彭 俊，楊團(tuán)元，劉蒲臨，趙永威，繆禮鴻*，廖衛(wèi)芳

（1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北 松滋 434200）

傳統(tǒng)白酒及葡萄酒發(fā)酵與自然環(huán)境中微生物息息相關(guān)，特別是傳統(tǒng)白酒在開(kāi)放式環(huán)境中制曲、下曲堆積、發(fā)酵，環(huán)境中微生物很容易落入其中并參與白酒的發(fā)酵。有研究表明，傳統(tǒng)大曲酒發(fā)酵微生物中酵母菌主要來(lái)源于大曲，環(huán)境對(duì)白酒釀造真菌來(lái)源的貢獻(xiàn)達(dá)20%～39%[1-3]。而在開(kāi)放式的制曲環(huán)境下，包括酵母菌在內(nèi)的大曲中的微生物最終也有相當(dāng)一部分來(lái)源于其周?chē)h(huán)境。白酒廠長(zhǎng)期開(kāi)放式或半開(kāi)放式的自然發(fā)酵（包括制曲、高溫堆積及入池發(fā)酵）過(guò)程也必然受當(dāng)?shù)赝林⑸锏挠绊?。土壤是各種微生物的天然棲息地，其中蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，一般土壤中真菌數(shù)量約3×104～17×104CFU/g，其中包含霉菌、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和大量的非釀酒酵母：孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）和伊薩酵母屬（Issatchenkia）等，并且酵母的類(lèi)群和產(chǎn)區(qū)地理特征有很大的關(guān)系[4-6]。東方伊薩酵母（I.orientalis）是一種在酒醅和酒曲[7]、土壤[8]、葡萄表皮[9]、傳統(tǒng)奶酪[10]、發(fā)酵乳制品[11]、傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑[12]等環(huán)境中廣泛存在的非釀酒酵母，其不僅具有較好的耐熱能力和耐酒精能力，而且高產(chǎn)乙醇和酯類(lèi)物質(zhì)[13-15]，并對(duì)白酒的香氣形成具有重要作用[16-17]。有研究表明[18-19]，I.orientalis與檸檬形克勒克酵母（Klockeraapiculata）混合發(fā)酵柿子酒效果均優(yōu)于純種發(fā)酵，且也在降解檸檬酸上很有潛力。不同酵母菌株之間的發(fā)酵特性往往具有一定的差異，考察是否適合于釀酒的酵母菌的發(fā)酵特性一般包括菌株的耐溫能力、耐酸能力、耐乙醇能力、產(chǎn)乙醇能力及不同條件下生長(zhǎng)速率等[20-22]。

本研究采用傳統(tǒng)平板分離法分析白酒廠酒醅及其周邊土壤中酵母菌的多樣性差異，并對(duì)分離自土壤和酒醅的I.orientalis的耐受性及主要發(fā)酵產(chǎn)物（乙醇、乙酸乙酯）含量進(jìn)行比較分析。旨在揭示白酒釀造過(guò)程中參入的微生物與其周邊土壤環(huán)境中土著微生物之間的關(guān)聯(lián)性，并為白酒釀造中酵母菌的來(lái)源及I.orientalis優(yōu)良菌株的選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品及菌株

土壤樣品：采自湖北白云邊酒廠方圓約10 km的農(nóng)作物旱地、維護(hù)較好的生態(tài)林以及果蔬園，刨開(kāi)表層的腐質(zhì)層，按照對(duì)角線法取5個(gè)土樣，每個(gè)土樣取表層土壤100 g（0～10 cm），5個(gè)土樣等量混合，混合后采用四分法獲得一份土壤[23]，放入無(wú)菌袋于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫寥啦杉攸c(diǎn)和土壤份數(shù)詳見(jiàn)表1，土壤pH值在5.5～6.7。

表1 土壤采樣信息Table 1 Information of soilsamples

酒醅樣品：采自白云邊酒廠傳統(tǒng)大曲釀酒車(chē)間的出入池酒醅，入池酒醅取表層和深20 cm之間酒醅的3個(gè)點(diǎn)各100 g，無(wú)菌袋混勻4℃冰箱保存?zhèn)溆茫怀龀鼐契稚?、中、下層取樣，每層選取同一水平位置5個(gè)點(diǎn)各100 g，酒醅pH值為3.2～4.5。

