江 羽，王葉葉，梁 晨，譚 睿,2＊＊

（1.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 成都 610031；2.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 成都 610031）

缺血性腦卒中現(xiàn)在仍是危害人類性命的重大疾病之一，其發(fā)病率、致殘率及死亡率都極高[1]，由于該疾病的復(fù)雜性及神經(jīng)修復(fù)的困難性，至今仍缺乏有效的治療與預(yù)后手段[2]?，F(xiàn)有如抗炎、抗氧化等多種治療方案被報道，但在臨床治療效果評價中，均未取得顯著性突破[3]。令人欣喜的是，干細(xì)胞用于心腦血管疾病治療成為新的研究熱點，也為腦缺血的治療提供了新的方向。其中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，bMSCs)是一種來源于骨髓基質(zhì)系統(tǒng)中的非造血組織干細(xì)胞，具有較強的增殖能力且有多向分化潛能，在特定的理化環(huán)境或一些細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下可以向神經(jīng)系細(xì)胞（如神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等）分化[4,5]，且bMSCs易獲取、易在體外培養(yǎng)，具有較強的增殖能力，因此常被用于干細(xì)胞分化與治療研究[6]。目前最常用于誘導(dǎo)bMSCs 分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的物質(zhì)是β-巰基乙醇和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）[7,8]，其中，bFGF 來源少且價格昂貴，而β-巰基乙醇易引起細(xì)胞死亡且誘導(dǎo)成功后維持時間較短[9]，因此需進(jìn)一步研發(fā)新型藥物分子用于干細(xì)胞治療。中藥單體來源廣泛，提取便利，其藥理效果越來越受到重視[10]。木香烴內(nèi)酯是中藥木香的主要有效成分，是一種倍半萜內(nèi)酯類化合物，主要有抗炎、抗腫瘤[11]等作用。有研究證明，木香烴內(nèi)酯可通過提高Bcl-2 的表達(dá)量、降低Bax的表達(dá)量[12]及激活Keap1-Nrf2-ARE 通路誘導(dǎo)大量抗氧化分子的表達(dá)[13]達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用。同時，神經(jīng)保護(hù)的另一重要機(jī)制是促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)與再生，而誘導(dǎo)干細(xì)胞分化正是神經(jīng)再生的途徑之一[14]，因此考慮木香烴內(nèi)酯是否有促進(jìn)bMSCs 分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的作用。本實驗用木香烴內(nèi)酯作為誘導(dǎo)劑，體外檢測其對bMSCs 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)效果，進(jìn)一步通過誘導(dǎo)分化后bMSCs 對腦缺血再灌注損傷大鼠模型的治療作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器

胎牛血清（gibco，批號：1908121）；DMEM 低糖培養(yǎng)基（Hyclone，批號：J180003）；胰蛋白酶（Hyclone，批號：J180003）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）（銳賽生物公司，批號：180315）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（源葉生物科技有限公司，批號：BCBR5460V）；4%多聚甲醛（Biosharp，批號：180119）；96 孔板（Thermo，批號：167008）；蘇木素染液套裝（武漢谷歌生物科技有限公司，批號：G1005）；NESTIN 一抗（武漢谷歌生物科技有限公司，批號：GB12137）；GFAP一抗（武漢谷歌生物科技有限公司，批號：GB11096）；NSE 一抗（武漢谷歌生物科技有限公司，批號：GB11376-1）；二抗CY3山羊抗小鼠（武漢谷歌生物科技有限公司，批號：GB21301）；二抗488 山羊抗兔（武漢谷歌生物科技有限公司，批號：GB25303）；二抗CY3山羊抗兔（武漢谷歌生物科技有限公司，批號：GB21303）。

1.1.2 實驗動物

SPF 級成年雄性SD 大鼠40 只，平均體質(zhì)量在280-300 g，用于制備腦缺血再灌注動物模型；SPF 級2-4 周齡雄性SD 大鼠2 只，平均體質(zhì)量在120-140 g，用于制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.2 試驗方法

1.2.1 bMSCs的分離、培養(yǎng)

選取2-4周齡健康雄性SD大鼠脫頸處死，將全身浸入75%乙醇中消毒約10 min。在無菌條件下取出雙側(cè)脛骨和股骨，剪去兩端骨骺，用5 mL 注射器抽取5 mL 含15%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基先自一端沖出骨髓，再從另一端沖洗，制成單細(xì)胞懸液，置于10 mL培養(yǎng)皿中，放置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中，24 h 后全量換液，以后每2 天換液1次，去除非貼壁細(xì)胞。每日觀察細(xì)胞的生長情況，待原代細(xì)胞融合達(dá)到80%-90%時，按1∶3 比例進(jìn)行傳代，并將培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基。經(jīng)多次傳代擴(kuò)增培養(yǎng)，使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞逐漸得到純化。

