靳志飛 吳明華

摘要：溫度是影響果樹生長發(fā)育、果品產(chǎn)量及品質(zhì)的重要的環(huán)境因子之一。低溫會(huì)對(duì)果樹的細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成傷害，引發(fā)樹體物質(zhì)代謝紊亂，甚至引起死亡。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，果樹樹體對(duì)低溫脅迫相關(guān)基因的響應(yīng)受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。果樹低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因，根據(jù)其調(diào)控的方式，主要分為以下2類，一類是通過調(diào)控抗寒基因的表達(dá)、寒冷信號(hào)傳導(dǎo)等過程來提高植物的耐寒性的調(diào)控基因;另一類是與提高植物抗寒性直接相關(guān)的功能基因。該文介紹了果樹抗寒相關(guān)基因的研究進(jìn)展，以供參考。

關(guān)鍵詞：果樹;抗寒基因;研究進(jìn)展

中國是世界果品主要供應(yīng)和加工基地，果品產(chǎn)量和產(chǎn)值均居世界前列，果品生產(chǎn)已成為我國農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]。受氣候變化的影響，我國嚴(yán)寒冰凍等（尤其是南方地區(qū)）惡劣天氣經(jīng)常發(fā)生，低溫寒害使果樹植物體細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到了一定的傷害，引發(fā)物質(zhì)代謝紊亂，甚至死亡，對(duì)我國果業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，從而制約了果樹產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[2]。近年來，果樹樹體對(duì)低溫脅迫相關(guān)基因的響應(yīng)受到了廣泛關(guān)注，國內(nèi)外許多學(xué)者在果樹的抗寒性基因工程等領(lǐng)域也做了較多的研究，但與其他作物相比，果樹抗寒性基因、分子機(jī)理、遺傳育種等方面的研究仍相對(duì)落后[3]。為此，本文對(duì)果樹抗寒性相關(guān)基因研究進(jìn)行了綜述，以期為果樹抗寒分子遺傳育種提供一定的理論依據(jù)，為果樹優(yōu)良品種選育提供新方法、新思路[3-4]。

1 果樹的抗寒性分子機(jī)理

植物的抗寒性是由多基因調(diào)控的數(shù)量性狀，是植物長期適應(yīng)低溫環(huán)境而形成的一種潛在的遺傳特性[5]。隨著分子生物學(xué)的應(yīng)用和發(fā)展，許多植物的抗寒相關(guān)基因已經(jīng)被鑒別出來，例如模式植物擬南芥[6]，糧食作物如玉米[7]、大麥[8]和稻類[9]等，部分果樹品種的抗寒基因也被鑒別出來，如山葡萄[10]、蘋果[11]、柑橘[12]等。除了傳統(tǒng)選育抗寒育種外，外源基因的導(dǎo)入也已成為了提高植物抗逆性的必要手段。

在低溫脅迫條件下，植物體通過激活一系列分子機(jī)制、抗寒相關(guān)的保護(hù)酶和代謝物的活性，誘導(dǎo)大量寒冷相關(guān)基因的表達(dá)合成對(duì)應(yīng)的保護(hù)蛋白及代謝相關(guān)復(fù)合物，從而構(gòu)建新的能量平衡、代謝物的平衡和氧化還原平衡[10]。果樹的抗寒分子機(jī)理主要從以下3個(gè)方面進(jìn)行，一是低溫誘導(dǎo)基因合成低溫保護(hù)物質(zhì)如編碼具有催化作用蛋白;二是合成促進(jìn)附著在細(xì)胞膜表面或者鑲嵌在膜脂之間的對(duì)細(xì)胞膜的冷穩(wěn)定性具有促進(jìn)作用的新蛋白;三是作為蛋白調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和低溫表達(dá)過程。

