李顯煌 ，高麗云 ，王 娟 ，張貴良 ，唐軍榮 ，葉 鵬 ，雷 瀚 ，辛培堯

（1.西南林業(yè)大學 a.西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室；b.云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室；c.國家林業(yè)和草原局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224；2.畢節(jié)市林業(yè)科學研究所，貴州 畢節(jié) 551700；3.云南省大圍山國家級自然保護區(qū)河口管理分局，云南 河口 661399）

云南金花茶Camellia fascicularisH.T.Chang是山茶科Theaceae山茶屬Camellia金花茶組Sect.Chrysantha的一個種，又稱簇蕊金花茶、云南顯脈金花茶，是云南特有的極小種群植物[1]。云南金花茶花大，且呈金黃色，形態(tài)美觀，具有極高的觀賞價值，是培育茶花優(yōu)良品種的重要種質(zhì)資源，且有較好的食用和藥用價值[2]。張貴良等[3]人調(diào)查研究顯示，云南金花茶僅分布于云南省個舊、河口、馬關(guān) 3縣市，海拔 360～1 000 m 的溝谷或山坡熱帶雨林中。野生狀態(tài)下的云南金花茶已經(jīng)為數(shù)不多，而且這些野生資源的數(shù)量正在逐年銳減?，F(xiàn)已被列入云南省珍稀樹種。同時也是云南省2010—2015年極小種群物種拯救保護緊急行動計劃中涉及的物種之一。

SSR（Simple sequence repeat）簡單重復(fù)序列，又稱為微衛(wèi)星序列，是廣泛分布于真核生物基因組中的以幾個核苷酸（多為 2～4個）為單位串聯(lián)重復(fù)組成的 DNA 序列。該技術(shù)是基于 PCR 技術(shù)的一種分子標記技術(shù)[4]，被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性檢測、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及種質(zhì)鑒定等[5-10]研究領(lǐng)域 。因為不同的植物材料對SSR反應(yīng)體系的要求有所不同，有時這種差異表現(xiàn)非常明顯。因此，在利用SSR分子標記對不同種植物進行SSR遺傳研究時，必須先建立該種植物的SSR-PCR反應(yīng)體系。目前，所見云南金花茶的相關(guān)報道，多為資源調(diào)查[3]、無性繁殖[11]以及莖、葉和花的礦質(zhì)元素分析[12-13]等，而在分子水平方面研究相對缺乏。本研究以云南金花茶嫩葉為實驗材料，利用不同的3種方法提取其DNA，繼而對影響 SSR-PCR 體系的 Mg2+、 Taq DNA聚合酶、dNTP、引物及模板 DNA 這 5個因素進行正交實驗，最終對其 PCR產(chǎn)物進行檢測，以期獲得最佳云南金茶花SSR-PCR體系。云南金茶花SSR-PCR體系的建立與優(yōu)化，可為研究云南金花茶的遺傳多樣性、闡明云南金花茶種群內(nèi)的遺傳變異狀況及其遺傳改良提供理論依據(jù)，同時也可為云南金花茶的瀕危機制研究及其保護奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗材料采集于云南省個舊市、河口縣及馬關(guān)縣云南大圍山國家級自然保護區(qū)共 6份具有代表性的云南金花茶個體（表1），用于基因組DNA的提取。采集的材料均為無病蟲害、新鮮的幼嫩葉片，分別按單株放入自封袋，并用變色硅膠迅速干燥固定，分別做好標記和編號，備用。

表1 云南金花茶的采樣信息Table1 Sampling information of Camellia fascicularis

1.2 方 法

1.2.1 最佳DNA提取方法的篩選

1.2.1.1 DNA提取方法

實驗采用 Ezup 柱式植物基因組 DNA 抽提試劑盒法（上海生工生物工程有限公司，以下簡稱試劑盒法）、SDS 法[14-15]和 CTAB法[14-15]提取云南金花茶DNA，進行云南金花茶 DNA的提取。比較3種方法的最終提取效果，并篩選出最佳的提取方法。

1.2.1.2 DNA 樣品的檢測方法

對提取的全部 DNA 樣品，分別用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度。

1.2.2 引物初篩

以云南金花茶葉片DNA為模板，利用西南林業(yè)大學林木遺傳育種實驗室經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序并設(shè)計、合成的4對云南金花茶 EST-SSR引物進行PCR 擴增（表2），將擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳， 擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測和拍照相，初篩出條帶清晰、單一的引物對用于云南金花茶SSR-PCR體系建立。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及程序

