韓崢，黃曉東，劉蒙，朱慶曦，譚潔，劉維潔，陳巍，鄒艷麗，蔡一珊，黃莎莎，田霞

0 引言

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率呈迅速增長的趨勢[1-2]?；熓侵委熃Y(jié)腸癌的主要方法之一，5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil, 5-Fu）是用于治療結(jié)腸癌的常用化療藥物，但經(jīng)常會由于對藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療失敗[3]，嚴(yán)重制約了5-Fu的臨床療效，因此，解決該問題將有利于提高結(jié)腸癌的治療成功率。

那可?。∟oscapine, Nos）是一種從罌粟中分離出來的鄰苯二甲酸異喹啉生物堿，通常被作為止咳藥[4]。研究發(fā)現(xiàn)[5-6]Nos還是潛在的抗癌藥物，可以影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。本研究利用反復(fù)大劑量結(jié)合藥物濃度梯度法構(gòu)建對5-Fu耐藥的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu及SW480/5-Fu，用半數(shù)抑制濃度（50% Inhibitory concentration, IC50）的Nos干預(yù)結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、LoVo及SW480和耐藥細(xì)胞株HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu及SW480/5-Fu后，觀察檢測細(xì)胞生物學(xué)特性的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司；PBS、0.25%胰蛋白酶、PBST、MTT、DEPC處理水、兔抗p-glycoprotein、兔抗多藥耐藥相關(guān)蛋白（Multidrug resistanceassociated protein, MRP）、兔抗肺耐藥相關(guān)蛋白（Lung resistance-related protein, LRP）、兔抗P38、兔抗p-P38、兔抗GAPDH及HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒和CycleTESTTMPlus DNA Reagent Kit購自美國BD公司；TRIzol購自美國Ambion公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連TaKaRa公司；SYBR Green PCR試劑盒購自美國KAPA Biosystems公司；PVDF轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Millipore公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、TEMED購自美國Sigma公司。儀器耗材：CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；顯微鏡購自日本Nikon公司；流式細(xì)胞儀購自美國Beckman公司；熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；全自動化學(xué)發(fā)光分析儀購自上海天能。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建耐藥株 取對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、LoVo和SW480，培養(yǎng)于含10 μg/ml 5-Fu的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)細(xì)胞24 h。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡時(shí)，用PBS清洗3次后于不含5-Fu的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)。待細(xì)胞恢復(fù)正常生長后，加入濃度遞增的5-Fu反復(fù)處理細(xì)胞，每次增加10 μg/ml，直到細(xì)胞被最大5-Fu濃度（40 μg/ml）處理后存活至少4天則視為耐藥株構(gòu)建成功[7]。此次研究構(gòu)建耐藥株共歷時(shí)10月，獲得HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu和SW480/5-Fu耐藥細(xì)胞株。撤藥兩周后，對耐藥株進(jìn)行處理觀察生物學(xué)特征變化。

1.2.2 MTT法檢測藥敏性 將對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、LoVo及SW480和耐藥株HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu及SW480/5-Fu制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔約5×103個細(xì)胞。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入濃度為0、10、50、100和150 μmol/L的Nos，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出3復(fù)孔，各孔加入10 μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去上清液，加入150 μl二甲基亞砜溶解結(jié)晶物。最后使用酶標(biāo)儀測定各組細(xì)胞在490 nm處的吸光度（OD）值，并計(jì)算Nos對各組細(xì)胞的IC50。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為12組：HT-29 CON、LoVo CON和SW480 CON（親本株對照組）；HT-29 IC50、LoVo IC50和SW480 IC50（使用半數(shù)抑制濃度的Nos處理各親本株）；HT-29/5-Fu CON、LoVo/5-Fu CON和SW480/5-Fu CON（耐藥株對照組）；HT-29/5-Fu IC50、LoVo/5-Fu IC50和SW480/5-Fu IC50（使用半數(shù)抑制濃度的Nos處理各耐藥株）。

1.2.4 觀察細(xì)胞形態(tài)變化 顯微鏡下觀察人結(jié)腸癌親本株、耐藥株，以及經(jīng)過半數(shù)抑制濃度Nos干預(yù)的親本株和耐藥株的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5 流式檢測細(xì)胞周期 將經(jīng)過分組處理24 h后的各組細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，并離心收集。加入700 μl無水乙醇于-20℃冰箱中固定過夜。預(yù)冷PBS清洗后，加入100 μl RNase A（1 mg/ml）和400 μl 碘化丙啶（50μg/ml）溶液，避光染核10 min后，于流式細(xì)胞儀中檢測DNA含量。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將分組處理24 h后的對數(shù)生長期細(xì)胞取出，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，然后離心收集細(xì)胞。預(yù)冷PBS清洗后，將細(xì)胞重懸于200 μl結(jié)合緩沖液中，加入10μl Annexin V-FITC，避光孵育10 min，再加入10 μl碘化丙啶避光孵育30 min后進(jìn)行上機(jī)檢測。

