李 博，高明波

（大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600）

黃麗（Sedum‘Golden Glow’）是景天科景天屬多年生多肉植物，莖短，葉呈肉質(zhì)，排列很緊密，呈蓮座狀，葉片呈匙形。黃麗除了可做盆栽觀賞，還可以治療肝病、尿酸、痛風(fēng)以及高血壓。本試驗(yàn)選擇黃麗葉片為外植體，通過組織培養(yǎng)技術(shù)建立其快繁體系。已有研究表明，在多肉植物玉扇的組培快繁中，不同外植體的誘導(dǎo)效應(yīng)存在差異，取材是否得當(dāng)影響組培成功率[1]。劉芳等研究表明，組合為3mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA 和1mg/L KT 的培養(yǎng)基配方能使勞爾葉片愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)95.7%，6-BA 和NAA 對(duì)愈傷組織分化芽的效果顯著，3mg/L 6-BA 和0.3mg/L NAA 組合，新芽分化率80%[2]。所以本試驗(yàn)采用了多肉植物黃麗的不同器官切片作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，從而找到最適合組培的切片，并且通過不同濃度的6-BA、NAA 和KT 對(duì)外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，從而確立多肉植物黃麗愈傷組織誘導(dǎo)、莖葉分化及生根階段的最佳培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及預(yù)處理

供試多肉植物黃麗為網(wǎng)上購買。試驗(yàn)試劑：250 gMS 培養(yǎng)基（不含瓊脂和蔗糖），青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；500 g 蔗糖，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；100g 瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；1g 6-芐胺基嘌呤（以下稱6-BA），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；25gα-萘乙酸（以下稱NAA），常州市光明生物化學(xué)研究所；6-糖氨基嘌呤（以下稱KT），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。試驗(yàn)器材：HVA-85高壓滅菌鍋，HIRAYAMA MANUFACTURING CORPORATION；ABS 80-4 分析天平，KERN &Sohn GmbH；SW-CJ-2FD 潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

將黃麗放入干凈的燒杯中，用自來水沖洗干凈后加入適量洗衣粉，用軟毛刷輕輕刷洗15min，之后倒去洗滌劑，在自來水下沖洗30min 以上。打開紫外線滅菌燈照射消毒超凈工作臺(tái)30min，在清潔好超凈工作臺(tái)后將黃麗移到超凈工作臺(tái)上，先用75%乙醇浸泡30 s，用無菌水沖洗4～5 次，再用0.1%HgCl2（氯化汞）消毒5min，用無菌水沖洗4～5 次。剝?nèi)↑S麗葉片和莖段，挑選狀態(tài)較好的黃麗組織在無菌環(huán)境下切成1cm2左右的小塊，用無菌濾紙吸干多余水分后以備用[3]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的選擇。外植體選擇時(shí)所用基本培養(yǎng)基為：MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH 值調(diào)至6.0。分別取黃麗的葉片、莖段2 種不同組織為材料，每種接種5 瓶，每瓶接種3 塊。進(jìn)行恒溫光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度為2000Lx，每日光照12～16h[4]。在5、10、15d 時(shí)分別觀察愈傷組織的誘導(dǎo)情況，并測定愈傷組織的大小。

1.2.2 誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的選擇。誘導(dǎo)愈傷組織的基本培養(yǎng)基為：MS+0.1mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂，分別添加0、0.5、1.0、1.5、2.0mg/L 的KT、6-BA[5]。以黃麗的葉片或莖段部分組織為外植體進(jìn)行接種，每種接種5 瓶，每瓶接種3 塊。進(jìn)行恒溫光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度為2000Lx，每日光照12～16h。在5、10、15 d 時(shí)觀察外植體的生長情況，并測定愈傷組織的大小。

1.2.3 誘導(dǎo)分化生莖培養(yǎng)基的選擇。誘導(dǎo)分化生莖的基本培養(yǎng)基為：MS+0.1mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂，分別添加0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L 的6-BA[5]。進(jìn)行恒溫光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度為2000Lx，每日光照12～16h。在5、15、30 d 時(shí)觀察愈傷組織的變化情況以及誘導(dǎo)莖葉生長情況，并測定莖葉的大小。

1.2.4 生根培養(yǎng)基的選擇。生根的基本培養(yǎng)基為：MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂，分別添加0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L 的NAA[5]。對(duì)上一階段誘導(dǎo)出的已分化的莖葉植株進(jìn)行生根培養(yǎng)。進(jìn)行恒溫光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度為2000Lx，每日光照12～16h。在5、15、30 d 時(shí)觀察愈傷組織的變化情況以及根的生長情況并測定根的大小。

1.3 測定方法

在無菌的條件下，使用直尺測量愈傷組織，莖葉以及根的大小。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

使用Excel 等軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。數(shù)據(jù)用平均值表示。結(jié)果用三線表整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同器官切片對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

本試驗(yàn)利用多肉植物黃麗的器官葉片、莖段的橫縱切片分別作為試驗(yàn)材料，選擇最適合做組培快繁的材料。橫切為沿著較短長度方向切割，縱切為沿著較長長度方向切割。