以提取得到的云南金花茶 DNA 為模板，利用1.2.2中所篩選引物，針對影響SSR-PCR 反應(yīng)的 5個因素：引物（A）、Mg2+（B）、dNTP（C）、Taq DNA 聚合酶（D）及模板 DNA（E）進行 L16（45）正交實驗[16]。每因素設(shè)4 個水平（表3），2 個重復(fù)，共 32 個處理，按表4添加不同體積試劑于 PCR 管中并進行標記，除此之外每管還應(yīng)加入 2 μL Taq Buffer 緩沖液[17]，用 ddH2O 補足反應(yīng)體系總體積到20 μL。PCR 擴增反應(yīng)程序為：在95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55～60 ℃（根據(jù)引物Tm而異）退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)；然后72 ℃最終延伸10 min，保存于4 ℃。

表2 用于PCR擴增的云南金花茶SSR引物序列Table2 SSR primers of Camellia fascicularis used for PCR amplification

表3 正交實驗因素與水平Table3 Factors and levels of orthogonal experiment

表4 SSR-PCR 正交實驗 L16（45）試劑及其用量Table4 Reagents and its dosage used for SSR-PCR orthogonal experiment L16(45)

1.2.4 PCR 擴增產(chǎn)物檢測

PCR擴增完成的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測[15]，圖片用相機拍照保存。

1.2.5 數(shù)據(jù)的整理與分析

參照何正文等[18]的統(tǒng)計方法，根據(jù)擴增條帶明亮度，背景清晰程度及是否有特異性條帶等條件對2次重復(fù)的正交實驗結(jié)果進行獨立打分，最佳處理計為 16分，最差的處理計為1分，分為 1～16 個等級。根據(jù) 2 次打分的結(jié)果計算每個因素在同一水平下的實驗值之和Ki及每一個因素同一水平下的平均值ki，并計算出每一因素不同水平下的極差R，極差R的大小反映出 5 個因素對 SSR-PCR 反應(yīng)體系的影響程度，在假設(shè)不考慮交互作用的情況下，R值越大，則證明該因素對反應(yīng)的影響越顯著，反之，則影響較?。籯i值越大則表明反應(yīng)體系越好。2次重復(fù)打分結(jié)果均利用SPSS19.0 軟件進行多因素方差分析。

1.2.6 PCR反應(yīng)體系通用性的驗證

選取西南林業(yè)大學林木遺傳育種實驗室經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序并設(shè)計、合成的6對SSR引物（表5）對云南金花茶DNA進行PCR擴增，用來驗證反應(yīng)體系的通用性。

表5 云南金花茶SSR引物信息Table5 Information of SSR primers for Camellia fascicularis

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取結(jié)果

2.1.1 3種方法提取云南金花茶 DNA 濃度檢測結(jié)果

3種方法提取的云南金花茶 DNA 濃度及純凈度經(jīng)超微量紫外分光光度計檢測后進行比較。其中試劑盒法提取的 DNA 濃度在 89.3～626.9 ng/μL，A260/A280在 1.80～2.13，A260/A230＞2.0，DNA條帶清晰較完整、無降解現(xiàn)象，可以用于后續(xù)實驗；

SDS 法提取的 DNA 濃度在 87.0 ～ 238.0 ng/μL，A260/A280在 1.95～2.12 之間，A260/A230＞2.0，說明得到的DNA較純凈，可用于后續(xù)實驗；

CTAB 法提取的DNA 濃度在323.8～809.1 ng/μL，A260/A280在 2.01 ～ 2.21，A260/A230＜2.0, 表明存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響，不能用于實驗。

2.1.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

采用3種方法提取云南金花茶DNA，并對其提取效果利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果如圖1 所示，試劑盒法提取得到的目的條帶明亮，清晰，無明顯尾帶； SDS 法得到的目的條帶明亮但不整齊，無尾帶；CTAB 法得到的目的條帶明亮度一般，不清晰，有明顯拖尾現(xiàn)象。因此，試劑盒法提取的云南金花茶DNA效果最好。

圖1 3種方法提取云南金花茶 DNA 瓊脂凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis for Camellia fascicularis DNA extracted by three methods