編號(hào)為SN1-1、SN1-3、SN4-3、SN2-3、SN3-1、SN3-2、TC2-2、SN8-1、SN6-1、SN2-1、SN6-2、SN1-4、SN7-2、SN2-2、SN5-1、SN7-1的I.orientalis為本實(shí)驗(yàn)室從來(lái)自湖北、云南及廣東的土壤中篩選并保藏的菌株[24]。

1.1.2 化學(xué)試劑

Taq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、DL2000Marker：寶生物工程（大連）有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物和基因組DNA抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母膏、蛋白胨（均為生化試劑）：安琪酵母有限公司；葡萄糖、無(wú)水乙醇、醋酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20 g/L，蒸餾水1 000m L；YPD固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉；4%乙醇YPD培養(yǎng)基添加體積分?jǐn)?shù)4%的乙醇。上述培養(yǎng)基115℃滅菌25min。

豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基[25]：黃豆芽200 g/L、蔗糖30 g/L、水1 000m L，115℃滅菌25min。

馬丁孟加拉紅-鏈霉素培養(yǎng)基[25]：葡萄糖10 g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO41g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、孟加拉紅33.4mg/L、鏈霉素30μg/m L，121℃滅菌20m in。

高粱糖化液發(fā)酵培養(yǎng)基：高粱經(jīng)粉碎，糊化，液化，糖化，離心收集上清液，121℃滅菌20min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZXDP-A2160恒溫培養(yǎng)箱：上海智誠(chéng)科技有限公司；ECLIPSE 80i顯微鏡：日本Nikon公司；TGradient聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀：德國(guó)Biometra公司；ZHWY-2102搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；SYDR/1305凝膠成像儀：美國(guó)Syngene公司；7890A氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；UV-5900PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌株的分離

酵母菌株分離方法：稱(chēng)取樣品（土壤或酒醅）10 g，分別加入到90m LYPD培養(yǎng)基、4%乙醇YPD培養(yǎng)基和豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基中，30℃、170 r/min搖床富集培養(yǎng)28 h。樣品梯度稀釋?zhuān)?0-1、10-2、10-3），涂布孟加拉紅培養(yǎng)基上，30 ℃靜置培養(yǎng)1～2 d后挑取形態(tài)不同的單菌落，多次在YPD平板上劃線純化，獲得純培養(yǎng)的菌株。

1.3.2 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

（1）DNA的提取

取純化后的菌株，挑取單菌落接種于YPD培養(yǎng)基中，30℃、170 r/m in培養(yǎng)24 h，用Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，完成后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）26S rDNA PCR擴(kuò)增及測(cè)序

PCR擴(kuò)增26S rDNA，酵母26S rDNA正向引物N L 1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'；反向引物N L 4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。

PCR擴(kuò)增體系：25μL Taq DNA聚合酶、22μL三蒸水、1μL正向引物、1μL反向引物、1μL酵母DNA模板。

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)33次；72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)后，送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序。

（3）測(cè)序結(jié)果分析及菌種鑒定

測(cè)序結(jié)果采DNAStar軟件人工校對(duì)，校正序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索，比較測(cè)試菌株和已知酵母菌株之間的親緣關(guān)系及其系統(tǒng)地位。根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，取與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系最近的模式菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)序列，用ClustalX校準(zhǔn)排齊序列，采用MEGA 5.2軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法，1 000次Bootstrap檢驗(yàn)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[26-27]。

1.3.3 兩種來(lái)源優(yōu)勢(shì)酵母菌耐酸、耐乙醇能力測(cè)定方法

種子液的制備：挑取單菌菌落接種于裝液量為40m L/100m L的YPD培養(yǎng)基（培養(yǎng)基pH自然），30℃、170 r/min搖床培養(yǎng)24 h，得一級(jí)種子液。按1%（V/V）接種于裝液量為40m L/100m L YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、170 r/min搖床培養(yǎng)12 h，得到二級(jí)種子液。

耐酸、耐乙醇能力測(cè)定：按1%（V/V）接種到不同pH值（采用醋酸和乳酸1∶1（V/V）混合，調(diào)pH值分別至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）和不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（0、3%、6%、9%、12%）裝液量為40m L/100m LYPD液體培養(yǎng)基，30℃、170 r/m in搖床培養(yǎng)24 h，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液OD600nm值。對(duì)照組（CK）為接種后混勻，測(cè)定菌液的OD600nm值，下同。