2 果樹抗寒相關(guān)基因

2.1 CBF（C-repeat Binding Factor）轉(zhuǎn)錄因子 CBF基因家族是低溫脅迫影響最直接的基因之一，主要包括CBF1、CBF2、CBF3和CBF4 4個(gè)成員[13]。其調(diào)控過程可簡單歸納為：植物感應(yīng)冷害脅迫，CBF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控CRT/DRE（C-repeat /Dehydration Responsive Element）基序，COR基因（冷誘導(dǎo)基因）表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物增加，從而提高植物抗寒性[14]。CBF轉(zhuǎn)錄因子的抗寒性在果樹中的研究較為廣泛。Champ等[15]對(duì)枳PtCBF基因在冷處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫可誘導(dǎo)PtCBF基因的表達(dá)，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在枳的不同組織器官中，PtCBF基因?qū)Φ蜏卣T導(dǎo)的響應(yīng)不同，如葉片的PtCBF的表達(dá)量在低溫脅迫處理1h后達(dá)到最大值。金萬梅[16]等將擬南芥的CBF1基因?qū)氲讲葺?，發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫的條件下，導(dǎo)入擬南芥CBF1基因草莓植株的抵抗力有所提高。Siddiqua等通過對(duì)葡萄CBF基因家族進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，CBF1和CBF4基因的表達(dá)量都有所提高[17。Tillett等[18]也發(fā)現(xiàn)VvCBF4在葡萄中過量表達(dá)后，在提高轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性提高的同時(shí)植株高度出現(xiàn)明顯的降低。

2.2 COR（Cold regulated）基因（冷誘導(dǎo)基因） COR基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有“CCGAC”5個(gè)堿基核心序列的脫水反應(yīng)元素DRE（dehydration-responsive element）。當(dāng)植物體受到寒冷脅迫時(shí)，DRE作為順式作用元件，能夠激活COR基因的表達(dá)，從而提高植物的抗寒能力。也有的COR基因上有CRT（C-repeat）和DRE（dehydration-responsive element）2個(gè)順式作用元件，并且CBF1轉(zhuǎn)錄因子能結(jié)合在這2個(gè)順式作用元件上，誘導(dǎo)COR基因的表達(dá)，進(jìn)而提高植物的抗寒性。在柑橘類果樹中，COR基因受到低溫逆境的誘導(dǎo)。Porat等[19]從葡萄柚中獲得了COR15基因，該基因編碼15.1ku的蛋白質(zhì)COR15。Hara等[20]對(duì)溫州蜜柑進(jìn)行低溫馴化，從其葉片中獲得了COR19基因，從枳中獲得CORc115基因和CORc119基因。Sahim-cevikm和Moore[21]發(fā)現(xiàn)枳中的CORc115和CORc115基因表達(dá)的氨基酸序列和溫州蜜柑COR19基因低溫誘導(dǎo)表達(dá)的氨基酸序列都富含賴氨酸豐富區(qū)，并且高度同源。在柑橘類果樹中，溫州蜜柑屬于抗寒性較強(qiáng)的品種，枳屬于抗寒性極強(qiáng)的品種，在低溫脅迫下，它們均有COR19類似蛋白的表達(dá)形成，表明該基因與溫州蜜柑的抗寒性相關(guān)。

2.3 抗凍性蛋白基因（Antifreeze Protein，AFP） 抗凍性蛋白屬于低溫誘導(dǎo)蛋白，能阻止生物體體液內(nèi)冰核的形成與生長，從而維持體液的呈非冰凍的狀態(tài)?？箖龅鞍资紫缺话l(fā)現(xiàn)于極地的魚類體中，能夠降低溶液的冰點(diǎn)、抑制重結(jié)晶和修飾冰晶形態(tài)是抗凍蛋白與其他冷誘導(dǎo)蛋白的基本區(qū)別[22]。抗凍蛋白與冷誘導(dǎo)蛋白相似，均具有親水性和熱穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)基因植物的體內(nèi)抗凍蛋白，只在溫度低于4℃的誘導(dǎo)下才能檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。米寶琴等[10]研究發(fā)現(xiàn)，山葡萄中抗凍性蛋白基因與低溫脅迫有關(guān)，可能編碼耐寒相關(guān)的代謝物質(zhì)，從而提高山葡萄的抗寒性。

