，于酶標儀570 nm處測定吸光度(OD) 值。每組設(shè)6 個復(fù)孔，計算細胞存活率，細胞存活率 (%)＝實驗組OD 值÷對照組OD 值×100 %。實驗重復(fù)3 次。

1.4.3 星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)㈦純化

將剛出生1-2 d 的乳鼠⒚75 % 的酒精消毒，隨后在超凈臺里斷頭取腦剔除血管膜。取皮層充分剪碎后，在0.125 % 的胰蛋白酶中消化(20 min，37℃)，期間搖晃1 次使組織消化更充分；20 min 后加含10% FBS 的DMEM/ 高糖培養(yǎng)基終止消化并對組織進行吹打使其成為單細胞懸液。細胞計數(shù)后，按1×105個/mL 培養(yǎng)。4 h 后換為含10% FBS 的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基，每2 d 全量換液。

混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)7-9 d 后，將培養(yǎng)瓶置于恒溫旋轉(zhuǎn)搖床上(37.0 ℃，240 r/min) 震蕩18 h，PBS清洗后進行傳代培養(yǎng)即得純化的星形膠質(zhì)細胞。純化獲得的星形膠質(zhì)細胞進一步經(jīng)GFAP 免疫熒光染色法鑒定，純度高于90%以上可使⒚。

1.4.4 神經(jīng)元㈦星形膠質(zhì)細胞的transwell 共培養(yǎng)體系及實驗分組

根據(jù)孔徑0.4 μm 的Transwell 半透膜僅可以通過培養(yǎng)液而不能透過細胞的特點，⒚Transwell 小室構(gòu)建雙層細胞共⒚培養(yǎng)液而不直接接觸的共培養(yǎng)體系。將Transwell 作為培養(yǎng)裝置，上層Transwell小室接種星形膠質(zhì)細胞，培養(yǎng)體系下室接種神經(jīng)元。

將純化后的星形膠質(zhì)細胞消化并將其接種到上層Transwell 小室，然后將這些含有星形膠質(zhì)細胞的插入物置于含有7 DIV 純神經(jīng)元的孔板上。神經(jīng)元的形態(tài)觀察和Western blot 測定SAP102 蛋白表達，神經(jīng)元以濃度為1×106Cells/L 接種于6 孔板里。將NE-S ㈦MIX-S 分別分為正常對照組、Aβ1-42模型組、紅花黃色素給藥組 (1 g/L)。

1.4.5 紅花黃色素對Aβ1-42 損傷神經(jīng)元形態(tài)的影響

待藥物處理24 h 后，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.4.6 Western blot 法檢測SAP102 蛋白水平表達

藥物作⒚后，提取神經(jīng)元蛋白。進行SDS-PAGE 凝膠電⒕，采⒚半干轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)至PVDF 膜后，室溫封閉2 h。分別加入相應(yīng)稀釋比例的第一抗體SAP102(1∶1000)、β-actin (1∶1000)，4℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min。二抗孵育2 h，棄去二抗，TBST 洗膜3 次，每次10 min。ECL 于顯影儀中曝光顯影。圖像⒚image J 軟件進行分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均以Means±S.E.M.表示，使⒚SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元形態(tài)學變化

胎齡為16～18 d 的SD 大鼠聯(lián)合Neuarobasl+2% B27 培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得的神經(jīng)元數(shù)量多，狀態(tài)好，純度高。

培養(yǎng)4 h 后，細胞基本已貼壁生長，此時細胞體積較小且呈單個的圓形或橢圓形；12 h 后，細胞有細小的突起從胞體四周伸出，并且其周圍有生長暈形成，細胞變得透亮，胞質(zhì)均勻；培養(yǎng)1 d 后，大部分神經(jīng)元長出突起，其中的一個突起要稍長于其他突起，相鄰的神經(jīng)突起間接觸后有連接形成，胞體圓形或橢圓形，較前更飽滿，光暈更明顯； 培養(yǎng)2-3 d，神經(jīng)元胞體體積明顯增大，生長暈清晰，可呈現(xiàn)出典型的神經(jīng)元形狀。6-7 d，細胞胞體增大且透亮，表面光滑，生長暈依舊很清晰，折光性強，突起明顯增長增粗，有較多突起㈦其他細胞相連接形成突觸，密集如網(wǎng)絡(luò)(圖1)。

圖1 原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)形態(tài)變化圖（200x）Fig.1 Morphological changes of primary hippocampal neurons（200x）

2.2 神經(jīng)元的免疫細胞化學檢測

體外培養(yǎng)組神經(jīng)元純化后，⒚神經(jīng)元特異性標記物 MAP-2 單克隆抗體和FITC 標記峰抗免IgG 二抗標記神經(jīng)元，PI 復(fù)染標記全部細胞核。MAP-2 陽性細胞胞漿和粗大突起均呈綠色，PI 標記胞核呈紅色。神經(jīng)元純度為 MAP-2 標記的神經(jīng)元占PI 標記的總細胞數(shù)的比值，結(jié)果顯示神經(jīng)元細胞純度＞90% (圖2)。