1.2.7 RT-qPCR檢測P38及耐藥相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá) 經(jīng)過分組處理后，取生長狀況良好的細(xì)胞經(jīng)PBS清洗，用TRIzol提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行RT-qPCR，引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95℃變性5 s，56℃退火10 s，72℃延伸25 s，共39個循環(huán)。

1.2.8 Western blot檢測P38及耐藥相關(guān)蛋白表達(dá) 取生長狀況良好的細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞后加入裂解液，然后提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入稀釋后的一抗（兔抗p-glycoprotein：1:1000；兔抗MRP：1:1000；兔抗LRP：1:10000；兔抗P38：1:1000；兔抗p-P38：1:1000；兔抗GAPDH：1:5000），室溫孵育1 h。PBST清洗后加入二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG），室溫孵育1 h，再用PBS清洗，加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，讀取條帶灰度值。

表1 RT-qPCR引物序列Table1 Primers sequences of RT-qPCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測定藥物IC50

隨著Nos藥物濃度的升高，各組細(xì)胞的抑制率也隨著升高，且親本株HT-29 CON、LoVo CON和SW480 CON抑制率高于對應(yīng)耐藥株，見圖1。各組細(xì)胞的IC50分別為：HT-29 CON細(xì)胞115.434 μmol/L，HT-29/5-Fu細(xì)胞657.474 μmol/L，LoVo CON細(xì)胞163.878 μmol/L，LoVo/5-Fu細(xì)胞526.336 μmol/L，SW480 CON細(xì)胞143.231 μmol/L，SW480/5-Fu細(xì)胞1064.294 μmol/L。各組細(xì)胞的IC50將作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)Nos干預(yù)細(xì)胞的濃度。

2.2 Nos對耐藥細(xì)胞的形態(tài)影響

圖1 那可丁對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用Figure1 Inhibitory effect of noscapine on proliferation of colon cancer cells

觀察各組細(xì)胞形態(tài)，親本細(xì)胞對照組形態(tài)大多呈梭形，耐藥細(xì)胞對照組開始變圓鈍，Nos干預(yù)后的耐藥細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞體積變小，形態(tài)呈圓形，并出現(xiàn)漂浮態(tài)，分布松散，見圖2。

2.3 Nos對耐藥細(xì)胞周期及凋亡的影響

未經(jīng)Nos干預(yù)的5-Fu耐藥株G0/G1期細(xì)胞數(shù)量多于親本細(xì)胞。Nos對親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的干預(yù)，也使細(xì)胞周期發(fā)生了明顯的變化。經(jīng)Nos處理后的親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞分別與其相應(yīng)的對照組（CON）比較，IC50Nos處理后，處于G0/G1期的細(xì)胞數(shù)量顯著增多（P=0.000），S期數(shù)量減少，說明Nos干預(yù)使細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯現(xiàn)象。且5-Fu耐藥株和Nos的疊加作用，使得Nos干預(yù)后的耐藥株G0/G1期細(xì)胞比例明顯比親本株多（P=0.024,P=0.003, P=0.000），見圖3。對細(xì)胞凋亡比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)與CON相比，Nos處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率明顯升高，見圖4。

2.4 Nos對細(xì)胞P38表達(dá)的影響

圖2 那可丁對耐藥細(xì)胞形態(tài)的影響 (×200)Figure2 Effect of noscapine on morphology of drug-resistant cells (×200)

圖3 流式細(xì)胞儀檢測那可丁對耐藥細(xì)胞周期(A)及對細(xì)胞G0/G1期比例(B)的影響Figure3 Effect of noscapine on cell cycle(A) and G0/G1 phase proportion(B) of drug resistant cells detected by fl ow cytometry

圖4 流式細(xì)胞儀檢測那可丁對耐藥細(xì)胞凋亡的影響Figure4 Effect of noscapine on apoptosis of drug-resistant cells detected by fl ow cytometry

