任瀟毅 宋寧寧 陳建中 張東銘 鄭英斌

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 1乳腺外科，河南 鄭州 450000；2內(nèi)分泌科；3普外科)

乳腺癌是常見于女性的實(shí)體腫瘤，其中手術(shù)治療和放射治療是局部控制乳腺癌的主要途徑，放射治療是乳房功能保守性手術(shù)后治療的關(guān)鍵，提高乳腺癌細(xì)胞放射敏感性也成為廣大醫(yī)學(xué)工作者探討的重點(diǎn)〔1〕。隨著人們對乳腺癌發(fā)病機(jī)制的不斷研究，靶向基因提高腫瘤細(xì)胞放射敏感性對于腫瘤的治療具有重要意義〔2〕。三磷酸腺苷酶家族蛋白(ATAD)2是一種原癌基因，其在惡性腫瘤或低分化組織中高表達(dá)，在分化成熟的組織中表達(dá)水平極低，ATAD2可以調(diào)控多種分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，是核內(nèi)激素受體的激活分子，其異常表達(dá)于多種腫瘤組織中，并且與腫瘤細(xì)胞的生長凋亡有關(guān)〔3，4〕。研究表明，ATAD2在乳腺癌組織中陽性表達(dá)率高于癌旁組織，ATAD2在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義〔5〕。本實(shí)驗(yàn)探討沉默ATAD2對乳腺癌細(xì)胞增殖凋亡及放射敏感性的影響，為延長乳腺癌患者的生存期提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購自北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司；Realtime PCR試劑購自美國Thermo Fisher Scientific；陰性對照慢病毒和ATAD2 shRNA慢病毒購自南京科佰生物科技有限公司；兔抗激活型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3抗體、兔抗p21抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；PI單染細(xì)胞周期檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；兔抗細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)4抗體、ATAD2抗體購自美國Novus Biologicals。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 乳腺癌細(xì)胞生長密度為40%～50%以后，將慢病毒液添加至細(xì)胞中，感染復(fù)數(shù)為20，培養(yǎng)12 h以后換液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d以后，用0.5 μg/ml的嘌呤霉素篩選2 w。設(shè)置轉(zhuǎn)染陰性對照慢病毒的乳腺癌細(xì)胞為Lv-NC組，設(shè)置轉(zhuǎn)染ATAD2 shRNA慢病毒的乳腺癌細(xì)胞為Lv-ATAD2 shRNA組。

1.3沉默效果檢測 Realtime PCR：取Lv-NC組、Lv-ATAD2 shRNA組細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)將細(xì)胞洗滌2次以后，依次添加1 ml的TRIZOL裂解液，提取細(xì)胞中總RNA。配制10 μl的逆轉(zhuǎn)錄體系，體系中包括：0.5 μl隨機(jī)引物、2 μl 5×Primescript TM緩沖液、5.5 μl不含核糖核酸酶的水、0.5 μl Primescript TM RT Enyme mix、0.5 μl Oligo dT Primer、1 μl RNA，cDNA反應(yīng)條件為：37℃，15 min；85℃，5 s。Realtime PCR體系為：3 μl滅菌蒸餾水、5 μl SYBR premix Ex Taq、0.5 μl上下游引物、1 μl cDNA。Realtime PCR條件為：95℃，10 s；95℃ 5 s；57℃20 s；95℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)每個(gè)反應(yīng)的Ct值計(jì)算ATAD2 mRNA的水平，設(shè)置甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為參照。ATAD2上游引物：5′-GGAATCCCAAACCACTGGACA-3′，下游引物5′-GGTAGCGTCGTCGTAAAGCACA-3′。GAPDH上游引物：5′-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3′，下游引物5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′。Western印跡法：取Lv-NC組、Lv-ATAD2 shRNA組細(xì)胞，用RIPA裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白。依照二喹啉甲酸(BCA)法對蛋白進(jìn)行定量檢測以后，把蛋白樣品與5×上樣緩沖溶液混合后，煮沸5 min。配制5%的濃縮膠和10%的分離膠，依照每孔中添加50 μg蛋白樣品計(jì)算，把蛋白樣品分別添加至上樣孔中，進(jìn)行電泳。電壓設(shè)置為80 V，電泳時(shí)間2 h后，觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入到凝膠的底部方可終止電泳。取出凝膠，以自來水沖洗以后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電流為80 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為60 min。轉(zhuǎn)膜后的硝酸纖維素(NC)膜置于含有5%牛血清白蛋白反應(yīng)液中結(jié)合反應(yīng)2 h以后，再將NC膜放在一抗、二抗反應(yīng)液中反應(yīng)2 h，一抗用封閉液按照1∶1 000稀釋，二抗用封閉液按照1∶4 000稀釋。用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑顯色。分析每組ATAD2和內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值，并以ATAD2灰度值與GAPDH灰度值的比值表示ATAD2蛋白水平。

