歐陽月紅 周乾云 許諾

【摘 要】：無乳鏈球菌（GBS）是一種引起人畜共患病的病原菌，具有跨物種感染的潛在能力，可以在新生兒、孕婦、免疫力低下者及牛、狗、嚙齒動物、魚類等宿主體內(nèi)適應(yīng)生存，并引發(fā)相關(guān)疾病。目前，在西歐、亞洲、非洲、南美洲各國中已有發(fā)現(xiàn)大量人和動物被無乳鏈球菌感染的病例。疫苗是一種預(yù)防傳染病的有效手段，但目前仍未有人用或畜用的GBS疫苗上市。本文就GBS對人類與動物的危害、GBS防治策略和人用及獸用無乳鏈球菌疫苗研發(fā)最新進展進行總結(jié)，為國內(nèi)無乳鏈球菌病的防治工作及無乳鏈球菌疫苗的研發(fā)提供參考。

【關(guān)鍵詞】：無乳鏈球菌;人畜共患菌;疫苗

【中圖分類號】R843【文獻標(biāo)識碼】A【文章編號】1672-3783（2019）09-03--01

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性雙球菌，又名B群鏈球菌（Lancefield group B streptococcus，GBS），最早在患乳腺炎的奶牛身上分離出來[1]。本文就人類所發(fā)現(xiàn)GBS對人畜的危害、GBS防治策略和GBS疫苗研制的最新進展進行討論和探討，希望能拋磚引玉借此引起相關(guān)研究人員以及政府有關(guān)部門對無乳鏈球菌病這一人畜共患疾病的重視，積極參與并推動對人用及畜用無乳鏈球菌疫苗研發(fā)工作，盡快實現(xiàn)無乳鏈球菌疫苗研制工作的突破。

1 無乳鏈球菌的概況

無乳鏈球菌，屬于硬壁菌門（Firmicutes）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、乳桿菌目（Lactobacillales）、鏈球菌科（Streptococcaceae）、鏈球菌屬（Streptococcus sp），被歸為B群鏈球菌，且是唯一擁有B群特異性抗原的鏈球菌。GBS最早由Nocard和Mollereau于1887年在牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[2]，后來，Lancefield和 Hare于1935年在產(chǎn)婦的陰道拭子中發(fā)現(xiàn)了GBS，1938年，F(xiàn)ILE描述了產(chǎn)后婦女的三例死亡病例。

無乳鏈球菌是一種在自然界廣泛存在的兼性厭氧革蘭氏陽性細菌。利用光學(xué)顯微鏡進行觀察，可發(fā)現(xiàn)單個無乳鏈球菌呈現(xiàn)為直徑在0.6～1.0μm的球形或卵圓形，呈現(xiàn)雙球狀或鏈狀。在培養(yǎng)時，大多數(shù)無乳鏈球菌在36～37℃和pH 7.4～7.6的條件下生長最佳。無乳鏈球菌的培養(yǎng)需要血清瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）等類的高營養(yǎng)培養(yǎng)基。在溶血性方面，大部分無乳鏈球菌呈現(xiàn)β-溶血，α或γ-溶血則是小部分。

2 無乳鏈球菌對人類及動物的危害

GBS是一種人畜共患病病原菌，可以在新生兒、孕婦、體質(zhì)弱者如老年人和艾滋病患者及牛、狗、嚙齒動物、魚類等宿主體內(nèi)適應(yīng)生存，并引發(fā)相關(guān)疾病。世界衛(wèi)生組織于2014年召開的疫苗產(chǎn)品開發(fā)咨詢委員會（Vaccine Product Development Advisory Committee，PDVAC）第一次會議上，將GBS確定為導(dǎo)致全世界疾病負(fù)擔(dān)沉重的重要病原體，并被確定為研制疫苗的高度優(yōu)先選項。

3 無乳鏈球菌病的主要防治措施

目前針對GBS，人們可以采取抗生素、中草藥及疫苗三方面的防治舉措，其中，抗生素防治GBS感染是實際所采用的，但后兩項舉措則還處于試驗研究階段。

抗生素防治GBS，主要采用青霉素、紅霉素和克林霉素等，此法無論在人群中或是動物群體中都是防治GBS感染的主要措施。在國外，產(chǎn)前抗生素策略是現(xiàn)今通用預(yù)防GBS的策略，但此策略只能降低早發(fā)新生兒GBS的發(fā)生率，但對晚發(fā)GBS感染無影響，對孕婦疾病的影響有限[1]。然而，抗生素的大量與長期使用將會導(dǎo)致藥物殘留、引起機體內(nèi)正常菌群的紊亂及產(chǎn)生耐藥菌等危害，所以此方法非長久之計。近年來，研究表明，人類體液及動物組織中的GBS抗生素的耐藥性呈上升趨勢[3]。中草藥中的有效抑菌成分對GBS具有一定的防治效果，研究發(fā)現(xiàn)，將從迷迭香、穿心蓮、博落回、紫草、田基黃、田七須和五倍子等中草藥的有效成分添加至飼料中投喂羅非魚，這可以提高羅非魚在GBS攻毒實驗中的存活率[4]。