1.3.4 東方伊薩酵母發(fā)酵特性

（1）耐酸能力

按1%（V/V）接種到不同pH值（采用醋酸和乳酸1∶1（V/V）混合，調(diào)pH值分別至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.5）裝液量為40m L/100m LYPD液體培養(yǎng)基，30℃、170 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)菌液OD600nm值。

（2）耐高溫能力

按1%（V/V）接種到裝液量為40m L/100m LYPD液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)基pH自然），在30℃、37℃、42℃、47℃、50℃條件下，170 r/m in搖床培養(yǎng)24 h，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)菌液OD600nm值。

（3）高溫下耐乙醇能力

按1%（V/V）分別接種到體積分?jǐn)?shù)分別為0、2%、4%、6%、8%乙醇YPD液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)基pH自然），在42℃、170 r/min搖床培養(yǎng)24 h，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)菌液OD600nm值。

（4）發(fā)酵產(chǎn)物的測(cè)定

種子液按2%（V/V）接種到200mL高粱糖化液發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后30℃、170 r/min培養(yǎng)6 h，密封，28℃靜置發(fā)酵7 d。發(fā)酵結(jié)束后，蒸餾，氣相色譜檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物（乙醇、乙酸乙酯和正丙醇含量），其檢測(cè)條件為：分流比為20∶1，H2流速為30m L/min，空氣流速為400m L/min，N2流速為25m L/min，柱溫60℃，維持5min，再以10℃/min升溫至160℃，維持5min。檢測(cè)器溫度200℃，進(jìn)樣口溫度220℃，總運(yùn)行時(shí)間20m in。每株酵母菌做3個(gè)重復(fù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件分析兩來(lái)源的I.orientails發(fā)酵產(chǎn)物乙醇和乙酸乙酯含量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異分析。P值＜0.05則認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)有顯著性差異，反之沒(méi)有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌篩選及鑒定

基于酵母26S rDNA D1/D2區(qū)序列，分別構(gòu)建土壤來(lái)源與酒醅來(lái)源的酵母菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果分別見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 土壤來(lái)源酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)域序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of yeasts isolated from soilbased on 26S rDNA D1/D2 region sequences

由圖1可知，來(lái)源土壤的酵母23個(gè)種分為2個(gè)主分支，第一個(gè)分支含15個(gè)種，主要有熱帶假絲酵母（C.tropicalis）、麥芽糖假絲酵母（C.maltosa）、季也蒙畢赤酵母（M.caribbica）、P.kudriavzevii、S.podzolica、畢赤克魯維酵母（P.kluyveri）等。其中C.tropicalis和C.maltosa的親緣關(guān)系比較接近，P.kudriavzevii和P.kluyveri親緣關(guān)系比較接近，C.intermedia和C.pseudointemedia親緣關(guān)系比較接近；第二個(gè)分支含8個(gè)種，主要有T.scarabaeorum、P.membranifaciens、V.pseudolonga等。

由圖2可知，來(lái)源酒醅的酵母7個(gè)種分為2個(gè)主分支，第一個(gè)分支含2個(gè)種，盔形畢赤酵母（P.manshurica）和P.kudri-avzevii；第二個(gè)分支含5個(gè)種，分別是Z.bailii、S.cerevisiae、K.hum ilis、Z.bisporus、S.etchellsii，其中S.cerevisiae和K.humilis親緣關(guān)系比較接近，Z.bisporus和Z.bailii親緣關(guān)系比較接近。

圖2 酒醅來(lái)源酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)域序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of yeasts isolated from fermented grains based on 26S rDNA D1/D2 region sequences

由圖1和圖2可知，土壤中菌株進(jìn)化關(guān)系較酒醅中菌株復(fù)雜，也表明土壤中酵母種群較酒醅更豐富。其原因可能與這2種環(huán)境的選擇壓差異有關(guān)，酒醅中含一定濃度的乙醇和有機(jī)酸等物質(zhì)且還會(huì)經(jīng)過(guò)高溫堆積，所以酒醅具有一定的選擇性壓力，這種選擇壓形成一種過(guò)濾篩，篩除掉對(duì)高溫、富含酸和乙醇環(huán)境敏感的菌株，而供試的土壤則不具備。