1.4細(xì)胞分組和照射方法 Lv-NC、Lv-ATAD2 shRNA細(xì)胞分別用8 Gy劑量照射處理，記為Lv-NC+放射組、ATAD2 shRNA+放射組。照射方法為：美國VarianClinac ix直線加速器，劑量率為300 cGy/min，100 cm源皮距、20 cm×20 cm的照射野，6MV X射線。

1.5噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖 乳腺癌細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按照Lv-NC、Lv-ATAD2 shRNA、Lv-NC+放射、ATAD2 shRNA+放射細(xì)胞分組方法處理以后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在每個(gè)孔中添加20 μl的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h以后，將孔內(nèi)的液體吸棄，繼續(xù)添加二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μl，放在搖床上反應(yīng)10 min，測定490 nm每孔的吸光度值。

1.6PI單染法檢測細(xì)胞周期 Lv-NC、Lv-ATAD2 shRNA、Lv-NC+放射、ATAD2 shRNA+放射細(xì)胞按照上述方法處理以后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在細(xì)胞中添加PBS將細(xì)胞洗滌以后，用0.25%的胰蛋白酶消化，將細(xì)胞配制成單細(xì)胞懸浮液。添加75%的乙醇溶液混合后，放置于4℃孵育過夜。在細(xì)胞中添加RNase A水，放在37℃孵育30 min，繼續(xù)添加PI染液400 μl染色30 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。

1.7Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 Lv-NC、Lv-ATAD2 shRNA、Lv-NC+放射、ATAD2 shRNA+放射細(xì)胞按照上述方法處理以后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，用PBS懸浮以后，再分別添加5 μl的Annexin V-FITC和PI染液反應(yīng)10 min，上流式細(xì)胞儀檢測凋亡變化。

1.8Western印跡檢測細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、CDK4、p21蛋白表達(dá)水平 Lv-NC、Lv-ATAD2 shRNA、Lv-NC+放射、ATAD2 shRNA+放射細(xì)胞按照上述方法處理以后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，用Western印跡方法檢測細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、CDK4、p21蛋白表達(dá)水平，步驟同上。

1.9克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測放射敏感性 Lv-NC、Lv-ATAD2 shRNA分別經(jīng)過劑量為0、2、4、6、8 Gy的X射線照射處理以后，接種到6 cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中添加300個(gè)細(xì)胞，同時(shí)在培養(yǎng)皿內(nèi)添加4 ml細(xì)胞培養(yǎng)液。放在37℃孵育培養(yǎng)2 w以后，肉眼可觀察到培養(yǎng)皿中有細(xì)胞克隆出現(xiàn)。把上清吸棄掉，添加PBS洗3次，繼續(xù)添加5 ml的甲醇溶液固定15 min，用結(jié)晶紫染色20 min后，放在流水中將染液洗掉，置于室溫條件中干燥。計(jì)數(shù)克隆數(shù)目，用GraphadPad擬合細(xì)胞存活曲線，根據(jù)單擊多靶模型計(jì)算出放射敏感性的參數(shù)值：平均致死劑量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq)、外推數(shù)(N)、2 Gy照射劑量細(xì)胞存活系數(shù)(SF2)、參數(shù)值(k)，計(jì)算放射增敏比。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ATAD2 shRNA轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞中ATAD2蛋白表達(dá)水平 乳腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ATAD2 shRNA慢病毒后，細(xì)胞中ATAD2 mRNA和蛋白水平均顯著降低(P<0.05)。見圖1、表1。

2.2沉默ATAD2協(xié)同放療抑制乳腺癌細(xì)胞增殖 沉默ATAD2后的乳腺癌細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，放射治療后的乳腺癌細(xì)胞的存活率也顯著降低(P<0.05)，并且沉默ATAD2和放射治療具有協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞生長的作用。見表2。

圖1 Western印跡測定ATAD2 shRNA慢病毒對乳腺癌細(xì)胞中ATAD2蛋白表達(dá)影響

組別ATAD2 mRNAATAD2蛋白Lv-NC組1.00±0.000.84±0.09Lv-ATAD2 shRNA組0.35±0.061)0.38±0.051)

與Lv-NC組比較:1)P<0.05

2.3沉默ATAD2協(xié)同放射治療將乳腺癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 從表2和圖2中可以看出，沉默ATAD2后的乳腺癌細(xì)胞G0/G1期比例升高，放射治療后的乳腺癌細(xì)胞G0/G1期比例也升高，并且沉默ATAD2和放射治療具有協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞周期的作用；沉默ATAD2和放射治療均可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，并且二者具有協(xié)同作用。

表2 下調(diào)ATAD2后乳腺癌細(xì)胞周期分布、細(xì)胞存活率及凋亡率變化

與Lv-NC組比較:1)P<0.05；與ATAD2 shRNA+放射組比較：2)P<0.05；表3、4同

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)ATAD2對乳腺癌細(xì)胞凋亡影響

2.4沉默ATAD2協(xié)同放射治療促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞中Caspase蛋白活化和p21蛋白表達(dá)，同時(shí)下調(diào)細(xì)胞中CDK4蛋白表達(dá)水平 從表3和圖3中可以看出，沉默ATAD2后的乳腺癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、p21蛋白水平顯著升高，CDK4蛋白水平顯著降低，放射治療后的乳腺癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、p21蛋白水平也顯著升高，CDK4蛋白水平也顯著降低，并且沉默ATAD2和放射治療具有協(xié)同作用。