與抗生素相比，中草藥具有價格低廉，毒副作用少，不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)勢，但其免疫防治效果明顯小于抗生素與疫苗，尤其在面對一些強毒性及侵襲性病菌的感染時根本無法有效地發(fā)揮預(yù)防作用。與抗生素和中草藥相比，采用疫苗防治GBS雖然在成本較高，但卻具有特異性，可有效防御強毒性侵襲性病菌，且不產(chǎn)生耐藥性，故采用疫苗防治GBS才是可持續(xù)發(fā)展的良策。

4 無乳鏈球菌疫苗

目前研制的GBS疫苗都屬于預(yù)防性疫苗，治療性GBS疫苗尚未被研制出來。不同類型的疫苗，其研制的依據(jù)存在差異。GBS滅活疫苗、GBS弱毒疫苗、GBS多糖-蛋白結(jié)合疫苗和GBS菌蛻疫苗是基于GBS的血清型研制的;而GBS DNA疫苗和GBS基因工程重組亞單位疫苗的研制則分別依據(jù)GBS所具有的毒力基因及毒力基因所表達的蛋白。

疫苗免疫效果的檢測是疫苗研制及評價工作中的關(guān)鍵。目前，GBS疫苗的免疫效果的檢測主要通過檢測IgM、白細胞分化抗原CD4和CD8、白介素IL-1、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子TNF-α、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB等免疫相關(guān)基因的表達水平[5]，血清抗體效價[6]，白細胞吞噬能力及相關(guān)酶活力（溶菌酶與超氧化物歧化酶）等[7]，或計算相對保護率。

免疫途徑對于疫苗免疫效果的實現(xiàn)具有極大的影響。注射、口服及浸泡是GBS疫苗所常用的三種免疫途徑，其誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)的能力大?。鹤⑸?口服>浸泡。其中，注射具有疫苗用量較少、能引起較大的免疫原性等優(yōu)點，但存在技術(shù)要求較高、損傷宿主機體等缺點，適用于人類、牛、犬等體型較大的易感宿主，口服與浸泡則適用于魚類及蛙類等體型較小的易感宿主。因此，研制口服型疫苗目前是水產(chǎn)業(yè)使用疫苗的熱點之一?；趧游锬c道黏膜免疫系統(tǒng)的深入研究，人們已找到方法去應(yīng)對口服蛋白類疫苗時因抗原蛋白結(jié)構(gòu)被破壞而失效的困境，即采取微球或微膠囊包埋、乳酸菌活載體表達及運載等方式對免疫原蛋白進行保護，結(jié)果表明，這些方法在一定程度上都有效保護了抗原蛋白的結(jié)構(gòu)并使其發(fā)揮免疫作用[8]。

4.1 滅活疫苗

滅活疫苗，也稱死疫苗，具有制作簡便、免疫原性易受滅活操作破壞的特點。近年來，GBS滅活疫苗的生產(chǎn)多采用福爾馬林法滅活病原微生物，通常以注射或口服的方式進行免疫[9]。在某奶牛場全群泌乳牛的奶樣，檢測確定奶樣中的主要致病菌為無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌后，制備得無乳鏈球菌乳房炎疫苗，該疫苗對無乳鏈球菌乳房炎具有一定的預(yù)防及治療作用。

4.2 減毒疫苗

減毒疫苗，也稱弱毒疫苗、減毒活疫苗，通常通過體外連續(xù)傳代，具有良好的免疫原性。GBS減毒疫苗目前采用注射和口服進行接種。2015年，李莉萍等[10]通過體外連續(xù)傳代從前期篩選出來具有良好免疫原性疫苗候選菌株HN01中獲得弱毒株YM001，高劑量攻毒實驗表明其對羅非魚具有保護作用。

但因減毒疫苗存在返祖、口服時損傷腸道等缺點，針對口服減毒疫苗引起的腸道損傷，可以通過在飼料中添加黃芪多糖、低聚木糖、木聚糖酶等飼料添加劑，這一類飼料添加劑具有有助于腸道黏膜進行修復(fù)的功能。

4.3 新型疫苗

4.3.1 基因工程重組亞單位疫苗

亞單位疫苗，又稱組分疫苗，可以通過兩種途徑獲取，一是通過化學(xué)分解或有控性的蛋白質(zhì)水解方法提取病原微生物的目的蛋白;二是利用基因工程技術(shù)（DNA重組）來選擇表達目的蛋白，由此目的蛋白制成的疫苗稱為基因工程亞單位疫苗（subunit vaccine），又稱生物合成亞單位疫苗或重組亞單位疫苗，這是目前生產(chǎn)藥用蛋白的熱門方式，按所用表達宿主的類型主要分為真核表達和原核表達。目前，SIP作為GBS表面蛋白的一種，且在各血清型GBS菌株中具有高度的保守性，因此被作為候選疫苗熱門靶點。實驗室獲取SIP蛋白的手段主要是采用原核表達，其中大腸桿菌（DE3）是表達SIP蛋白的常用菌株[11]。