2.2 白酒廠酒醅及其周邊土壤中酵母菌的地理分布

從土壤中共分離獲得60株酵母菌，9個(gè)屬23個(gè)種，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，從土壤中共分離獲得60株酵母菌，分別是假絲酵母屬（Candida）、畢赤酵母屬（Pichia）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）、圓孢酵母屬（Torulaspora）、絲孢酵母屬（Trichosporon）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、漢遜酵母屬（Hanseniaspora）和Tetrapisispora。其中，占比較高的有熱帶假絲酵母（C.tropicalis）共23株（占38.3%），I.orientalis共6株（10%），占比較低的包含釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）共2株（3.3%），麥芽糖假絲酵母（Candidamaltosa）共2株（3.3%）等。由表2可知，C.tropicalis的分布最廣，6份不同土樣中均可以篩選到C.tropicalis，而且數(shù)量占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這與王辰等[28]對(duì)海南熱帶雨林腐木上酵母菌物種多樣性研究結(jié)果相一致。從望月村葡萄園和白云邊生態(tài)園生態(tài)林分別篩選到9個(gè)和7個(gè)不同酵母種，比其他土壤要豐富，這可能因?yàn)槠咸逊N植豐富了土壤的種群結(jié)構(gòu)，而且葡萄含糖高表皮的酵母菌本就豐富[29-30]。所獲得6株I.orientalis菌株分別編號(hào)為SWYPT-P-68、BYB-10、SWYPT-P-65、BYB-24、SWYPT-P-64、BLCL-P-100。

表2 酒廠周邊土壤中酵母菌地理分布Table 2 Geographicaldistribution of yeasts in soilaround distillery

從酒醅中分離獲得60株酵母菌，分屬5個(gè)屬7個(gè)種，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，從酒醅中分離獲得60株酵母菌分別是畢赤酵母屬（Pichia）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）、假絲酵母屬（Kazachstania）、結(jié)合酵母屬（Zygosaccharomyces）、伊薩酵母屬（Pichia/Issatchenkia）和Schwanniomyces。其中，盔型畢赤酵母（P.manshurica）26株（43.3%），I.orientalis11株（18.3%），拜耳結(jié)合酵母12株（20.0%），S.cerevisiae 7株（11.7%），矮小假絲酵母2株（3.3%），二孢結(jié)合酵母1株（1.7%），Schwanniomycesetchellsii酵母1株（1.7%）。白云邊酒醅酵母菌總數(shù)中P.manshurica占有很高的比例，這與LIU PL等[31]對(duì)白云邊酒醅高通量測(cè)序分析的結(jié)果一致。

表3 白酒酒醅中分離的酵母菌Table 3 Yeasts isolation from fermented grains of Baijiu

2類(lèi)環(huán)境中共有的酵母菌僅為S.cerevisiae和I.orientalis，可能是因?yàn)樗捎煤Y選的培養(yǎng)基能分離酵母種屬有限，或有些酵母菌豐度太低而未被篩選到[28]。土壤中熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）占優(yōu)勢(shì)，而酒醅中盔形畢赤酵母（Pichiamanshurica）占優(yōu)勢(shì)，這可能與酵母菌的耐酸性及耐乙醇能力有關(guān)，于是對(duì)兩來(lái)源的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行耐酸和耐乙醇能力比較。所獲得11株I.orientalis菌株編號(hào)為Z1、RC6L-P-43、GC-P-15、GC-P-17、RC6L-P-42、RC6L-P-44、CC6RP-49、3LCC-P-126、3LCC-P-127、4LCC-P-133、4LCC-P-143。

2.3 兩種來(lái)源酵母優(yōu)勢(shì)菌耐酸耐乙醇能力測(cè)定結(jié)果

2株C.tropicalis（SWYPT-P-69，SWYPT-P-70）和2株P(guān).manshurica（SYS-P-12，SYS-P-13）的耐酸、耐乙醇能力結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 熱帶假絲酵母和盔型畢赤酵母的耐酸（A）、耐乙醇（B）能力Fig.3 Acid(A)and ethanol(B)tolerance of Candida tropicalis and Pichia manshurica

