鄧小軍，顏 權(quán)，李海星，韓 華，李武應(yīng)，唐 健，王會(huì)利，宋賢沖，覃祚玉

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 a.國(guó)家林業(yè)局中南速生材繁育實(shí)驗(yàn)室；b.廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530003；2.廣西派陽(yáng)山國(guó)有林場(chǎng)，廣西 寧明 532500；3.天峨縣林朵林場(chǎng)，廣西 天峨 547300）

土壤是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，也是林業(yè)健康發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，是滿足社會(huì)對(duì)林產(chǎn)品需求和實(shí)現(xiàn)林業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保障。磷元素是植物所必需的第二大元素，然而世界大部分土壤處于缺磷狀態(tài)[1]，施入土壤的大量磷素容易與陽(yáng)離子結(jié)合形成無(wú)法被植物利用的難溶磷酸鹽，南方森林土壤95%的磷都是無(wú)法被植物直接吸收的難溶態(tài)磷，磷素缺乏是影響林木生長(zhǎng)的重要因子之一[2]。近年來(lái)，隨著南方尤其是南亞熱帶速生豐產(chǎn)林的快速發(fā)展，南方森林為國(guó)家提供了大量的木材需求。同時(shí)南方速生豐產(chǎn)林大部分為人工純林，生物多樣性簡(jiǎn)單，生態(tài)系統(tǒng)薄弱，林地產(chǎn)出多，大量不合理的化學(xué)肥料施用造成生態(tài)環(huán)境質(zhì)量下降，水土污染和地力衰退等問(wèn)題日益嚴(yán)重[3]。

林木根際是森林土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是土壤-林木-微生物三者互相聯(lián)系互相影響的地方。眾多研究[4-6]表明，土壤微生物參與森林生態(tài)系統(tǒng)的氮、磷、鉀等物質(zhì)和能量循環(huán)，施加土壤有益菌是有效增加植物產(chǎn)量、平衡土壤生態(tài)提高土壤質(zhì)量的途徑之一。Sperber等[7]發(fā)現(xiàn)，大部分的溶磷微生物均出現(xiàn)在植物根際土壤中。溶磷微生物不僅能提高土壤磷素的有效性，滿足植物根系對(duì)磷素的需求[8-9]，還能分泌一些植物生長(zhǎng)激素，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)提高植物的抗逆能力。同時(shí)根際環(huán)境也能提供溶磷微生物生長(zhǎng)繁殖的一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它們具有相互促進(jìn)的作用。目前，關(guān)于溶磷菌微生物肥料的研究主要在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域[4,10-11]，戴沈艷等[10]從紅壤水稻土分離獲得一株對(duì)磷酸鈣非常好效果的菌株，其溶磷量達(dá)到159.1 mg·L-1，而關(guān)于林木溶磷菌株的研究還不多[12-15]。因此，本研究從廣西不同紅壤區(qū)林木根際土壤篩選了溶磷微生物，進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵和傳代培養(yǎng)試驗(yàn)，確定其溶磷能力，并進(jìn)行了種屬鑒定，為下一步研制林木菌肥菌劑提供菌種基礎(chǔ)材料，同時(shí)為南方尤其是南亞熱帶人工林的減肥增效及可持續(xù)經(jīng)營(yíng)提供數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

PKO（Pikovskaya's Medium)培養(yǎng)基：葡萄糖 ，10 g；Ca3(PO4)2，3 g； (NH4)2SO4，0.5 g； NaCl，0.1 g；MgSO4·7H2O ，0.1 g；KCl，0.2 g； MnSO4，0.004 g；FeSO4·7H2O，0.002 g； 酵母膏，0.6 g；水，1 000 mL；pH值7.2。

LB培養(yǎng)基配方見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。

1.2 土壤樣品

從廣西紅壤區(qū)梧州、田林、寧明、天峨、賀州、南寧、玉林等地林木優(yōu)勢(shì)木根際土壤采取0～20 cm深度的林木根際土壤樣品，每份0.5 kg，裝入沒(méi)有拆封過(guò)的薄膜封口袋中，貼上標(biāo)簽并注明采集地點(diǎn)、日期，封口。置于冰袋中帶回實(shí)驗(yàn)室置于4 ℃保存，進(jìn)行溶磷菌株分離。