4.3.2 多糖蛋白結(jié)合疫苗

多糖結(jié)合疫苗是以是以病原菌莢膜多糖為抗原成分，以具有T細胞依賴性的蛋白質(zhì)抗原為載體，將兩者通過化學(xué)方法結(jié)合而成的疫苗。因為多糖結(jié)合疫苗具有成分均一，安全性較高，對全年齡段的人群都具有較好的免疫原性，且能夠發(fā)揮長期持久的保護力，多地接種統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明接種多糖結(jié)合疫苗在預(yù)防肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌所導(dǎo)致的疾病方面效果顯著。

因此，多糖結(jié)合疫苗是人用疫苗研發(fā)的熱點。目前，已進入臨床試驗的人用GBS疫苗基本上都是為多糖蛋白結(jié)合疫苗。2016年， Madihi等研究表明一種產(chǎn)婦CRM197-三價B群鏈球菌疫苗（血清型Ia、Ib和III）在非孕婦和孕婦中具有良好的耐受性，并可誘導(dǎo)囊膜特異性c抗體反應(yīng)。同年，有報道稱三價糖結(jié)合GBS疫苗在感染艾滋病毒孕婦中的免疫原性低于未感染的孕婦。

4.3.3 DNA疫苗

基因免疫或核酸免疫，是指將含有編碼特定抗原蛋白的基因序列克隆至合適的質(zhì)粒載體上，制備成核酸表達載體，通過肌肉注射等方式將其導(dǎo)入機體內(nèi)，通過宿主的表達系統(tǒng)合成抗原蛋白，從而激發(fā)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異免疫應(yīng)答反應(yīng)?；蛎庖哌^程中所使用的重組DNA表達質(zhì)粒就是DNA疫苗。

4.3.4 菌蛻疫苗

細菌菌蛻（BGs）是通過PhiX 174裂解基因E在革蘭氏陰性菌中表達出跨膜孔道蛋白，在其組裝至細胞膜上后，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物經(jīng)該孔道喪失而產(chǎn)生的包膜結(jié)構(gòu)。因其保留了完整的包膜抗原，且無生命，所以成為一種新型的候選疫苗及遞送系統(tǒng)，具有兼顧組合抗原免疫原性、佐劑效應(yīng)、靶向性載體的作用，同時具有加工容易，易大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢[12]。

4.4 不同類型疫苗利弊分析

在免疫原性方面，相較于其他疫苗，弱毒疫苗與菌蛻疫苗都因能比較完整地保存病原菌細胞膜結(jié)構(gòu)而具有顯著的優(yōu)勢，而基因工程亞單位疫苗的免疫原性明顯較差，但可以通過與其他GBS蛋白融合表達、利用乳酸菌作為活載體表達GBS表面蛋白、添加佐劑等方法提高其免疫原性。在免疫應(yīng)答的激發(fā)與持久性方面，弱毒疫苗與DNA疫苗在免疫動物或人類后，能在其體內(nèi)進行自我增殖與擴散，因而較其他疫苗在受免疫動物體內(nèi)所激發(fā)的免疫應(yīng)答更具有持久性。此外，弱毒疫苗還具有能激發(fā)細胞免疫的特點，因此適用于開發(fā)口服型與浸泡型弱毒疫苗，造福于受GBS等病原菌侵襲而受重創(chuàng)的養(yǎng)殖漁業(yè)。

在安全性方面，弱毒疫苗存在返毒的風(fēng)險，菌蛻疫苗則存在失活徹底存在活性病原菌的風(fēng)險，而基因工程亞單位疫苗和多糖結(jié)合疫苗因其成分較為均一不含核酸，在免疫動物或人類后，不會產(chǎn)生持續(xù)感染，因此較其他疫苗具有較高的安全性?；蚬こ虂唵挝灰呙邕€具有可規(guī)?；瘮U大生產(chǎn)、可簡便生產(chǎn)多價疫苗、產(chǎn)生的免疫應(yīng)答能與野毒感染相區(qū)分等優(yōu)勢，既可以作為獸用疫苗，也適用于研發(fā)人用疫苗。

5 展望

疫苗是預(yù)防侵襲性傳染疾病的有效手段。最近，國家農(nóng)業(yè)部農(nóng)牧便函[2019]236號文件提出“為了維護動物源食品安全和公共衛(wèi)生安全，2020年我國將全面禁止抗生素被用于飼料添加劑”的計劃，加快疫苗的研制與投入使用將有利于這項計劃的落實。

鑒于GBS具有跨物種傳播的風(fēng)險，世界各地防疫站及醫(yī)院等機構(gòu)加強對GBS感染及耐藥性的實時監(jiān)測與報道，這將有利于GBS疫苗研制工作的跟進。另外為了通過普及GBS感染及防治的知識，以提高GBS疫苗接種率來有效預(yù)防GBS感染，這需要借助政府機構(gòu)或相關(guān)社會機構(gòu)如GBSA （Group B Strep Association US/International） 和 GBSS （Group B Strep Support – UK/EU） [6]。我國目前暫無這樣的宣傳機構(gòu)，建議政府或GBS相關(guān)研究機構(gòu)能夠積極組建。

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