由圖3A可知，相同菌種菌株間耐乙醇能力無(wú)明顯差異。在pH＜5.5之前，4株菌生長(zhǎng)均受不同程度的抑制。在培養(yǎng)基pH低至4.0時(shí)，24h培養(yǎng)C.tropicalis的生長(zhǎng)量（OD600nm值=1.27）會(huì)明顯較P.manshurica（OD600nm值=0.94）要低；在培養(yǎng)基pH進(jìn)一步降低至3.5時(shí)，C.tropicalis不能生長(zhǎng)，而P.manshurica還有較高的生長(zhǎng)量（OD600nm值=0.9）；在培養(yǎng)基pH低至3.0時(shí)，這2類(lèi)酵母菌均不能生長(zhǎng)。結(jié)果說(shuō)明P.manshurica的耐酸能力明顯較C.tropicalis強(qiáng)。

由圖3B可知，相同菌種菌株間耐乙醇能力差別不大，且其都在無(wú)乙醇培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h達(dá)到相同菌體密度（OD600nm值=1.27）。培養(yǎng)基添加乙醇后，C.tropicalis和P.manshurica生長(zhǎng)均受到抑制，且C.tropicalis的生長(zhǎng)受到的抑制程度明顯較P.manshurica的要高；當(dāng)培養(yǎng)基乙醇含量進(jìn)一步增加至9%時(shí)，C.tropicalis不能生長(zhǎng)，而P.manshurica還有一定程度的生長(zhǎng)量（OD600nm值=0.38）；在培養(yǎng)基含體積分?jǐn)?shù)12%的乙醇時(shí)，2類(lèi)酵母均不能生長(zhǎng)。結(jié)果說(shuō)明P.manshurica的耐乙醇能力明顯較C.tropicalis強(qiáng)。

P.manshurica的耐酸和耐乙醇能力均較C.tropicalis要好，可能P.manshurica在白酒釀造中被長(zhǎng)期馴化而導(dǎo)致其耐酸耐乙醇能力較好，也有研究表明P.manshurica具有利用多種有機(jī)酸的能力[32]，而一般大曲酒醅在釀造的后續(xù)階段酸度較大，該酵母菌在白酒釀造中的功能有待進(jìn)一步的研究。

2.4 東方伊薩酵母發(fā)酵特性

2.4.1 耐酸能力

I.orientalis在兩環(huán)境中均占一定比重，且該菌株是白酒釀造中的功能菌，在不同香型的白酒大曲及酒醅中均有報(bào)道[3，33-34]，分析其種間和不同來(lái)源菌株的發(fā)酵特性差異對(duì)探索白酒中優(yōu)勢(shì)功能菌株資源開(kāi)發(fā)有重大意義。

33株I.orientalis的耐酸能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4A可知，在培養(yǎng)基pH值為6.5時(shí)，I.orientalis生長(zhǎng)基本不受到抑制；當(dāng)培養(yǎng)基pH值降低至5.0時(shí)，I.orientalis的菌液濃度略有提高；當(dāng)培養(yǎng)基pH值降低至4.5時(shí)，I.orientalis生長(zhǎng)受到一定抑制；當(dāng)培養(yǎng)基pH值進(jìn)一步降低至4.0后，所有菌株生長(zhǎng)會(huì)受到明顯的抑制；培養(yǎng)基pH值＜3.5后，全部I.orientalis不能生長(zhǎng)。由此可知，I.orientalis的最適生長(zhǎng)pH值為5.0。由圖4A可知，來(lái)源土壤的I.orientalis菌株SN4-3、SN6-1、SN7-1在pH 4.0時(shí)OD600nm值只有0.4左右，而其他菌株OD600nm值在0.64～0.90，說(shuō)明來(lái)源土壤的I.orientalis耐酸能力存有較大差異，耐受性較好的I.orientalis菌株有SN1-1、SN2-3、SN8-1、SN2-1、SN6-2、SN7-2、BYB-24。由圖4B可知，來(lái)源酒醅的I.orientalis種內(nèi)的耐酸能力也存有差異，耐受性較好菌株有Z1、RC6L-P-42、RC6L-P-44、3LCC-P-127。耐受性較好菌株共有11株，其中來(lái)源土壤7株菌占土壤菌株的31.8%，來(lái)源酒醅4株菌占酒醅菌株的36.3%，即來(lái)源酒醅菌株在耐酸能力上有一定優(yōu)勢(shì)，這也是長(zhǎng)期在酒醅酸性環(huán)境中培養(yǎng)馴化的結(jié)果。I.orientalis有一定利用有機(jī)酸的能力，應(yīng)用在傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)酸度較大的幾個(gè)輪次中也有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。

