王姍姍　劉小嬌　靳玉龍　白婷　朱明霞　王波　張文會(huì)　張玉紅

摘要本文以青稞為材料，對(duì)AFLP酶切連接、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，酶切反應(yīng)條件為DNA模板200ng、限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI/MseI4U、酶切時(shí)間4h;連接反應(yīng)條件為連接溫度16°C，T4連接酶3U，連接時(shí)間12h以上;預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)條件為rTaq聚合酶3U、dNTP4mmol/L、鎂離子濃度1.00mmol/L;選擇性擴(kuò)增反應(yīng)條件為rTaq聚合酶4U、dNTP4mmol/L、鎂離子濃度1.25mmol/L及預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋10倍。利用優(yōu)化后的AFLP體系，以藏青2000、冬青18這2個(gè)供試材料的基因組為模板，從100對(duì)引物組合中篩選出10對(duì)重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、擴(kuò)增條帶清晰、分布均勻、多態(tài)性高的引物組合，為青稞種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性分析提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 青稞;AFLP;PCR體系優(yōu)化;引物篩選

中圖分類(lèi)號(hào) S512.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-5739（2019）05-0003-04

青稞（Hordeum?vulgare）是西藏自治區(qū)的主要糧食作物，2017年產(chǎn)量達(dá)78萬(wàn)t。隨著開(kāi)發(fā)應(yīng)用的逐步深人，青稞在釀造產(chǎn)業(yè)、保健食品及再生能源方面顯示出極大的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用前景。青藏高原地形地貌復(fù)雜，氣候帶齊全，土壤種類(lèi)繁多，區(qū)域小氣候明顯，生長(zhǎng)環(huán)境迥異，使西藏地區(qū)青稞具有更為豐富的多樣性"。孫立軍等在9000份中國(guó)大麥栽培種中以穗部形態(tài)特征鑒定出420個(gè)變種，而中國(guó)特有300個(gè)變種，其中西藏高原的變種類(lèi)型最豐富，高達(dá)60%。西藏地區(qū)青稞的多樣性是開(kāi)發(fā)優(yōu)良作物的遺傳基礎(chǔ)，然而隨著現(xiàn)代育種目標(biāo)朝著高產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良和抗逆性強(qiáng)的方向邁進(jìn)，遺傳基礎(chǔ)單一，基因流失的現(xiàn)象日益嚴(yán)重。因此，需要廣泛收集多樣的農(nóng)家品種、地方品種及野生種，同時(shí)對(duì)現(xiàn)有的種質(zhì)資源進(jìn)行深入分析。

AFLP（amplified?fragment length?polymorphism）技術(shù)是由Vos于1995年發(fā)明的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，由RFLP技術(shù)結(jié)合PCR技術(shù)而成回。AFLP的優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)為：一是DNA模板需要量少;二是不需事先了解待研究物種的基因組信息;三是穩(wěn)定性強(qiáng);四是重復(fù)性好;五是覆蓋整個(gè)基因組;六是非等位基因出現(xiàn)共遷移的概率很低;七是條帶多;八是多態(tài)性高4。

AFLP被公認(rèn)為是一種非常有效的理想的分子標(biāo)記技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于種群結(jié)構(gòu)分析檢測(cè)遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育等方面的研究[5-8。AFLP由于可以分辨出基因組的細(xì)微差異，因而可以在“DNA指紋水平”進(jìn)行個(gè)體鑒定、親緣關(guān)系及遺傳多樣性的分析9。用AFLP的3個(gè)引物就可鑒別出一個(gè)山龍眼種群96%的種子的父本10。AFLP在多個(gè)物種中用于AFLP指紋圖譜構(gòu)建及物種資源的遺傳多樣性分析，如梨、花生等。

本文根據(jù)AFLP分子標(biāo)記技術(shù)穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好及多態(tài)性高的特點(diǎn)，對(duì)AFLP酶切連接預(yù)擴(kuò)增選擇性擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)從100對(duì)選擇性擴(kuò)增引物中篩選重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、擴(kuò)增條帶清晰分布均勻、多態(tài)性高、可用于青稞種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性分析的引物組合，以期為青稞遺傳改良和親本選配提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料。試驗(yàn)所選青稞品種為西藏自治區(qū)主推青稞品種，分別為春青稞藏青2000和冬青稞冬青。

1.1.2接頭和引物信息。試驗(yàn)用接頭、預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增引物（表1），均由生工生物工程有限公司合成。其中，選擇性擴(kuò)增引物共10對(duì)，可形成100對(duì)引物組合。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1青稞基因組DNA提取。在三葉期剪取青稞幼苗，采用改良版CTAB法提取DNA，用1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量并估測(cè)DNA濃度。DNA樣品在-20C下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2AFLP限制性酶切和連接。選取的限制性?xún)?nèi)切酶組合為EcoRI/MseI，將提取純度較高的植物基因組進(jìn)行限制性酶切和連接。對(duì)模板濃度EcoRI/MseI限制性酶濃度、T4連接酶濃度及酶切時(shí)間和連接時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

連接反應(yīng)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)為T(mén)4連接酶2U連接時(shí)間6h、T4連接酶2U連接時(shí)間12h、T4連接酶3U連接時(shí)間6h、T4連接酶3U連接時(shí)間12h;酶切反應(yīng)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

1.2.3AFLP預(yù)擴(kuò)增。以酶切連接產(chǎn)物為模板，進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，并對(duì)rTaq聚合酶濃度、鎂離子濃度和dNTP濃度進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表3。

PCR擴(kuò)增程序：949C預(yù)變性3min;94C變性45s;50C復(fù)性45s，729C延伸1min，26個(gè)循環(huán)。

1.2.4AFLP選擇性擴(kuò)增。用1XTE稀釋預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，選用Touch-downPCR進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，并對(duì)預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋倍數(shù)、rTaq聚合酶濃度鎂離子濃度和dNTP濃度進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表4。

PCR擴(kuò)增程序：95C預(yù)變性5min;95C變性35s，65C復(fù)性35s（每循環(huán)降低0.7C），72C延伸1min，12個(gè)循環(huán);94C變性30s，56C復(fù)性30s，72C延伸1min，23個(gè)循環(huán)。

1.2.5變性電泳。選擇擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，94C變性10min后進(jìn)行6%變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分析，銀染后觀察，檢測(cè)引物擴(kuò)增效果。

2結(jié)果與分析

2.1青稞基因組DNA提取與檢測(cè)

DNA質(zhì)量直接影響到AFLP的酶切連接過(guò)程，將提取的基因組DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后顯像，條帶壓縮緊密，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，并且條帶與入DNA條帶一致（圖1）。表明DNA質(zhì)量能夠滿足AFLP的試驗(yàn)要求，也說(shuō)明采用的DNA，提取方法適合青稞基因組DNA的提取。

2.2青稞AFLP酶切反應(yīng)條件篩選