2.2 引物初篩結(jié)果

以試劑盒法提取的 DNA為模板，對 CJ1、CJ2、CJ3、CJ4 這 4 對引物進行初篩， 經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，4對引物中，僅CJ3（F:5′-CACCACCACTCACAAGGGAG-3′，R:5′-GCTTTCCGAGGAGGGTTTGA-3′） 引物能得到清晰明亮條帶，因此選該對引物進行云南金花茶SSR-PCR 體系優(yōu)化及建立。

2.3 PCR 正交結(jié)果分析

2.3.1 PCR 正交實驗直觀分析

圖2 云南金花茶 EST-SSR 引物初篩結(jié)果Fig.2 Preliminary screening results of EST-SSR primers in Camellia fascicularis

圖3 云南金花茶 SSR-PCR 正交實驗電泳結(jié)果（引物 CJ3）Fig.3 Results of agarose gel electrophoresis of SSR-PCR for Camellia fascicularis (Primer CJ3)

根據(jù)正交實驗L16（45）進行 PCR 反應(yīng)，其結(jié)果如圖3所示，不同用量的 Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物和模板 DNA 組成的體系都會導(dǎo)致PCR 擴增效果出現(xiàn)明顯差異。在 16 個處理中，處理 13擴增條帶較弱，其他各處理均擴增出不同亮度的條帶，處理 8、10、12、16 效果較好，條帶清晰，明亮，無明顯彌散現(xiàn)象。對 SSR-PCR正交實驗 16 個處理進行打分，分別為：3、3、5、9、3、7、11、16、3、13、10、14、1、12、4、16；3、4、8、9、3、7、10、16、3、13、11、14、1、12、5、15。 由 表6可知，各因素的主次順序為：RB＞RA＞RD＞RC＞RE，即 5 個因素對云南金花茶 SSR-PCR反應(yīng)體系的影響由大到小依次為：Mg2+、引物、Taq DNA 聚合酶、dNTP、模 板 DNA。A 因素 4 個水平對云南金花茶SSR-PCR反應(yīng)體系的影響主次順序為：A3＞A2＞A4＞A1， 即引物用量在 0.6 μL時擴增效果最好；B 因素 4 個水平對云南金花茶SSR-PCR 反應(yīng)體系的影響主次順序為：B4＞B2＞B3＞ B1，即 Mg2+用量在 1.5 μL 時擴增效果最好；C因素 4個水平云南金花茶SSR-PCR 反應(yīng)體系的影響主次順序為：C3＞C1＞C4＞C2，即dNTP量在0.3 μL 時擴增效果最好；D 因素 4 個水平對云南金花茶 SSR-PCR 反應(yīng)體系的影響主次順序為：D1＞D3＞D2＞D4，即 Taq DNA 聚合酶用量在0.1 μL 時擴增效果最好；E 因素 4 個水平對云南金花茶 SSR-PCR 反應(yīng)體系的影響主次順序為：E1＞E4＞ E2＞ E3，即 DNA 用量在 0.5 μL 時擴增效果最好。kB4值最大為 13.625，所以該值對應(yīng)的反應(yīng)體系最好，該值對應(yīng)的體系為處理 4、8、12、16組成的體系。

表6 正交實驗直觀分析結(jié)果Table6 Intuitive analysis results of orthogonal experiment

2.3.2 PCR 正交實驗方差分析結(jié)果

根據(jù)方差分析表（表7）可知不同用量的引物、Mg2+、dNTP、Taq DNA 聚合酶和模板DNA對云南金花茶 SSR-PCR 反應(yīng)體系的影響均達極顯著水平。用方差分析中P值的大小判斷各因素對PCR擴增反應(yīng)影響的顯著性。結(jié)果表明引物、Mg2+、Taq DNA聚合酶、模板DNA和dNTP的P值均小于0.01，說明各因素不同水平間的差異極其顯著，因此需要對每個因素的不同水平進行多重比較分析。因為分析結(jié)果中的P值均小于0.01，所以由方差分析中F值的大小判斷各因素對反應(yīng)效果的影響程度。由正交實驗方差分析表（表7）可以分析出：FB＞FA＞FD＞FC＞FE，其中Mg2+的F值最大，說明Mg2+對PCR反應(yīng)的影響程度最大；模板DNA的F值最小，影響程度也最小。各因素對反應(yīng)效果的影響程度依次為：Mg2+＞引物＞Taq DNA聚合酶＞dNTP＞模板DNA，這一結(jié)果與直觀分析結(jié)果一致。