1.2.2 木香烴內(nèi)酯對bMSCs毒性檢測

通過MTT 檢測木香烴內(nèi)酯對bMSCs 的毒性。取第三代bMSCs，按照每孔1.0×104個細(xì)胞接種于96 孔板中，放置于培養(yǎng)箱中24 h使其貼壁。設(shè)置木香烴內(nèi)酯的濃度梯度為2 μM，5 μM，10 μM，20 μM，40 μM，60 μM，80 μM，并按分組加入相應(yīng)濃度藥物，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入MTT（5 mg·mL-1）20 μl，避光培養(yǎng)2 h 后吸出培養(yǎng)基，每孔加入100 μl DMSO，充分震蕩后使用酶標(biāo)儀檢測吸光度，波長為570 nm，記錄結(jié)果，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制bMSCs生存曲線。

1.2.3 木香烴內(nèi)酯誘導(dǎo)bMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化

選擇第3代bMSCs，按照每孔1.0×105個細(xì)胞接種于6 孔板，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 使其貼壁。根據(jù)MTT 結(jié)果，選擇濃度為10 μM 的木香烴內(nèi)酯溶液對bMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，根據(jù)時間設(shè)置4 h，12 h，24 h共3組，定時觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并對其進(jìn)行骨架染色。將誘導(dǎo)結(jié)束后的細(xì)胞固定，封片，通過免疫熒光染色的方法對其NSE，GFAP及Nestin三種神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)量變化進(jìn)行檢測。

1.2.4 腦缺血再灌注動物模型制備

將40 只大鼠隨機(jī)平均分為假手術(shù)組，模型組，MSC 組及木香烴內(nèi)酯誘導(dǎo)MSC 組（誘導(dǎo)組）（n=10）。使用改良Zea Longa's 線栓法制作大腦中動脈閉塞（MCAO）局灶性腦缺血模型[15]。具體步驟為：以體積分?jǐn)?shù)10%的水合氯醛溶液按0.33-0.36 mL·100g-1量進(jìn)行腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)板，頸部常規(guī)消毒后備皮，于頸部正中切口，用棉簽鈍性分離肌肉，暴露出右側(cè)頸總動脈，分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端，于結(jié)扎處上端剪口，將線栓插入剪口處并進(jìn)線（在線栓近頭端1.5 cm處標(biāo)記，進(jìn)線時標(biāo)記點到達(dá)Y型分支口即可），縫合，消毒，每只大鼠術(shù)后補充5 mL生理鹽水，2 h后拔出線栓進(jìn)行再灌注。

根據(jù)Longa Z 的5 分制法進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評分[16]，選取1-2分的動物隨機(jī)分組，在拔線2 h后，每只由尾靜脈注射含1.0×106個細(xì)胞的bMSCs細(xì)胞或誘導(dǎo)后bMSCs細(xì)胞懸液1 mL（由PBS作溶劑），假手術(shù)組與模型組注射等量PBS。術(shù)后2 h，1天，3天，5天，7天對動物進(jìn)行神經(jīng)功能評分。于造模7 天后，處死大鼠并取腦，對大腦行TTC染色及HE染色，并采用干濕重法測量腦組織含水量。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ)表示，P ＜0.05表示有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 木香烴內(nèi)酯對bMSCs毒性檢測

bMSCs 的存活率通過MTT 實驗檢測（圖1），隨木香烴內(nèi)酯濃度增加，細(xì)胞在2-10 μM 濃度范圍內(nèi)存活率均高于90%，而濃度超過10 μM 時細(xì)胞存活率明顯下降。說明木香烴內(nèi)酯濃度在10 μM 以上時，具有較大的細(xì)胞毒性。因此，本實驗中選擇濃度為10 μM 的木香烴內(nèi)酯對bMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)。

2.2 誘導(dǎo)后bMSCs形態(tài)學(xué)研究

bMSCs形態(tài)學(xué)變化用于評價木香烴內(nèi)酯對bMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。光鏡下觀測結(jié)果（圖2），在0-24 h間，細(xì)胞由圖A到圖D，形態(tài)逐漸拉長并出現(xiàn)細(xì)胞分支，表現(xiàn)出神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)。