1.3 林木根際溶磷菌分離純化

將不同地區(qū)的林木根際土壤稱取樣品5 g，置于裝有45 mL 0.85%生理鹽水的150 mL無(wú)菌錐形瓶中，振蕩混勻制成懸浮液。用移液槍從中吸取1 mL懸浮液注入盛有9 mL 0.85%無(wú)菌生理鹽水的試管中，振蕩混勻，再?gòu)拇嗽嚬苤形? mL，注入另一盛有9 mL 0.85%無(wú)菌NaCl溶液的試管中，以此類推，制成土壤含量依次為10-3、10-4、10-5g·mL-1的3種梯度的懸浮液。用移液槍吸取50 μL土壤懸浮液涂布PKO平板，每個(gè)梯度重復(fù)4次，并作好記錄標(biāo)記。恒溫28℃，培養(yǎng)3 ～5 d，以透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）比值（即HE值）的大小對(duì)該菌株溶磷能力進(jìn)行初篩，將HE值高的菌株分別接種到LB培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，在PKO培養(yǎng)基上連續(xù)傳代3次后都能正常生長(zhǎng)則確定為有效溶磷菌株，然后保存到LB斜面培養(yǎng)基上，置于4 ℃的冰箱保存。

1.4 各溶磷菌株的溶磷能力的測(cè)定及復(fù)篩

準(zhǔn)備250 mL錐形瓶，裝入100 mL PKO培養(yǎng)基，滅菌冷卻，用移液槍吸取1 mL待測(cè)菌株菌液（108cfu·mL-1）接種至錐形瓶中。每個(gè)菌株設(shè)置5個(gè)重復(fù)，對(duì)照處理加1 mL無(wú)菌水代替菌液。將上述錐形瓶置于28 ℃、160 r·min-1搖床培養(yǎng)3 d。將發(fā)酵液置離心機(jī)以10 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，取5 mL上清液，用鉬銻鈧比色法[16]在波長(zhǎng)700 nm下測(cè)定有效磷含量。

1.5 林木根際溶磷菌菌落形態(tài)觀察

以平板劃線法分離純化得到溶無(wú)機(jī)磷菌株，置于28 ℃培養(yǎng)36 ～48 h。觀察記錄各菌株菌落的大小、顏色、形態(tài)、光澤度等。

1.6 16 S rDNA測(cè)序和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

1.6.1 細(xì)菌總 DNA 的提取

細(xì)菌總DNA提取方法見(jiàn)文獻(xiàn)[17]略有改動(dòng)，具體步驟如下：

1） 取培養(yǎng)24 h的搖床液體NA菌株發(fā)酵液，在5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min，獲取目標(biāo)菌體富集物。

2） 取30 mg菌體加入1 mL菌體裂解液懸浮沉淀，加質(zhì)量濃度50 mg·mL-1的溶菌酶5 μL，震蕩混勻，置于37 ℃保溫20 min。

3） 加蛋白酶K（20 mg·mL-1）20 μL，搖晃均勻，保持65 ℃ 1 h。

4） 用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混合液抽提，在12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min，吸取上清液置于另一離心管，重復(fù)抽提一次。

5） 用等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提一次，12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清于另一離心管。

6） 加0.1 V醋酸納溶液（pH值 5.2）和2 V無(wú)水乙醇，混勻，-20 ℃沉淀2 h。

7） 4 ℃下12 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集底部沉淀，然后用70% 乙醇洗滌沉淀，干燥后溶解于適量的TE中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增與純化

以提取的細(xì)菌DNA為PCR模板，用16S rDNA 的通用引物（正向引物 16Sf，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物16Sr，3′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-5′）對(duì) 目標(biāo)細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR 反應(yīng)體系：10×Ex Taq Buffer 2 μL、2.5 mmol dNTP Mix 1.6 μL、Template 0.5 μL、5 U Ex Taq酶0.2 μL、10 μmol 引物各0.8 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 補(bǔ)足20 μL。