2.4 熱休克蛋白基因（Heat shock protein，HSP） HSPs是一類功能性相關(guān)蛋白質(zhì)，當(dāng)植物HSP基因的表達(dá)量與細(xì)胞受到不同的非生物及生物脅迫刺激有關(guān)，相關(guān)研究已在擬南芥[23]及水稻[24]中報(bào)道。在脅迫條件下，HSP能夠通過重新構(gòu)建正常的蛋白構(gòu)象體，從而維持植物細(xì)胞體內(nèi)平衡而發(fā)揮作用[25]。米寶琴等[10]的研究結(jié)果也表明HSPs家族與山葡萄的抗寒反應(yīng)有關(guān)。通過消減文庫的構(gòu)建和分析顯示，山葡萄體內(nèi)的Hsp17.4，Hsp60等某些HSPs屬于下調(diào)基因，而Hsp18.2，Hsp21等則屬于上調(diào)基因，并由此可以推斷，山葡萄中Hsp基因家族的功能差異性可能與進(jìn)化過程中對(duì)冷應(yīng)激反應(yīng)的不同而引起的。

2.5 WRKY轉(zhuǎn)錄因子 WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族N端具有保守的WRKY氨基酸序列、C端具有保守的Cx4-5Cx22-23HxH或Cx7Cx23HxC鋅指結(jié)構(gòu)。WRKY基因具有很多的功能，其中要功能是調(diào)控植物的抗病性和抗逆性[26-27]。羅昌國等[28]研究發(fā)現(xiàn)，湖北海棠MhWRKY40b基因受寒冷脅迫的誘導(dǎo)時(shí)，其表達(dá)上調(diào)，相對(duì)表達(dá)量最高達(dá)20倍以上。這表明MhWRKY40b可能在這些冷害脅迫反應(yīng)中起到了重要調(diào)控作用。

3 展望

果樹的抗寒性是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，是由多基因調(diào)控的數(shù)量性狀。加強(qiáng)對(duì)果樹抗寒相關(guān)基因的研究，爭取通過基因工程育種等選育出較抗冷害、凍害的果樹新品種或植株，增加果樹抗凍品種選育的途徑和手段，從而為提高果樹的品質(zhì)和產(chǎn)量提供一定的幫助。

參考文獻(xiàn)

[1]束懷瑞，陳修德.我國果樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的時(shí)代任務(wù)[J].中國果樹，2018（2）：1-3.

[2]平曉燕，周莉.華南地區(qū)經(jīng)濟(jì)林果寒害研究進(jìn)展[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，26（4）：467-479.

[3]劉榮，劉清國，范建新，等.果樹抗寒性生理生化及分子機(jī)理研究進(jìn)展[J].分子植物育種，2017，15（5）：2028-2034.

[4]王慶杰，王立.植物抗寒性基因研究綜述[J].農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技，2018，29（08）.

[5]Welling A，Palvae T.Molecular control of cold acclimation in trees[J].Physiol Plant，2006，127（2）：167-181.

[6]Lee B-H，Henderson DA，Zhu J-K.The Arabidopsis coldresponsive transcriptome and its regulation by ICE1[J].Plant Cell Online，2005，17（11）：3155-3175.

[7]Nguyen H T，LeipnerJ，Stamp P，et al.Low temperature stress in maize （Zea mays L.）induces genes involved in photosynthesis and signal transduction as studied by suppression subtractive hybridization[J].Plant Physiol Biochem，2009，47（2）：116-122.

[8]JanshaA，AprileA，Zamecnik，et al.Transcriptional responses of winter barley to cold indicate nucleosome remodelling as a specific feature of crown tissues[J].Funct Integr Genomics，2011，11（2）：307-325.