通過細(xì)胞骨架（β-actin）染色對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)一步觀察（圖3），細(xì)胞在木香烴內(nèi)酯作用下，由圖A 中梭型、無分支樣逐漸變化為圖D中較長且有分支的形態(tài)，呈神經(jīng)細(xì)胞樣。骨架染色結(jié)果與光鏡下觀察結(jié)果一致。表明在木香烴內(nèi)酯的條件誘導(dǎo)下，bMSCs 逐漸向神經(jīng)樣細(xì)胞分化。

2.3 神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白免疫熒光染色

神經(jīng)元特異性蛋白NSE、Nestin 和星型膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白GFAP是用來檢測干細(xì)胞誘導(dǎo)分化后是否存在神經(jīng)樣細(xì)胞的指標(biāo)[17]。染色結(jié)果（圖4），與空白組相比，木香烴內(nèi)酯誘導(dǎo)bMSCs 后三種神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)量均有升高，其中蛋白GFAP 和Nestin 的表達(dá)量在誘導(dǎo)后24 h達(dá)到峰值，蛋白NSE 的表達(dá)量在誘導(dǎo)后12 h 達(dá)到最高值。證明bMSCs 在經(jīng)木香烴內(nèi)酯誘導(dǎo)后逐漸向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，且最終確定誘導(dǎo)條件為10 μM木香烴內(nèi)酯孵育細(xì)胞24 h。

2.4 神經(jīng)功能損傷評分

術(shù)后動物根據(jù)Longa Z 的5 分制法進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評分（表1），術(shù)后2 h及1天內(nèi)，MSC組及誘導(dǎo)組動物的評分有所降低，但與模型組相比無顯著性差異（P ＞0.05）；術(shù)后5天、7天內(nèi)，與模型組相比，MSC組評分有明顯下降（P ＜0.05），而誘導(dǎo)組評分與模型組相比差異更加明顯（P ＜0.01）。

圖1 木香烴內(nèi)酯對bMSCs細(xì)胞毒性測定

圖2 光學(xué)顯微鏡下觀察bMSCs形態(tài)學(xué)變化（×100）（A：空白組；B：誘導(dǎo)4 h；C：誘導(dǎo)12 h；D：誘導(dǎo)24 h）

圖3 bMSCs細(xì)胞骨架染色免疫熒光檢測（×400）（A：空白組；B：誘導(dǎo)4 h；C：誘導(dǎo)12 h；D：誘導(dǎo)24 h）

圖4 誘導(dǎo)后bMSCs細(xì)胞NSE，GFAP及Nestin免疫熒光染色（×200）（A：空白組；B：誘導(dǎo)4 h；C：誘導(dǎo)12 h；D：誘導(dǎo)24 h）

表1 術(shù)后動物神經(jīng)功能損傷評分（n=10）

2.5 TTC染色，腦梗死體積及腦組織含水量

術(shù)后7 天，腦梗死情況（圖5），MSC 組及誘導(dǎo)組大鼠腦梗死體積明顯小于模型組，且誘導(dǎo)組大鼠腦梗死體積相較于MSC 組有明顯減小。誘導(dǎo)組大鼠腦部梗死體積為14.76%±0.56，與模型組相比明顯下降，且有顯著性差異（P ＜0.01）；MSC 組腦部梗死體積為23.15%±0.08，與模型組相比有所下降，但無顯著性差異（P ＞0.05）；誘導(dǎo)組大鼠腦部梗死體積與MSC組相比也有顯著下降（P ＜0.01）。模型組大鼠腦組織的含水量為81.19%±0.27，與假手術(shù)組相比明顯增加，有顯著性差異（P ＜0.05）；MSC組腦組織含水量為80.80%±0.20，與模型組相比有所下降，但無顯著性差異（P ＞0.05）；誘導(dǎo)組大鼠腦組織的含水量為78.93%±0.38，與模型組相比明顯下降，且有顯著性差異（P ＜0.05），與MSC 組相比也有顯著性差異（P ＜0.05），說明bMSCs與誘導(dǎo)后bMSCs均可使腦缺血損傷大鼠腦梗死體積減小并降低腦含水量，且誘導(dǎo)組效果優(yōu)于MSC組（表2）。

2.6 HE染色

大鼠腦缺血半暗區(qū)組織學(xué)觀察顯示（圖6），假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，排列整齊緊密，染色均勻，細(xì)胞核大而圓；模型組神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，可見神經(jīng)元細(xì)胞核出現(xiàn)明顯固縮和深染，細(xì)胞間質(zhì)水腫，結(jié)構(gòu)疏松；MSC組與誘導(dǎo)組均可見大鼠缺血半暗帶區(qū)固縮、濃染神經(jīng)元減少，組織間隙水腫減輕，但兩組相比，誘導(dǎo)組缺血半暗帶區(qū)恢復(fù)效果優(yōu)于MSC 組。以上實驗結(jié)果說明，誘導(dǎo)后的bMSCs 對腦缺血再灌注損傷的治療作用更加明顯。