圖4 土壤（A）及酒醅（B）來(lái)源東方伊薩酵母菌株耐酸能力Fig.4 Acid tolerance of Issatchenkia orientails from soil(A)and fermented grains(B)

2.4.2 耐高溫能力

I.orientalis生長(zhǎng)隨溫度變化測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 土壤（A）及酒醅（B）來(lái)源東方伊薩酵母菌株耐高溫能力Fig.5 High temperature tolerance of Issatchenkia orientails from soil(A)and fermented grains(B)

由圖5可知，I.orientalis的最適生長(zhǎng)溫度為30℃，不同I.orientalis的耐溫能力差異不大。在30℃和37℃培養(yǎng)，I.orientalis菌液OD600nm值均在1.0～1.3，生長(zhǎng)旺盛；當(dāng)溫度提高至42℃時(shí)，菌液OD600nm值在0.8～1.0，生長(zhǎng)受到一定的抑制，但生長(zhǎng)仍較旺盛；當(dāng)溫度進(jìn)一步升高至47℃培養(yǎng)，菌液OD600nm值＜0.05，幾乎不生長(zhǎng)。耐溫性較好的菌株共有11株分 別 是 SN4-3、SN1-3、TC2-2、SWYPT-P-65、SWYPT-P-64、RC6L-P-43、GC-P-15、GC-P-17、RC6L-P-42、RC6L-P-44、3LCCP-126，其中來(lái)源土壤有5株占土壤的22.7%，來(lái)源酒醅6株占酒醅的54.5%，一定程度上反映來(lái)源酒醅菌株在耐溫能力較來(lái)源土壤菌株略有優(yōu)勢(shì)。此外，大多數(shù)釀酒酵母和非釀酒酵母在42℃條件下液體培養(yǎng)幾乎不生長(zhǎng)，而實(shí)驗(yàn)33株I.orientalis在42℃條件下液體培養(yǎng)菌液還有較高濃度，說(shuō)明I.orientalis自身均有較好的耐溫性能，在傳統(tǒng)白酒高溫堆積中會(huì)占有很強(qiáng)優(yōu)勢(shì)。

2.4.3 高溫下耐乙醇能力測(cè)定結(jié)果

I.orientalis在添加體積分?jǐn)?shù)為0、2%、4%、6%和8%乙醇的培養(yǎng)基中，42℃條件下培養(yǎng)24 h生長(zhǎng)量結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 土壤（A）及酒醅（B）來(lái)源東方伊薩酵母菌株在42℃的耐乙醇能力Fig.6 Ethanol tolerance of Issatchenkia orientails from soil(A)and ferm ented grains(B)at 42℃

由圖6可知，在高溫條件下與培養(yǎng)基不添加乙醇組比較，2%乙醇明顯抑制了I.orientalis的生長(zhǎng)；當(dāng)培養(yǎng)基中乙醇含量增加至4%時(shí)，I.orientalis的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，只有較少的生長(zhǎng)量，所測(cè)試菌株抑制效果強(qiáng)弱存在差異；當(dāng)培養(yǎng)基中乙醇含量進(jìn)一步增加至6%時(shí)，有少數(shù)I.orientalis有微弱的生長(zhǎng)，其他菌株不能生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基中乙醇含量增加至8%時(shí)，所有菌株均不能生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)對(duì)比，有8株菌高溫下耐乙醇能力較好，分別是SN7-2、SWYPT-P-68、BYB-10、SWYPT-P-65、BYB-24、GC-P-15、RC6L-P-42、CC6R-P-49，來(lái)源土壤有5株占土壤的22.7%，來(lái)源酒醅3株占酒醅的27.2%，即來(lái)源酒醅菌株在高溫下耐乙醇能力上有一定優(yōu)勢(shì)，若將耐乙醇能力好I.orientalis的應(yīng)用到白酒生產(chǎn)中，將有利于出酒率的提升。

2.4.4 發(fā)酵產(chǎn)物測(cè)定結(jié)果

分析來(lái)源土壤和來(lái)源酒醅的I.orientalis乙醇等發(fā)酵產(chǎn)物含量的差異，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 東方伊薩酵母菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物含量測(cè)定結(jié)果Table 4 Determ ination results of liquid fermentation product content of Issatchenkia orientails