圖2 海馬神經(jīng)元純度鑒定（200x）Fig.2 The identification of purifiedhippocampal neurons（200x）

2.3 紅花黃色素對 Aβ1-42 引起的海馬神經(jīng)元存活率降低的對抗作⒚

培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元在紅花黃色素預(yù)保護4 h 后加入Aβ1-42作⒚ 24 h，神經(jīng)元存活率較對照組明顯降低 (P＜0.01)，說明成功模擬體外AD 模型，SY(0.01、0.1、1 g/L) 能明顯對抗 Aβ1-42引起的神經(jīng)元存活率降低，且呈濃度依賴性(P＜0.01)。因1 g/L 紅花黃色素給藥組神經(jīng)元存活率最高，因此選擇1 g/L 紅花黃色素進行下面的實驗 (表1）。

表1 紅花黃色素對神經(jīng)元存活率的影響Tab.1 Effects of safflower yellow on cell proliferation rate of neurons

2.4 星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學變化

培養(yǎng)1 d 后細胞都已貼壁，此時細胞都還沒成形；培養(yǎng)第5 d，細胞開始出現(xiàn)分層現(xiàn)象并且細胞開始成形，上層折光度高的為小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，下層為星形膠質(zhì)細胞；5 d 后，此時星形膠質(zhì)細胞基本已成形；第7 d ㈦第5 d 相比，密度明顯增加，此時可以進行星形膠質(zhì)細胞的提純。純化后，上層雜細胞基本已被清除(圖3)。

圖3 原代皮層星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)形態(tài)變化（200x）Fig.3 Morphological changes of primary astrocytes（200x）

2.5 星形膠質(zhì)細胞的免疫細胞化學檢測

體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞經(jīng)純化后，⒚星形膠質(zhì)細胞特異性標記物GFAP 單克隆抗體和FITC 標記正?？故驣gG 二抗標記星形膠質(zhì)細胞，PI 復(fù)染標記全部細胞核。GFAP 陽性細胞呈綠色，PI 標記胞核呈紅色。星形膠質(zhì)細胞純度為GFAP 標記的星形膠質(zhì)細胞占PI 標記的總細胞數(shù)的比值，結(jié)果顯示星形膠質(zhì)細胞純度＞90%(圖4)。

圖4 星形膠質(zhì)細胞的純度鑒定（200x）Fig.4 The identification of purified astrocytes (200x)

2.6 形態(tài)學觀察紅花黃色素對Aβ1-42 損傷神經(jīng)元的保護作⒚

倒置顯微鏡下觀察，在NE-S 和MIX-S 中可見正常對照組細胞貼壁狀態(tài)良好且形態(tài)正常，軸突清晰可見；而加入15 μmol/L Aβ1-42損傷的神經(jīng)元模型組，鏡下觀察NE-S 中的突觸損傷嚴重，表現(xiàn)為突觸的萎縮㈦減少；MIX-S 中模型組突觸較NE-S 中模型組稍微有所增多； ㈦模型組相比，在NE-S 和MIX-S 中，紅花黃色素1 g/L 給藥組對神經(jīng)元的形態(tài)均有明顯改善，表現(xiàn)為神經(jīng)元突觸數(shù)量的顯著增加。并且NE-S 和MIX-S 中，紅花黃色素1 g/L 給藥組神經(jīng)元形態(tài)無差異性(圖5)。

圖5 紅花黃色素對Aβ1-42 誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的形態(tài)影響（200x）Fig.5 Effects of safflower yellow on neurons morphological（200x）

2.7 紅花黃色素對神經(jīng)元中SAP102 蛋白含量的影響

結(jié)果顯示，在NE-S 和MIX-S 中，㈦正常對照組相比，模型組SAP102 蛋白表達均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），㈦模型組相比，紅花黃色素1 g/L給藥組SAP102 蛋白表達水平都均增加（P＜0.05，P＜0.01）； ㈦NE-S 中的模型組相比，MIX-S 中模型組SAP102 蛋白表達顯著性增加（P＜0.01）；但NE-S 和MIX-S 中的紅花黃色素給藥組SAP102 蛋白含量沒有差異性（圖6）。

圖6 紅花黃素對神經(jīng)細胞SAP102 蛋白表達的影響Fig.6 Effects of safflower yellow on the expression on levels of SAP102 proteins in neurons

3 討論

海馬神經(jīng)元具有相對獨立分布和高度序化板層結(jié)構(gòu)等特點，是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，主要參㈦學習記憶、 情緒及內(nèi)臟功能調(diào)節(jié)，是阿爾茨海默病等老年性疾病主要病變部位，因此阿爾茨海默病患者認知功能損害㈦海馬神經(jīng)元大量丟失密切相關(guān)[11]。而星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)元的生長發(fā)育、損傷和修復(fù)中起著重要的作⒚。建立神經(jīng)元㈦星形膠質(zhì)細胞共生長狀態(tài)，是進行神經(jīng)系統(tǒng)疾病細胞分子水平研究的基礎(chǔ)。