PCR 反應(yīng)條件：先在95 ℃變性5 min；然后以95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，一共24 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。獲得PCR 產(chǎn)物送上海美吉生物技術(shù)有限公司純化測(cè)序。

1.6.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將測(cè)序獲得的菌株16SrDNA序列申請(qǐng)?zhí)峤坏紾enbank數(shù)據(jù)庫(kù)，并在 NCBI上BLAST比對(duì)，選取一些有代表性的菌株16S rDNA序列，然后用 Bioedit的 Multiple Sequence Alignment進(jìn)行同源性分析，最后采用MEGA 4.1構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（Bootstrap=1000）。

1.6.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所獲得的數(shù)據(jù)用Excel (Version 2007,Microsoft Inc.)軟件處理，以±SD表示。用SPSS（Version 18.0,SPSS Inc.）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Tukey’s HSD檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差（One-way ANOVA）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 林木根際溶磷菌初篩

采用PKO培養(yǎng)基篩選廣西不同地區(qū)林木根際解無(wú)機(jī)磷菌株，共獲得有效菌株42株。獲得HE值大于1.2的溶無(wú)機(jī)磷菌株6株（表1）。

表1 6株初篩溶磷菌的HE值?Table 1 The HE values of six promising phosphatesolubilizing strains

初篩結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)透明圈法初步判斷菌株溶磷效果，HE值大于1.2的溶無(wú)機(jī)磷菌株有6株，即L202、L205、L301、L302、L401、L503。溶磷能力最強(qiáng)的菌株(D/d≥2.5)為L(zhǎng)205，與其他菌株差異顯著。其余5個(gè)溶磷菌株D/d值范圍介于1.27～1.88之間。菌株在PKO培養(yǎng)基上呈現(xiàn)的HE值大小與菌株代謝產(chǎn)物酶或者酸的種類及釋放的快慢等相關(guān)。有學(xué)者[18]研究發(fā)現(xiàn)，從土壤中篩選獲得具有明顯溶磷圈的溶磷菌經(jīng)過(guò)純化傳代培養(yǎng)后又失去了溶磷能力。Kucey等[19]研究發(fā)現(xiàn)溶磷菌在轉(zhuǎn)移傳代過(guò)程中50%的菌株溶磷能力減弱甚至消失了。所以透明圈法只能作為溶磷菌的初步篩選指標(biāo)，所獲得的菌株需要進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)篩來(lái)確定其溶磷效果。

2.2 林木根際溶磷菌菌株溶磷量測(cè)定及復(fù)篩結(jié)果

通過(guò)錐形瓶液體搖瓶發(fā)酵測(cè)定了其中6株HE值大于1.2菌株的溶磷量，結(jié)果見(jiàn)表2。發(fā)現(xiàn)6株菌株均具有較好的溶磷能力，各菌株發(fā)酵液溶磷量存在差異，6株菌株的有效磷增量在78.38 ～203.04 mg·L-1之間，其中，L205溶磷量最高，達(dá)到了203.04 mg·L-1；其次是L503和L301，分別是175.55 mg·L-1和162.28 mg·L-1。L205、L503、L301菌株溶磷效果差異不顯著。菌株L401溶磷量最少，僅為78.38 mg·L-1，與其他菌株差異顯著，而不加菌株的CK檢測(cè)出有效磷含量為5.02 mg·L-1，與其他處理差異顯著。

表2 6 株菌株搖瓶發(fā)酵溶磷能力Table 2 Six strain fermentation phosphate solubility

2.3 不同菌株發(fā)酵液中pH值的變化

有研究表明，溶磷微生物在培養(yǎng)期間發(fā)酵液的酸堿度會(huì)呈降低趨勢(shì)，發(fā)酵液中有效磷的增量同發(fā)酵液的pH值相關(guān)，這與本次研究結(jié)論一致[20-21]。不同溶磷菌株發(fā)酵液pH值的變化見(jiàn)表3，結(jié)果表明，不同溶磷菌株隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，pH值逐漸降低，其中溶磷量最多的菌株L205發(fā)酵3 d后的pH值最低，為3.13，與L302菌株處于同一水平，與其他處理差異顯著。這是由于溶磷微生物會(huì)分泌一些酸性物質(zhì)從而發(fā)酵液的pH值下降，但是其pH值下降程度與其溶磷量沒(méi)有顯著的數(shù)量關(guān)系，這說(shuō)明溶磷菌除了分泌酸性物質(zhì)還可能存在其他溶磷機(jī)制[4,22]。