2.3.3 各因素不同水平間比較

方差分析結(jié)果顯示各因素的不同水平間均達到極顯著差異，因此需進行多重比較。由表8可得，引物在水平 2（0.4 μL）時其分值大于其他3個水平，且與其他3個水平存在顯著差異，說明水平2（0.4 μL）是引物的最佳用量。Mg2+用量在水平 4（1.5 μL）時其分值大于其他3個水平，且與其他3個水平差異顯著，說明Mg2+的用量在 1.5 μL時評分結(jié)果最高。dNTP 用量在水平 3（0.3 μL）和水平 1（0.1 μL）的分值大于水平4（0.4 μL）和水平 2（0.2 μL），且水平1和水平3差異不顯著，說明dNTP在水平1和水平3的用量均適用。Taq DNA 聚合酶用量在水平 1（0.1 μL）和2（0.2 μL）時分值顯著大于水平 3（0.3 μL）和水平 4（0.4 μL），且前兩者間差異不顯著，說明Taq DNA 聚合酶的用量在 0.1 μL和0.2 μL時均可獲得較佳的試驗效果。DNA 用量在水平 1（0.5 μL）和 4（2.0 μL）時，其分值大于水平 2（1.0 μL）和水平 3（1.5 μL），而水平4與1之間不存在顯著差異，說明DNA的用量在0.5 μL和2.0 μL時試驗效果均佳。

表7 云南金花茶 SSR-PCR 正交實驗方差分析?Table7 Variance analysis of SSR-PCR orthogonal experiment for Camellia fascicularis

表8 各因素不同水平間多重比較結(jié)果?Table8 Multiple comparison results between different levels of each factor

2.4 云南金花茶SSR-PCR反應(yīng)體系通用性的驗證

根據(jù)正交實驗，對 PCR反應(yīng)體系中的引物、Mg2+、dNTP、Taq DNA 聚合酶及模板 DNA用量進行分析，獲得穩(wěn)定、效果佳的云南金花茶SSRPCR 反 應(yīng) 體 系 為：2.0 μL Taq Buffer、1.5 μL 的Mg2+（25 mmol/L）、0.3 μL 的 dNTP（10 mmol/L）、0.2 μL 的 Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、前后引物各 0.4 μL（10 μmol/L）、0.5 μL 的模板DNA（50 ng/μL）、14.7 μL 的 ddH2O。采用上述建立的SSR擴增體系對6對SSR引物進行PCR擴增，進行反應(yīng)體系通用性的驗證實驗。結(jié)果表明(圖4）：引物CJ5、CJ6、CJ8擴增出明顯的目的條帶，CJ8出現(xiàn)條帶彌散；CJ9能擴增出目的條帶，但條帶較弱；CJ7、CJ10擴增的目的條帶不明顯。通過驗證實驗表明已建立的云南金花茶SSR-PCR體系具有一定的通用性，能擴增出大多數(shù)SSR引物的目的條帶。

圖4 6對SSR引物的PCR擴增電泳結(jié)果Fig.4 Results of agarose gel electrophoresis of 6 paires SSR primers’ PCR products

3 討論與結(jié)論

SSR-PCR 反應(yīng)體系的建立是SSR 標記技術(shù)應(yīng)用的前提，目前主要通過單因素實驗和正交實驗來研究 SSR 體系的建立或優(yōu)化。通過正交表將各個因素與水平進行組合形成不同的體系，既能快速找到最佳體系而且經(jīng)濟高效，省時省力[19-22]。同時還可以通過直觀分析或利用 SPSS 等軟件分析不同因素對體系的影響程度，也是目前建立 SSRPCR 反應(yīng)體系最常用的方法。