圖5 術(shù)后動物腦組織TTC染色（白色為梗死部位，紅色為正常部分）

3 討論

干細(xì)胞用于心腦血管疾病治療是近年來的研究熱點[18]。在針對腦缺血的治療中，主要有注射神經(jīng)干細(xì)胞[19,20]及注射bMSCs[21,22]兩種研究方向。但外源神經(jīng)干細(xì)胞主要來源于胚胎或胎兒，其應(yīng)用廣受爭議，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可從自體器官獲得，無倫理爭議，且無需進(jìn)行免疫抑制治療[23]，是當(dāng)下干細(xì)胞治療領(lǐng)域的研究重點。2000 年左右，bMSCs 向神經(jīng)細(xì)胞樣分化的實驗是在體內(nèi)進(jìn)行的，Kopen 等將標(biāo)記的大鼠bMSCs 直接注射入新生小鼠的側(cè)腦室發(fā)現(xiàn)其能在腦微環(huán)境影響下分化為神經(jīng)樣細(xì)胞[24]，但bMSCs 細(xì)胞在體內(nèi)的分布及分化存在多種可能性，難以完全向預(yù)期方向發(fā)展。隨著研究的深入，Woodbury等報道bMSCs可通過體外誘導(dǎo)向神經(jīng)樣細(xì)胞分化[6]。bMSCs 在體外分化為神經(jīng)樣細(xì)胞后，會有較好的腦靶向性，能更多地分布在腦病灶部位，發(fā)揮更加有效的治療作用[25]。

膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物；神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE)是神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞所特有的一種酸性蛋白酶；巢蛋白（Nestin）是一種中間絲類型的蛋白，為神經(jīng)干細(xì)胞的*P ＜0.05，**P ＜0.01：與模型組相比；&P ＜0.05，與假手術(shù)組相比；#P ＜0.05，##P ＜0.01，與MSC組相比。特征性標(biāo)志物[26,27]。這三種蛋白是用于證明干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后向神經(jīng)細(xì)胞分化的主要標(biāo)志蛋白[28]。本研究中發(fā)現(xiàn)隨木香烴內(nèi)酯對bMSCs 誘導(dǎo)時間的延長，細(xì)胞形態(tài)逐漸拉長并出現(xiàn)分支，表現(xiàn)出神經(jīng)樣細(xì)胞形態(tài)，同時NSE，GFAP 及Nestin 三種神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)量也有所上調(diào)，證明木香烴內(nèi)酯可誘導(dǎo)bMSCs 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化。在此基礎(chǔ)上，利用腦缺血再灌注大鼠模型對誘導(dǎo)后bMSCs 的治療效果進(jìn)行驗證，由神經(jīng)功能損傷評分可見誘導(dǎo)組動物術(shù)后神經(jīng)恢復(fù)情況較MSC 組更佳，且狀態(tài)更活躍，能主動進(jìn)食飲水。腦梗死體積與腦含水量結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組及MSC組皆可減輕術(shù)后腦部損傷，而兩組對比，誘導(dǎo)組動物腦梗死體積的減小及腦含水量的降低均更為顯著。由腦組織HE染色結(jié)果可知，誘導(dǎo)組及MSC組大鼠的缺血半暗帶組織結(jié)構(gòu)均有不同程度的恢復(fù)，其中誘導(dǎo)組病灶部位的神經(jīng)元較完整、組織更加緊密。通過對兩組治療結(jié)果進(jìn)行對比，可見誘導(dǎo)組的治療效果明顯優(yōu)于MSC組。

表2 術(shù)后動物腦梗死體積及腦組織含水量變化（n=10）

圖6 大鼠腦組織HE染色（×50）（A：假手術(shù)組；B：模型組；C：MSC組；D：誘導(dǎo)組）

綜上所述，bMSCs 經(jīng)木香烴內(nèi)酯誘導(dǎo)后可向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，且用誘導(dǎo)后bMSCs 治療腦缺血可顯著降低病灶部位的損傷。干細(xì)胞治療這一領(lǐng)域仍有無限潛能，今后可能會為治療心腦血管疾病提供更好的方向與思路，具有很高的臨床價值。