表3 不同溶磷菌株發(fā)酵液pH值的變化Table 3 Variation of pH in the different culture medium

2.4 林木根際溶磷菌菌落特性觀察

把篩選得到的高效溶磷菌培養(yǎng)36 h后觀察其生長(zhǎng)情況：細(xì)菌L205菌落不透明，表面粗糙，邊緣不整齊，生長(zhǎng)速度中等；真菌L301菌落呈灰白色圓形，較大，邊緣整齊，孢子呈青色。 L205和L301均在72 h后就可以觀察到明顯的溶磷圈。

圖1 L205、L301菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain L205 and L301

2.5 高效溶磷菌株L205系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建與分析

菌株L205的16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)約1 398 bp，經(jīng)測(cè)序得到基因序列并提交進(jìn)入美國(guó)GenBank，其登錄號(hào)為MH670897。 將高效溶磷細(xì)菌L205的16 S rDNA與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，選取同源性最高的序列，運(yùn)用Clustal軟件進(jìn)行多重序列的同源性分析，并利用MEGA4.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建（圖2）。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，測(cè)序鑒定結(jié)果為：L205為巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium，置信度為88%。

3 結(jié)論與討論

森林土壤枯枝落葉等凋落物多，有機(jī)物豐富，土壤微生物相對(duì)于耕地土壤更為豐富。有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌是旱地土壤溶磷微生物中數(shù)量所占比例最大的一類[23]。目前文獻(xiàn)上報(bào)道的溶磷菌菌屬主要有芽孢桿菌Bacillus、沙門氏菌Salmonella、假單胞桿菌Pseudomonas、產(chǎn)堿菌Alcaligenes等，其中巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium是在農(nóng)業(yè)耕地上發(fā)現(xiàn)最早、溶磷效果最好、應(yīng)用面積最為廣泛的菌株[12]。

圖2 基于16S rDNA序列分析L205的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖譜Fig.2 Neighbour-joining trees of L205 based on 16S rDNA sequences

不同地區(qū)土壤環(huán)境氣候特征不同，不同植物其根際環(huán)境情況也有所差異，有研究[24]表明特殊的土壤環(huán)境會(huì)導(dǎo)致非土著微生物定殖能力差、菌種淘汰率高等弊端，故農(nóng)用微生物肥料在南方林業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用效果不理想情況突出。廣西土壤主要為紅壤，紅壤也是我國(guó)南方典型的土壤類型。目前關(guān)于我國(guó)南方紅壤地區(qū)林木根際溶磷菌的報(bào)道并不多。由于其特殊的成土過(guò)程，土壤中氧化鐵、氧化鋁和粘粒較高，有效磷缺乏，制約著該地區(qū)林木蓄積量的提高。相關(guān)研究[5]也表明廣西林地土壤“富氮、缺磷、中等鉀”。本研究從廣西不同紅壤區(qū)林木根際土壤篩選得到多株有效溶磷菌株，它們?nèi)芙鉄o(wú)機(jī)磷的有效磷增量在78.38～203.04 mg·L-1之間，其中從林木根際土壤篩選得到的菌株L205溶磷量最高，達(dá)203.04 mg·L-1。通過(guò)16 S rDNA與GenBank中的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，鑒定得出細(xì)菌L205為巨大芽孢桿菌，具有一定的應(yīng)用潛力。下一步可以研究該菌株的溶磷機(jī)制、林木根際定殖效果和促生長(zhǎng)效應(yīng)，為基于該菌株的紅壤區(qū)林木菌肥菌劑研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。