表1 不同器官切片對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

由試驗(yàn)結(jié)果可知，黃麗的莖段橫縱切片均不可作為外植體進(jìn)行組培，葉片的縱切片也不合適，葉片的橫切片脹大呈淡黃色，結(jié)構(gòu)較為緊密，還可以觀察到外植體的大致形狀，且外植體的長度明顯長于其他組織，即誘導(dǎo)愈傷組織的效應(yīng)明顯優(yōu)于其它部分。

2.2 不同激素濃度對(duì)黃麗組培各階段的影響

2.2.1 不同濃度KT、6-BA 對(duì)外植體的影響。由試驗(yàn)結(jié)果可知，經(jīng)過不同濃度激素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)后，不同濃度的激素對(duì)外植體的誘導(dǎo)率相同，都為100%，即不同濃度的KT、6-BA 均能誘導(dǎo)黃麗外植體形成愈傷組織，但誘導(dǎo)效果有很大差別，外植體長度明顯高于對(duì)照組。誘導(dǎo)培養(yǎng)5d 后外植體無明顯變化，誘導(dǎo)培養(yǎng)10d 后愈傷組織呈顆粒狀聚集，表明愈傷組織一般在誘導(dǎo)培養(yǎng)后10d 左右產(chǎn)生，愈傷組織數(shù)量隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而逐漸增加。比較了不同濃度KT、6-BA 的誘導(dǎo)效果，6-BA 最佳濃度的誘導(dǎo)效果比KT最佳濃度的誘導(dǎo)效果好。愈傷組織誘導(dǎo)效果最好為6-BA 濃度為1mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)培養(yǎng)15d 后，外植體長度可達(dá)1.05cm，明顯高于其他濃度的6-BA

表2 不同濃度KT、6-BA 影響下外植體的長度 單位：cm

2.2.2 不同濃度6-BA 對(duì)葉片組織的影響。由試驗(yàn)結(jié)果可得，隨著時(shí)間增長不同濃度6-BA 條件下的葉片組織均有增長，其中5d 時(shí)誘導(dǎo)效果都不明顯，15d 時(shí)除了6-BA 濃度為0.5mg/L 的一組，其他組都有變化，到30 d 時(shí)誘導(dǎo)效果與對(duì)照組相比均有顯著變化，但增長程度不同，隨著6-BA 的濃度增大，誘導(dǎo)效果逐漸明顯，當(dāng)6-BA 濃度為2mg/L 時(shí)，葉組織的誘導(dǎo)效果最好，產(chǎn)生叢生芽。

表3 不同濃度6-BA 影響下葉片組織的高度 單位：cm

2.2.3 不同濃度NAA 對(duì)根組織的影響。由試驗(yàn)結(jié)果可得，經(jīng)不同濃度NAA 誘導(dǎo)黃麗葉片組織分化生根，除0.5mg/L 濃度的NAA 環(huán)境下，其余隨著時(shí)間增加不同濃度NAA 條件下的根系均有增長，其中5d 時(shí)誘導(dǎo)效果都不明顯，15d 時(shí)除了NAA 濃度為0.5 mg/L 的一組，其他組都有變化，到30d 時(shí)誘導(dǎo)生根效果有顯著變化，但增長程度不同，隨著6-BA 的濃度增大，誘導(dǎo)效果逐漸減弱，當(dāng)濃度達(dá)到0.5mg/LNAA 時(shí)不再誘導(dǎo)生根，當(dāng)NAA 濃度為0.1mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)生根效果最佳，根系長度明顯高于對(duì)照組及其它濃度試驗(yàn)組。

表4 不同濃度NAA 影響下根組織的長度 單位：cm

3 討論

該試驗(yàn)首先以黃麗的葉片和莖部的橫縱切片為外植體，篩選適合作為外植體的組織，通過試驗(yàn)得到了葉片橫切片是最合適作為外植體的結(jié)論，其他切片均不合適，不適宜產(chǎn)生愈傷組織。以葉片橫切片為外植體，通過3 組試驗(yàn)確定了黃麗愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方為：MS+0.1mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂+1mg/L 6-BA；誘導(dǎo)分化生莖的最佳培養(yǎng)基為MS+0.1mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂+2mg/L 6-B 誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+0.1mg/L NAA。采用該試驗(yàn)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，大約10d 就有愈傷組織產(chǎn)生，1d 能夠得到較為明顯的愈傷組織，再采用誘導(dǎo)生莖培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)15d 可獲得叢生芽，之后采用該試驗(yàn)的生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)5d 即可有根系產(chǎn)生，再培養(yǎng)10d 就可形成完整植株，所以采用本試驗(yàn)的最佳培養(yǎng)基配方進(jìn)行黃麗組織培養(yǎng)，不到2 個(gè)月即可獲得完整植株。綜上所述，該研究得到了黃麗組織培養(yǎng)的最佳外植體及各培養(yǎng)階段的最佳培養(yǎng)基配方，建立了多肉植物黃麗的組培快繁技術(shù)體系，研究結(jié)果能有效提高愈傷組織誘導(dǎo)成功率、縮短種苗生產(chǎn)周期，為黃麗的工廠化育苗提供了試驗(yàn)依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。