2.5沉默ATAD2提高乳腺癌細(xì)胞放射敏感性 與Lv-NC組比較，Lv-ATAD2 shRNA組、2、4、6、8 Gy細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著下降(P<0.05)。沉默ATAD2后的乳腺癌細(xì)胞放射增敏比為1.396。見表4、表5。

表3 下調(diào)ATAD2后乳腺癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、CDK4、p21蛋白表達(dá)水平變化

1～4：Lv-NC組、Lv-ATAD2 shRNA組、Lv-NC+放射組、ATAD2 shRNA+放射組圖3 Western印跡檢測下調(diào)ATAD2對乳腺癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、CDK4及p21蛋白表達(dá)影響

表4 不同放射劑量兩組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)

表5 單擊多靶模型參數(shù)值

3 討 論

ATAD2基因定位于8q24.13染色體上，其編碼的蛋白質(zhì)又稱為PRO2000或ANCCA，ATAD2蛋白中含有可以調(diào)控細(xì)胞活性的ATP酶結(jié)構(gòu)域、溴結(jié)構(gòu)域，ATAD2蛋白的氨基端還含有雄激素受體、雌激素受體等協(xié)同因子，能夠共同調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)〔6～8〕。ATAD2在乳腺癌、宮頸癌、肝癌、淋巴瘤等腫瘤組織中高表達(dá)，其在腫瘤中發(fā)揮癌基因的作用，ATAD2可以通過調(diào)控多種癌癥相關(guān)基因、腫瘤細(xì)胞表觀遺傳等影響腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡〔5，6，9，10〕。ATAD2敲減可以誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡，抑制宮頸癌細(xì)胞生長，后續(xù)在多種腫瘤細(xì)胞中證實(shí)敲減ATAD2具有抗腫瘤作用〔6，9〕。本研究表明，沉默ATAD2后的乳腺癌細(xì)胞的增殖能力降低，細(xì)胞凋亡率升高，沉默ATAD2在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)揮抑制作用。

研究證實(shí)，沉默ATAD2發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞生長機(jī)制與阻礙細(xì)胞周期進(jìn)展的和抑制Caspase凋亡反應(yīng)有關(guān)；在結(jié)腸癌、宮頸癌細(xì)胞中的研究表明，沉默ATAD2可以將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，也有研究表明，沉默ATAD2對腫瘤細(xì)胞周期沒有明顯作用；在肝癌等腫瘤細(xì)胞中的研究顯示，沉默ATAD2可以激活細(xì)胞中Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生〔6，11～13〕。Caspase-3是Caspase蛋白家族的成員之一，其在Caspase凋亡反應(yīng)中發(fā)揮執(zhí)行者的作用，Caspase-3只有被活化后才可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔14〕。CDK4是一種細(xì)胞周期促進(jìn)因子，其可以誘導(dǎo)細(xì)胞從G0/G1期向S期進(jìn)展，p21是一種細(xì)胞周期抑制因子，其表達(dá)水平升高后可以抑制細(xì)胞周期進(jìn)展〔15〕。本研究顯示，沉默ATAD2后的乳腺癌細(xì)胞中Caspase-3活化水平升高，細(xì)胞中p21蛋白水平升高，CDK4蛋白水平下降，細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，沉默ATAD2可以通過激活Caspase凋亡反應(yīng)和通過調(diào)控細(xì)胞周期因子的表達(dá)發(fā)揮抗乳腺癌的作用。

流行病學(xué)資料顯示，乳腺癌的發(fā)生率呈不斷上升趨勢，隨著人們對乳腺癌生物學(xué)行為的不斷研究發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)大手術(shù)切除范圍并不能達(dá)到較好的治療效果，保乳手術(shù)也成為乳腺癌治療的首選，放射治療是目前除了手術(shù)治療之外的最常見的腫瘤治療手段，在多種腫瘤的治療中廣泛應(yīng)用，放射治療也是手術(shù)切除后保乳治療的首選途徑〔16～18〕。研究顯示，腫瘤細(xì)胞對于放射治療的敏感性差是導(dǎo)致放療失敗的重要原因，尋找有效的途徑提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性已經(jīng)成為目前腫瘤治療的關(guān)鍵〔19〕。本研究結(jié)果表明，沉默ATAD2在誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡和抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的過程中還可以提高乳腺癌細(xì)胞放射敏感性，靶向ATAD2可能是提高乳腺癌細(xì)胞放射敏感性的有效途徑之一。

總之，沉默ATAD2可能是提高乳腺癌放射敏感性的潛在途徑，沉默ATAD2能夠協(xié)同放射治療誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期，發(fā)揮抗腫瘤作用。目前對于ATAD2具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確，對于沉默ATAD2在體內(nèi)抗乳腺癌的作用尚不清楚，在以后的實(shí)驗(yàn)探討中會(huì)對上述部分進(jìn)行探索。