由于云南金花茶的瀕危，有關(guān)云南金花茶 SSR遺傳分析的研究鮮有報道。本實驗采用 L16（45）正交實驗對云南金花茶 SSR-PCR 體系進行建立和優(yōu)化，通過對SSR-PCR反應(yīng)體系中的模板DNA、Taq DNA聚合酶濃度、dNTP、Mg2+、引物和引物退火溫度進行了分析，從而獲得穩(wěn)定、可靠的云南金花茶 SSR-PCR 最佳反應(yīng)體系。方差分析結(jié)果顯示， 5個因素的不同水平間均存在顯著差異。一般來說，Mg2+對 Taq DNA 聚合酶具有激活作用，體系中 Mg2+濃度過低會降低酶的效率，濃度過高會造成 Taq DNA 聚合酶擴增出的特異性產(chǎn)物降低，所以選擇適宜的 Mg2+濃度是十分重要的。直觀分析結(jié)果與多重比較都表示 Mg2+在 1.5 μL 時擴增效果最好，所以本次實驗 Mg2+（25 mmol/L）用量為1.5 μL。引物濃度對 PCR 穩(wěn)定性也有很大的影響，引物濃度過低時得到的擴增條帶不清晰或較少，過高時容易引起錯配和非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)以及產(chǎn)生引物二聚體。本實驗得出的結(jié)論為引物對云南金花茶 SSR-PCR 反應(yīng)體系的影響程度僅次于Mg2+，這與湛欣等[23]的研究結(jié)果一致。雖然直觀分析表示引物用量在 0.6 μL時擴增效果最好，但多重比較結(jié)果說明0.4 μL是引物的最佳用量，且實驗過程中引物用量在 0.4 μL時擴增效果最為理想，因此引物（10 μmol/L）用量為 0.4 μL最適宜。Taq DNA 聚合酶對反應(yīng)體系的影響主要表現(xiàn)在濃度過高會產(chǎn)生非特異性條帶，濃度過低則不能很好的與產(chǎn)物結(jié)合使擴增條帶不清晰。為防止 Taq聚合酶濃度過低導(dǎo)致擴增產(chǎn)物效果較低，結(jié)合直觀分析確定 Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）用量在 0.2 μL 最適宜。dNTP 在 PCR 反應(yīng)過程中會與 Mg2+結(jié)合，從而降低Mg2+濃度進而減少 Taq DNA 聚合酶的催化劑影響最終擴增效果。直觀分析表示dNTP用量在0.3 μL時擴增效果最好，多重比較結(jié)果說明dNTP用量在0.1 μL和0.3 μL時均適用，綜合考慮，本實驗 dNTP（10 mmol/L）用量為 0.3 μL。DNA 在本次實驗中對反應(yīng)體系的影響程度最小，這與對川山茶Camellia japonicaL.[24]，二月蘭Orychophragmus violaceusL.[25]等植物的相關(guān)SSR 體系建立時的相關(guān)研究結(jié)論相一致。多重比較結(jié)果說明DNA的用量在0.5 μL和2.0 μL時試驗效果均佳，直觀分析表示 DNA的用量在0.5 μL時擴增效果最好，二者結(jié)合考慮，且從經(jīng)濟角度出發(fā)，DNA（50 ng/μL）用量選擇為 0.5 μL 最適宜。綜合分析得到的反應(yīng)體系與直觀分析中最佳反應(yīng)體系基本一致。試驗認為，云南金花茶 SSR-PCR 最佳反應(yīng)體系（20 μL）為：2.0 μL Taq Buffer、1.5 μL 的 Mg2+（25 mmol/L）、0.3 μL 的 dNTP（10 mmol/L）、0.2 μL 的 Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、前后引物各 0.4 μL（10 μmol/L）、0.5 μL 的模板 DNA（50 ng/μL）、14.7 μL 的 ddH2O。

吳帆等[26]在傳統(tǒng)的CTAB法及試劑盒法的基礎(chǔ)上，利用DNA提取緩沖液作為樣品預(yù)處理液，配合其他操作步驟的優(yōu)化，設(shè)計出針對櫻亞屬植物基因組DNA的新型提取方法。預(yù)實驗中3種提取DNA的方法均進行了加預(yù)處理液與未加預(yù)處理液的對照組實驗，實驗結(jié)果表明，改進后的SDS法、CTAB法及試劑盒法均能有效地去除樣品中含有的多糖、色素、黃酮等雜質(zhì)，其中，以試劑盒法提取的DNA純度和質(zhì)量均高于CTAB法和SDS法?？梢姡宇A(yù)處理液后的3種方法均能提高云南金花茶DNA的提取質(zhì)量，該法具有較高的通用性，可以嘗試用于其他物種DNA的提取工作中。

在實驗過程中不可避免地存在誤差，且通過直觀分析正交實驗結(jié)果存在一定的主觀成分。所以，本實驗還利用 SPSS 軟件進行方差分析和多重比較，方差分析與直觀分析各因素對云南金花茶SSR-PCR 體系建立的影響程度一致，多重比較與直觀分析中各因素最佳用量也基本一致，說明本次實驗結(jié)果是可靠的。