路欣，孔令玉，賈蕾，姜玲玲

0 引言

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）具有發(fā)病率高、預(yù)后較差等特點[1]。研究發(fā)現(xiàn)，信號轉(zhuǎn)錄因子3（STAT3）是介導(dǎo)HCC發(fā)生的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄子，在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用[2]。D-雙功能蛋白（D-bifunctional protein, DBP）是大多數(shù)哺乳動物體內(nèi)的一種重要氧化還原酶，又稱17β-雌二醇脫氫酶Ⅳ[3]。DBP酶大量存在于哺乳動物各種組織細(xì)胞的過氧化物酶體內(nèi)，而其在肝臟比其他組織表達(dá)高[4]。最新報道顯示DBP在前列腺癌、乳腺癌等其他組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平也明顯增加[5]。本課題組前期細(xì)胞實驗結(jié)果也證實了DBP在肝癌細(xì)胞系HepG2中的表達(dá)水平明顯升高，而且DBP的表達(dá)增高對肝癌細(xì)胞的增殖起到了促進(jìn)作用[6]。本研究進(jìn)一步探討DBP在肝癌大鼠體內(nèi)的表達(dá)及其作用機制，以期為肝細(xì)胞癌功能監(jiān)測和阻止肝癌的形成和發(fā)展提供新的基因靶點。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究雄性SD大鼠來源于河北省實驗動物中心（許可證編號：SCXK（冀）2013-1-003），實驗大鼠體重質(zhì)量均在200～220 g左右；研究用的大鼠均達(dá)到實驗動物相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，飼養(yǎng)條件為（27±1）℃、濕度（70±4）%。每天自然光照，正常飲食喂養(yǎng)。人肝癌細(xì)胞株HepG2來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所。

1.2 實驗材料

實驗用DEN（美國Sigma公司）；全自動生化分析儀（AU5821系列，美國貝克曼公司）；實驗室Odyssey雙色的紅外熒光掃描系統(tǒng)（美國GENE公司）；兔抗大鼠DBP（sc-365167）、β-actin（sc-47778）、STAT3（sc-482）、p-STAT3（sc-135649）、Akt（sc-8312）、p-Akt（sc-7985）、MEK（sc-9259）、p-MEK（sc-101733）、ERK（sc-292838）和 p-ERK（sc-23759）；兔抗人cyclin D1（2922S）、PCNA（13110），單克隆抗體購于美國Santa公司；山羊抗兔的二抗SP免疫組織化學(xué)試劑盒（SP-9000）以及DAB顯色液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；大鼠總RNA的提取、cDNA的合成以及反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）擴增試劑盒（美國Invitrogen公司）；DBP質(zhì)粒（本實驗室保存）；小干擾RNA（siRNA），siDBP引物：上游：5′-GUACCUUUGUAUUUGAGGAdTdT-3′，下游：5′-UCCUCAAAUACAAAGGUACdTdT-3′，siNC引物：上游：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′（上海生物工程技術(shù)公司）；Lipofectamine 2000TM轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司）；BrdU試劑盒（德國Merck公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠的造模構(gòu)建 雄性SD大鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為2組，正常對照組（NC組）8只、肝癌模型組（HCC組）14只，肝癌模型組給予腹腔注射造模，劑量為DEN 70毫克/千克，同時正常對照組用同等劑量的0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行腹腔注射。1次/周，接連10周注射，繼續(xù)喂養(yǎng)10周，第20周時將大鼠麻醉后心臟穿刺放血處死，立即手術(shù)，取出肝臟，0.9%氯化鈉溶液沖洗，取一部分肝組織浸泡于10%福爾馬林溶液，用于形態(tài)學(xué)實驗；余下的組織迅速放入液氮中，-80℃冰箱保存。模型成功率為100%。

1.3.2 組織病理學(xué)觀察 提取模型組及正常對照組肝組織，4%的多聚甲醛進(jìn)行組織固定，石蠟包埋，切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色和免疫組織化學(xué)法進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察和分析肝臟組織的病理和形態(tài)。