比較各組細(xì)胞的P38 mRNA及p-P38的蛋白相對表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，Nos干預(yù)過的細(xì)胞顯著低于對照組（P＜0.01）（實(shí)驗(yàn)具體數(shù)據(jù)請掃描OSID碼見附件）。IC50Nos處理的耐藥細(xì)胞株HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu和SW480/5-Fu P38及和p-P38的蛋白相對表達(dá)水平明顯高于IC50Nos處理的親本細(xì)胞株HT-29、LoVo及SW480（P＜0.05或P＜0.01），見圖5。說明耐藥細(xì)胞株的P38表達(dá)高于親本株，而Nos干預(yù)后會抑制P38的表達(dá)。

圖5 那可丁對P38 mRNA(A)和p-P38蛋白(B)表達(dá)的影響Figure5 Effect of noscapine on P38 mRNA(A) and p-P38 protein(B) expression

2.5 Nos對耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組細(xì)胞比較，IC50Nos干預(yù)后細(xì)胞的MRP、LRP及p-glycoprotein的mRNA和蛋白相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）（實(shí)驗(yàn)具體數(shù)據(jù)請掃描OSID碼見附件）。與IC50Nos干預(yù)后HT-29、LoVo及SW480相比，IC50Nos干預(yù)后的HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu和SW480/5-Fu的MRP、LRP及p-glycoprotein的mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖6。結(jié)果提示耐藥株的耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)升高，而Nos干預(yù)后對耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)具有一定抑制作用。

3 討論

絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases, MAPKs）在細(xì)胞表面到細(xì)胞核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用，參與了細(xì)胞增殖、存活及凋亡的調(diào)節(jié)[8]。MAPK由P38 MAPK、c-jun氨基末端激酶（c-jun amino-terminal kinase, JNK）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（Extracellular regulated kinase,ERK）組成，并通過磷酸化的形式發(fā)揮作用[9-10]。在多種腫瘤患者中都發(fā)現(xiàn)P38 MAPK水平的失調(diào)，Koul等[11]對P38在腫瘤生物學(xué)中的影響進(jìn)行分析，提示P38在細(xì)胞存活、分化/無分化、周期點(diǎn)控制、凋亡及耐藥等方面都起著關(guān)鍵的作用，發(fā)揮什么樣的作用取決于激活P38的類型和腫瘤細(xì)胞的特異性。研究發(fā)現(xiàn)，P38參與了結(jié)腸癌細(xì)胞對5-Fu的耐藥，P38 MAPK信號通路抑制后可提高結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29對藥物的敏感度，降低相關(guān)耐藥性因子的表達(dá)水平[12]。本研究發(fā)現(xiàn)Nos顯著抑制了耐藥細(xì)胞株HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu和SW480/5-Fu的P38的表達(dá)和磷酸化。

圖6 那可丁對MRP、LRP及p-glycoprotein mRNA(A)及蛋白表達(dá)(B)的影響Figure6 Effect of noscapine on mRNA(A) and protein(B) expressions of MRP, LRP and p-glycoprotein

MRP可以將能量依賴性的藥物排出體外，從而降低藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，使化療藥物對腫瘤細(xì)胞的作用降低[13]。相關(guān)文獻(xiàn)[14]結(jié)果顯示多藥耐藥蛋白1（MDR1/P-glycoprotein/ABCB1）及多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1/ABCC1）表達(dá)上調(diào)會抑制藥物對癌細(xì)胞的毒性作用。LRP的耐藥機(jī)制可能是阻止藥物進(jìn)入細(xì)胞核，并能將藥物排出細(xì)胞外，而且LRP與MRP同在一條染色體上，且位置相近，兩者的表達(dá)可能具有相關(guān)性[15]。于是，本研究進(jìn)一步檢測MRP、LRP及p-glycoprotein在各組細(xì)胞中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)這些與耐藥相關(guān)的蛋白在Nos處理組顯著受到抑制，說明IC50Nos降低了HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu和SW480/5-Fu的耐藥性。前期研究[4]發(fā)現(xiàn)Nos使人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、LoVo和SW480阻滯于G0/G1期，本研究周期檢測結(jié)果與文獻(xiàn)一致，Nos干預(yù)后，耐藥細(xì)胞株HT-29/5-Fu、LoVo/5-Fu和SW480/5-Fu發(fā)生G0/G1期阻滯現(xiàn)象，耐藥細(xì)胞的DNA復(fù)制周期比親本細(xì)胞長，且細(xì)胞凋亡率增加，說明Nos不僅作用于人結(jié)腸癌親本細(xì)胞，對耐5-Fu的結(jié)腸癌細(xì)胞也具有一定的毒性作用。

綜上所述，Nos促進(jìn)了5-Fu耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯及凋亡，降低了耐藥細(xì)胞的耐藥性，可能是通過抑制P38的表達(dá)和磷酸化而發(fā)揮作用，具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。