續(xù)表

對(duì)2個(gè)來(lái)源菌株發(fā)酵產(chǎn)物乙醇數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，分析得P＜0.001，即來(lái)源酒醅的I.orientalis乙醇產(chǎn)量顯著高于來(lái)源土壤菌株。同樣方法分析兩來(lái)源I.orientalis乙酸乙酯產(chǎn)量差異，分析得P＜0.001，即來(lái)源酒醅的I.orientalis乙酸乙酯產(chǎn)量顯著高于來(lái)源土壤菌株。

由表4可知，乙醇產(chǎn)量高于5%的I.orientails共有15株，來(lái)源于土壤的有4株分別是TC2-2（5.0%vol）、SWYPT-P-68（8.0%vol）、BYB-24（8.1%vol）、BLCL-P-100（6.2%vol），來(lái)源酒醅的有11株分別是Z1（6.9%vol）、RC6L-P-43（8.2%vol）、GC-P-15（6.5%vol）、GC-P-17（7.6%vol）、RC6L-P-42（6.3%vol）、RC6L-P-44（6.2%vol）、CC6R-P-49（7.3%vol）、3LCC-P-126（8.2%vol）、3LCC-P-127（6.9%vol）、4LCC-P-133（6.1%vol）、4LCC-P-143（5.8%vol）；來(lái)源酒醅的I.orientails菌株產(chǎn)乙醇水平比土壤來(lái)源菌株高（SWYPT-P-68、BYB-10、SWYPT-P-65、BYB-24、BLCL-P-100除外）；乙酸乙酯產(chǎn)量高于250mg/L的菌株有7株，均來(lái)自酒醅，分別是GC-P-15（277mg/L）、GC-P-17（312mg/L）、RC6L-P-42（385mg/L）、RC6L-P-44（381mg/L）、CC6R-P-49（331mg/L）、4LCC-P-133（260mg/L）、4LCC-P-143（338mg/L）。來(lái)源酒醅4株菌GC-P-15、GC-P-17、RC6L-P-42、RC6L-P-44、CC6R-P-49產(chǎn)乙醇和乙酸乙酯能力明顯優(yōu)于其他I.orientails。結(jié)合前面I.orientails的結(jié)果顯示，來(lái)源酒醅的I.orientails在耐酸、耐溫和高溫下耐乙醇能力以及發(fā)酵產(chǎn)乙醇和乙酸乙酯較來(lái)自土壤菌株有優(yōu)勢(shì)，這一結(jié)果也為白酒優(yōu)勢(shì)優(yōu)質(zhì)菌株的分離篩選提供一定的理論參考，將來(lái)源酒醅的優(yōu)質(zhì)菌株應(yīng)用到白酒生產(chǎn)上可提高白酒的出酒率和白酒的品質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究對(duì)白云邊酒廠酒醅及其周邊土壤中的酵母菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)這2種環(huán)境中分離的多株I.orientalis的耐受性和發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，酒醅與其周邊土壤中的酵母菌多樣性差異較大，且土壤中酵母菌種類(lèi)的多樣性要比酒醅中更加豐富。2種環(huán)境中共有的酵母菌重復(fù)度不高，僅有S.cerevisiae和I.orientalis在2種環(huán)境中均出現(xiàn)。土壤中優(yōu)勢(shì)酵母是C.tropicalis，而酒醅中則是P.manshurica，對(duì)這2種環(huán)境中優(yōu)勢(shì)酵母菌的耐受性測(cè)試結(jié)果表明，C.tropicalis的耐酸和耐乙醇能力均不如P.manshurica，這一結(jié)果與其存在的環(huán)境相一致。對(duì)來(lái)源于土壤和酒醅的33株I.orientalis耐受性測(cè)定結(jié)果表明，各菌株之間耐酸、耐高溫和高溫下耐乙醇能力有差異，且來(lái)源酒醅的菌株在耐受性方面較來(lái)源土壤菌株有一定優(yōu)勢(shì)。I.orientalis發(fā)酵結(jié)果顯示，來(lái)源酒醅菌株發(fā)酵產(chǎn)乙醇和乙酸乙酯含量顯著高于來(lái)源土壤菌株。比較白酒廠酒醅中微生物與周邊環(huán)境中土著微生物的多樣性及I.orientalis發(fā)酵性能的差異，將有助于揭示參入白酒發(fā)酵的菌種來(lái)源和I.orientalis優(yōu)良菌株的選育。