1.3.3 大鼠的肝功能等生化指標(biāo)檢測 大鼠處死前采集血清樣本約200 μl，離心后置生化檢測儀上進(jìn)行各項指標(biāo)的檢測。

1.3.4 Western blot分析 實驗大鼠肝臟組織經(jīng)過蛋白提取、蛋白定量后勻漿稀釋成5 μg/μl濃度的懸液，加5×上樣緩沖液95℃煮沸5 min。制作SDS-PAGE，蛋白上樣，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，分別加兔抗大鼠DBP、STAT3、p-STAT3、Akt、p-Akt、MEK、p-MEK、ERK和p-ERK抗體（1:500）及兔抗大鼠β-actin抗體（1:1 000），4℃冰箱過夜溫育，TPBS洗膜，熒光二抗進(jìn)行室溫靜置孵育1 h（1:5 000），TBST洗膜2次，每次約10 min，最后Odyssey發(fā)光儀進(jìn)行掃描。上述每組實驗至少重復(fù)3次，將孵育后的膜用發(fā)光成像儀掃描后形成照片，然后IAMGE J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3.5 免疫組織化學(xué)分析 石蠟切片后經(jīng)過常規(guī)脫蠟復(fù)水及抗原修復(fù)，山羊血清封閉，DBP一抗處理后放于保濕盒4℃孵育過夜。室溫滴加山羊抗兔二抗孵育20 min，PBS沖洗玻片，然后加入鏈霉親和素孵育20 min，PBS再次沖洗玻片，DAB顯色，蘇木精對比染色，結(jié)果中的陽性細(xì)胞顯色應(yīng)為棕色或棕黃色，陽性顆粒應(yīng)定位在細(xì)胞的胞核及胞質(zhì)區(qū)域。在奧林巴斯正置顯微鏡下進(jìn)行觀察和圖像采集。利用Image-Pro Plus 6.0（IPP 6.0）軟件對圖片的積分光密度值（IOD）進(jìn)行檢測和分析。

1.3.6 qRT-PCR檢測 提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，目的片段擴增。擴增引物設(shè)計如下：18SrRNA引物：上游：5’-ATCCCTGAAAAGTTCCAGCA-3；下游：5’-CCCTCTTGGTGAGGTCAATG-3’，DBP引物：上游：5’-TTGGGCCGAGCCTATGC-3’；下游：5’-CCCCTCCCAAATCATTCACA-3’，cyclin D1引物：上游：5’-GGAGCAGAAGTGCGAAGA -3’；下游：5’-GGGTGGGTTGGAAATGAA-3’，PCNA引物：上游：5’- ACAGAGCATGGATTCGTCTCAC-3’；下游：5’-AGAAAACTTCACCCCGTCCTTT-3’。

1.3.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞以5×106個每毫升的密度接種在96孔板中，放置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，待到細(xì)胞生長到融合度70%左右時進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。首先按照轉(zhuǎn)染試劑的說明將空載體質(zhì)粒（Empty）、過表達(dá)質(zhì)粒（DBP）、對照小干擾RNA（siNC）、目的小干擾RNA（siDBP）分別溶于雙無（無血清無抗生素）RPMI1640培養(yǎng)液中，混勻。將Lipofectamine 2000TM溶于雙無RPMI1640培養(yǎng)液中，混勻，室溫中靜置5 min。將轉(zhuǎn)染試劑分別與脂質(zhì)體混勻，室溫靜置20 min。棄培養(yǎng)基，用新鮮雙無RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，將各組脂質(zhì)體和質(zhì)?；旌弦旱稳敫骺准?xì)胞中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h之后棄培養(yǎng)基，更換含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實驗操作。

1.3.8 BrdU摻入實驗 按照BrdU試劑盒說明書進(jìn)行操作。將孔板中的培養(yǎng)基去除，加入BrdU試劑孵育20 h。每孔加入固定液200 μl，固定30 min；每孔加入1:50稀釋的緩沖液200 μl，洗三次；BrdU抗體100 μl每孔，室溫孵育1 h；1:50稀釋的緩沖液200 μl每孔，洗三次；每孔加入1:2 000稀釋的過氧化物酶偶聯(lián)羊抗小鼠二抗100 μl，室溫孵育30 min；1:50稀釋的緩沖液200 μl，洗三次, 蒸餾水200 μl，洗一次；100 μl TMB標(biāo)記的過氧化物酶底物室溫避光孵育30 min；每孔加入100 μl終止液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀在450 nm處讀取吸光度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行匯總分析。其中計量的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示, 統(tǒng)計方法應(yīng)用t檢驗。檢測指標(biāo)的統(tǒng)計相關(guān)性采用Pearson分析方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC大鼠肝臟組織病理形態(tài)及生化指標(biāo)變化