[9]ZhangT，Zhao X，Wang W，et al.Comparative transcriptome profiling of chilling stress responsiveness in two contrasting rice genotypes[J].PLoS ONE，2012，7（8）.

[10]米寶琴，毛娟，申鵬，等.山葡萄‘通化-3抗寒相關(guān)基因SSH文庫的構(gòu)建及分析[J].果樹學(xué)報(bào)，2015，32（4）：546-554.

[11]王海波，程來亮，常源升，等.蘋果矮化砧‘71-3-150對(duì)冷脅迫的生理與轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)[J].園藝學(xué)報(bào)，2016，43 （8）：1437-1451.

[12]張真真，邱立軍，劉博文，等.柑橘抗寒相關(guān)基因及抗寒基因工程研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（11）.

[13]Xiao H，Siddiqua M，Braybrook Set，et al.Three grape CBF/DREB1 genes respond to low temperature，drought and abscisic acid [J].Plant，Cell & Environment，2006，29（7）：1410-1421.

[14]鐘克亞.轉(zhuǎn)錄因子CBF在植物抗寒中的重要作用[J].遺傳，2006，28（2）：249-254.

[15]Champ K I，F(xiàn)ebres V J，Moore G A.The role of CBFtranscriptional activators in two Citrus species （Poncirus and Citrus） with contrasting levels of freezing tolerance[J].Physiologia Plantarum，2007，129（3）：529-541.

[16]金萬梅.冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CBF1轉(zhuǎn)化草莓及其抗寒性鑒定[J].西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（2）：0223-0227.

[17]Siddiqua M，Nassuth A.Vitis CBF1 and Vitis CBF4 differ in their effect on Arabidopsis abiotic stress tolerance，development and gene expression[J].Plant，Cell & Environment，2011，34（8）：1345-1359.

[18]Tillett R L，Wheatley M D，Tattersall E A R，et al.The Vitis vinifera C-repeat binding protein 4（VvCBF4） transcriptional factor enhances freezing tolerance in wine grape[J].Plant Biotechnology Journal，2012，10（1）：105-124.

[19]Porat R，Pavoncello D，Lurie S，et al.Identification of a grapefruit cDNA belonging to a unique class of citrus dehydrins and characterization of its expression patterns under temperature stress conditions [J].Physiologia Plantatrum，2002，115：598-603.

[20]Hara M，Wakasugi Y，Ikoma Y.cDNA sequence and expression of a cold-responsive gene in Citrus unshiu [J].Bioscience，Biotechnology，and Biochenmistry，1999，63（2）：433-437.

[21]Sahim-cevikm，Moore G A.Gold-induced dehydrins from Poncirus trifoliata localized in the nucleus[J].Journal of Plant Biochenistry and BIO technology，2012，21（1）：134-139.

[22]江勇，賈士榮，費(fèi)云標(biāo).抗凍蛋白及其在植物抗凍生理中的作用[J].植物學(xué)報(bào)，1999，7（41）：687-692.

[23]Cheong Y H，ChangH S，Gupta R et al.Transcriptional profiling reveals novel interactions between wounding，pathogen，abiotic stress and hormonal responses in Arabidopsis[J].Plant Physiol，2002，129（2）：661-677.

[24]Swindell W R，Huebner M，Weber A P.Transcriptional profiling of Arabidopsis heat shock proteins and transcription factors reveals extensive overlap between heat and non-heat stress response pathways[J].BMC Genomics，2007，8（1）：125.

[25]RushtonPJ，Somssich I E，Ringler P et al.WRKY tran scriptionfactors. TrendsPlantSci，2010，15：247-258.

[26]Ishiham A N，Yoshioka H.Post-translationalregulationof WRKY transcriptionfactorsinplan timmunity.CurrOpinPlan tBiol，2012，15：1-7.

[27]羅昌國，渠慎春，張計(jì)育，等.湖北海棠MhWRKY40b在幾種脅迫下的表達(dá)分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2013，40（1）：1-9.

（責(zé)編：張宏民）