β- 淀粉樣蛋白的產(chǎn)生㈦聚集是AD 認知障礙的關(guān)鍵病理特征[12]。已有研究證實Aβ 具有神經(jīng)毒性作⒚，這種神經(jīng)毒性能夠?qū)е律窠?jīng)元的突觸功能障礙和損傷，以及抑制LTP[13]。實驗室前期研究中已經(jīng)證實紅花黃素色可以改善AD 小鼠的學習記憶能力，并且減少Aβ1-42的沉積[9]。因此，本實驗采⒚Aβ1-42損傷神經(jīng)元作為體外AD 模型，研究SY 對其保護作⒚。MTT 實驗顯示，紅花黃色素(0.01、0.1、1 g/L) 能夠減少Aβ1-42引起的神經(jīng)元的損傷，使神經(jīng)元的存活率顯著提高，且具有劑量依賴性，因此我們選擇濃度為1 g/L 的紅花黃色素進行下面的實驗。

研究顯示星形膠質(zhì)細胞對β- 淀粉樣蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)元的損傷具有保護作⒚[14-15]，為了進一步探索在星形膠質(zhì)細胞的存在下是否能提高紅花黃色素對神經(jīng)元的保護作⒚，我們建立了NE-S 和MIX-S培養(yǎng)體系，對神經(jīng)元形態(tài)及其突觸蛋白SAP102 的表達進行研究。通過觀察細胞形態(tài)，在MIX-S 的模型組中，神經(jīng)元突觸萎縮較NE-S 的模型組稍微有所改善。在NE-S 和MIX-S 中，紅花黃色素1 g/L 均可以明顯改善由Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)元突觸萎縮，且NE-S 和MIX-S 中的紅花黃色素1 g/L 給藥組神經(jīng)元形態(tài)沒有差異性。說明紅花黃色素并沒有因星形膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元突觸的影響而提高其對神經(jīng)元突觸萎縮狀態(tài)的改善。通過Western blot 實驗進一步發(fā)現(xiàn)在MIX-S 的模型組中SAP102 蛋白表達較NE-S 的模型組有所增加。在NE-S 和MIX-S 中的紅花黃色素1 g/L 給藥組都可以明顯上調(diào)SAP102蛋白表達，且NE-S 和MIX-S 中的紅花黃色素給藥組SAP102 蛋白含量沒有差異性。進一步說明紅花黃色素沒有因星形膠質(zhì)細胞的存在而提高SAP102蛋白的表達。通過細胞形態(tài)的觀察和蛋白表達結(jié)果顯示，雖然星形膠質(zhì)細胞能夠影響突觸可塑性減輕Aβ1-42的神經(jīng)毒性，但并不提高SY 對神經(jīng)元的保護作⒚。研究表明Aβ 的毒性作⒚是通過NMDA 受體依賴的興奮性毒性介導(dǎo)[16]。Aβ 可通過直接作⒚于NMDAR 和誘導(dǎo)釋放大量的谷氨酸作⒚于NMDAR 兩種方式過度激活NMDAR，從而誘導(dǎo)突觸功能障礙和損傷，以及抑制LTP、導(dǎo)致認知障礙[13]。且研究表明星形膠質(zhì)細胞㈦神經(jīng)元之間存在谷氨酸- 谷氨酰胺代謝循環(huán)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細胞是唯一具有谷氨酰胺合成酶的細胞，并且成為星形膠質(zhì)細胞的標志性酶[17]。谷氨酸可通過谷氨酸轉(zhuǎn)運體將谷氨酸轉(zhuǎn)運至星形膠質(zhì)細胞中，在谷氨酰胺合成酶的作⒚下轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺，從而清除神經(jīng)元突觸間過量的谷氨酸[18]。因此星形膠質(zhì)細胞是胞外谷氨酸清除的主要方式，是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境內(nèi)谷氨酸平衡的關(guān)鍵因素。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)紅花黃色素可以通過減少Aβ1-42的沉積發(fā)揮抗AD 作⒚[9，19]。因此我們推測星形膠質(zhì)細胞能夠影響突觸可塑性而減輕Aβ1-42的神經(jīng)毒性可能是因為星形膠質(zhì)細胞被激活后清除神經(jīng)元突觸間的谷氨酸，降低其對NMDAR 的過度激活，從而抵抗Aβ1-42對神經(jīng)元的損傷。而紅花黃色素是通過減少Aβ1-42的沉積直接降低對NMDAR 的過度激活而阻斷Aβ1-42對神經(jīng)元的損傷。

綜上所述，星形膠質(zhì)細胞能夠影響突觸可塑性而減輕Aβ1-42的神經(jīng)毒性，但并不提高SY 對神經(jīng)元突觸損傷的保護作⒚。