大鼠肝臟組織照片可見，HCC組肝臟有嚴(yán)重的多發(fā)結(jié)節(jié)和肝硬化，見圖1A。通過HE方法染色，顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)，NC組肝細(xì)胞無異常，胞核核仁明顯，核膜清楚，細(xì)胞沒有炎性浸潤，然而肝癌組的出現(xiàn)了細(xì)胞變性、壞死，并且可見肝細(xì)胞惡性改變，癌細(xì)胞呈現(xiàn)顯著異型性，形態(tài)表現(xiàn)多角型，胞核增大且染色較深，見圖1B，分化程度3級。

HCC組與NC組比較，血清的總膽紅素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶、堿性磷酸酶、膽堿酯酶還有總膽汁酸都顯著升高，證明HCC組大鼠肝臟功能呈惡化趨勢，見表1。

2.2 HCC組大鼠肝臟組織中DBP水平上升

HCC組大鼠肝組織中DBP的蛋白和mRNA表達(dá)量都顯著高于NC組，見圖2A～B。免疫組織化學(xué)檢測顯示，NC組內(nèi)偶見DBP強陽性的細(xì)胞，HCC組陽性細(xì)胞數(shù)及單細(xì)胞染色強度均較NC組增高，見圖2C。以上結(jié)果表明，DBP在大鼠肝癌組織中表達(dá)增加。

圖1 大鼠肝臟組織形體(A)及病理學(xué)圖片(B ×200)Figure1 Pictures of rat liver tissues(A) and HE staining results(B ×200)

2.3 肝癌細(xì)胞增殖基因與DBP的表達(dá)呈線性正相關(guān)

qRT-PCR結(jié)果顯示，肝癌組PCNA、Cyclin D1 mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常對照組，見圖3A～B。Pearson相關(guān)性分析檢驗結(jié)果顯示，DBP與PCNA mRNA（r2=0.4925, P＜0.01）、cyclin D1 mRNA（r2=0.4053, P＜0.01）的表達(dá)量呈正相關(guān)，見圖3C～D。說明HCC組大鼠肝臟組織中的DBP表達(dá)水平升高很可能與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)。

2.4 DBP促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和增殖基因的表達(dá)

實驗結(jié)果顯示DBP過表達(dá)能增加細(xì)胞的數(shù)量，cyclin D1和PCNA的蛋白表達(dá)增強，見圖4A、4C。相反，通過siRNA敲低了DBP的表達(dá)，細(xì)胞數(shù)量則顯著降低，cyclin D1和PCNA的蛋白表達(dá)減弱，見圖4B、4D。結(jié)果表明，DBP過表達(dá)能夠直接促進(jìn)HepG2細(xì)胞的增殖。

2.5 DBP過表達(dá)促進(jìn)STAT3的激活，二者呈線性正相關(guān)

Western blot結(jié)果顯示，HCC組大鼠肝臟組織STAT3磷酸化顯著增加，見圖5A，表明DBP對STAT3激活有促進(jìn)作用。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，HCC組大鼠肝臟組織中的p-STAT3和DBP的蛋白表達(dá)水平明顯增加，見圖5B。Pearson相關(guān)性分析表明，在HCC組大鼠肝組織中，p-STAT3與DBP的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r2=0.6359, P＜0.01）。說明大鼠肝癌組織中DBP過表達(dá)促進(jìn)STAT3的活化，進(jìn)一步引起肝癌細(xì)胞增殖基因的上調(diào)，從而加劇了肝癌的發(fā)展進(jìn)程。

圖3 HCC大鼠肝臟組織中增殖相關(guān)基因表達(dá)與DBP表達(dá)呈正相關(guān)Figure3 DBP expression was positively correlated with expression of cyclin D1 and PCNA mRNA in HCC rats liver tissues

圖4 DBP促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和增殖基因的表達(dá)Figure4 DBP promoted proliferation of hepatoma cells and expression of proliferation genes detected by BrdU incorporation and Western blot

圖5 Western blot(A)和IHC(B)法檢測DBP表達(dá)增加STAT3活性Figure5 DBP expression increased STAT3 activity detected by Western blot(A) and IHC(B)

2.6 HCC大鼠通過激活A(yù)kt和ERK信號通路促進(jìn)STAT3的活化

Western blot結(jié)果顯示，肝癌組大鼠肝臟標(biāo)本Akt、MEK以及ERK的磷酸化水平較NC組顯著增強，見圖6，證明DBP通過Akt和ERK信號通路促進(jìn)STAT3的激活，進(jìn)一步增強肝癌細(xì)胞的增殖，從而加劇肝癌的進(jìn)程。

3 討論

目前，生物治療HCC的新模式受到了更多的關(guān)注，其中基因治療和靶向治療已經(jīng)得到了一定的臨床肯定[7]，因此對于肝癌的基礎(chǔ)性研究顯得尤為重要。DEN作為一種肝毒性很強的化學(xué)劑，對于肝臟的損害導(dǎo)致腫瘤的過程分為炎性反應(yīng)形成期、細(xì)胞增殖期、細(xì)胞硬化期和腫瘤形成期，這和人體肝癌的形成、發(fā)展以及惡化的過程幾乎是一樣的，因此DEN誘導(dǎo)和干預(yù)動物模型經(jīng)常用來做肝細(xì)胞癌的有關(guān)實驗研究[8]。在本研究中，肝臟標(biāo)本組織的病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果證明，DEN成功地誘導(dǎo)出了大鼠肝癌的組織模型，而且癌癥惡化程度十分明顯。

圖6 HCC大鼠通過激活A(yù)kt和ERK信號通路促進(jìn)STAT3的活化Figure6 STAT3 activation was promoted by activating Akt and ERK signaling pathways in HCC rats

DBP是組織細(xì)胞的過氧化物酶體細(xì)胞器極其重要的一種氧化還原酶。正常生理條件下，DBP在哺乳動物的肝臟、心臟、腦、前列腺等組織表達(dá)較高[4-5]。有報道顯示DBP是過氧化物酶體脂肪酸β氧化途徑中的一種重要的酶蛋白，參與脂肪酸的氧化分解及DHA的生物合成等過程，并與雌激素的代謝有關(guān)[9]。近年來，在除肝癌以外的其他腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中也發(fā)現(xiàn)DBP異常升高[10]，說明在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中DBP的表達(dá)水平可能發(fā)揮著重要作用。我們前期的研究結(jié)果已經(jīng)證實，在肝癌細(xì)胞系HepG2中，DBP作為受核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB調(diào)控的靶基因，與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)有密切關(guān)系和作用[6]。本實驗首次以大鼠HCC模型探討了DBP在正常和肝癌組織的表達(dá)差異，以及DBP表達(dá)與促腫瘤增殖的正相關(guān)性，在整體水平上證明了DBP在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中起到了至關(guān)重要的作用。

本實驗檢測了STAT3這種促肝臟腫瘤形成的核轉(zhuǎn)錄因子，通過介導(dǎo)細(xì)胞功能而促進(jìn)HCC的發(fā)展。STAT3作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，被磷酸化激活后發(fā)生核轉(zhuǎn)位，以二聚體的形式結(jié)合在特異性增強子核苷酸序列上，作為一種轉(zhuǎn)錄因子以發(fā)揮促進(jìn)靶基因表達(dá)的作用。這些下游靶基因中有許多與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。STAT3通過上調(diào)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。最近關(guān)于STAT3促進(jìn)肝癌發(fā)展的研究也進(jìn)一步證明了STAT3信號通路激活在腫瘤發(fā)病機制中的重要作用[11-12]。

然而，DBP又是如何上調(diào)了PCNA和cyclinD1等促腫瘤細(xì)胞增殖基因的表達(dá)呢？STAT3在肝癌細(xì)胞中被激活的程度較高，而且許多信號通路都參與了STAT3的活化。信號通路MEK/ERK和Akt的激活涉及肝癌細(xì)胞的增殖，它們的活化都可以促進(jìn)STAT3的激活，從而引起促增殖基因的表達(dá)增加[9-11]。研究證實MEK/ERK/STAT3和AKT/STAT3在促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮了重要作用。PCNA和cyclinD1是此信號通路下游促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的重要基因。我們的前期研究結(jié)果在細(xì)胞中表明DBP的上調(diào)介導(dǎo)了AKT和MEK/ERK信號通路的活化，進(jìn)而促進(jìn)了STAT3的激活，二者存在相關(guān)性[6]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)DBP同樣能夠促進(jìn)STAT3的活化，同時也表明STAT3高表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[13-14]。因此，我們推測在HCC形成及惡化的過程中，DBP通過介導(dǎo)STAT3的活化促進(jìn)其下游眾多涉及腫瘤細(xì)胞增殖的靶基因表達(dá)增加，從而發(fā)揮促進(jìn)HCC的功能。

本實驗通過構(gòu)建大鼠HCC模型，在整體水平上研究了DBP通過介導(dǎo)AKT和MEK/ERK信號通路促進(jìn)了STAT3的激活，進(jìn)一步增強了促增殖基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展，為DBP作為HCC診斷和治療的新靶點提供了理論基礎(chǔ)。