宋衛(wèi)得, 蘇 征, 惠希東, 許崇龍, 杜利君, 張傳杰

(1. 日照海關(guān), 山東 日照 276826; 2. 太原海關(guān), 山西 太原 030024)

醬油是中國傳統(tǒng)的調(diào)味品,是人們?nèi)粘ｏ嬍成钪械谋匦杵?。在醬油釀造發(fā)酵時(shí),會產(chǎn)生豐富的氨基酸和糖類。氨基酸是生命延續(xù)過程必須攝取的重要成分[1,2],是醬油中主要的營養(yǎng)成分和鮮味物質(zhì),氨基酸的含量越高,醬油的質(zhì)量等級越高。糖類是醬油中主要的甜味物質(zhì)和重要的調(diào)味物質(zhì),可以掩蓋醬油的咸味、酸味、苦味,醬油中的糖主要有葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、三氯蔗糖等,其中,三氯蔗糖是一種人工添加的功能性甜味劑,我國食品安全標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定其最大使用限量為0.25 g/kg。

目前,氨基酸和糖的分析方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3]、液相色譜法[4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5]、離子色譜法[6]、同位素質(zhì)譜法[7]等,但氨基酸和糖同時(shí)測定的報(bào)道很少。Lin等[5]采用液相色譜-質(zhì)譜法測定了大棗中20種氨基酸,測定靈敏度高,但其中5種組分的回收率較低,為54.8%～69.2%,影響定量的準(zhǔn)確性;徐人杰等[8]采用液相色譜法測定了茶樹花中3種可溶性糖和16種游離氨基酸,但需要采用3種不同的前處理方法和儀器條件進(jìn)行分類測定,其中氨基酸采用鄰苯二甲醛(OPA)和苯磺酰氯兩種衍生化方法,測定步驟相對復(fù)雜;Yu等[9]利用離子色譜法測定了17種氨基酸和9種糖類,文中5種研究組分與本文所研究的組分不同,其研究側(cè)重點(diǎn)在于流動(dòng)相的選擇;本文的側(cè)重點(diǎn)在于研究色譜柱溫度、溶液pH值、放置時(shí)間對26種組分的影響。當(dāng)前氨基酸和糖類測定方法存在的不足是一次性同時(shí)測定組分?jǐn)?shù)量少,且對實(shí)驗(yàn)影響因素的研究不夠深入。離子色譜-積分脈沖安培檢測法利用在特定電極上、特定電壓下發(fā)生氧化反應(yīng)的分析物具有專一性,其他化合物不能被檢測到這一機(jī)理,可以一次性同時(shí)測定多種氨基酸和糖,而且該方法具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等技術(shù)優(yōu)勢[10-13]。

本文利用ICS5000+型雙系統(tǒng)離子色譜儀,采用積分脈沖安培檢測和多級梯度淋洗相結(jié)合的方式,通過對色譜柱溫度、多級梯度條件、溶液pH值、放置時(shí)間等實(shí)驗(yàn)影響因素進(jìn)行深入分析研究,建立了醬油中20種氨基酸和6種糖同時(shí)測定的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

離子色譜儀(美國Thermo Fisher公司,ICS 5000+),配備安培檢測器和自動(dòng)進(jìn)樣器(AS-AP);純水儀(美國Millipore公司,Milli-Q);20種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98.0%,上海安譜科學(xué)儀器有限公司),葡萄糖、麥芽糖、海藻糖、乳糖、蔗糖、三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99.0%, Dr. Ehrenstorfer公司);氫氧化鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%,Fisher Chemical公司);醋酸鈉(純度>99.9%, Thermo Scientific公司); IC-RP10凈化柱(1.0 mL, Agela Technologies公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1離子色譜條件

色譜柱:AminoPac PA10(250 mm×2.0 mm);保護(hù)柱:AminoPac PA10(50 mm×2.0 mm);檢測模式:積分脈沖安培檢測;工作電極:金電極;參比電極:pH電極;電位波形:Glod, pH-Ag-AgCl RE, AAA;流動(dòng)相:A為NaOH溶液(225 mmol/L), B為去離子水,C為醋酸鈉溶液(1.00 mol/L);流速:0.25 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:25 μL。梯度淋洗條件見表1。

表 1 離子色譜梯度淋洗條件Table 1 Gradient elution conditions for ion chromatography

A: 225 mmol/L NaOH; B: deionized water; C: 1.00 mol/L sodium acetate solution. Curve 5 is linear; curve 8 is concave curve.

1.2.2前處理方法

準(zhǔn)確取醬油待檢樣品0.100 g,加入去離子水約150 mL,搖勻靜置15 min,調(diào)節(jié)稀釋液pH值至5.2～6.7,全部轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中,采用去離子水定容至刻度,搖勻、靜置15 min,取10.0 mL溶液,先過0.22 μm水相濾膜,再過已經(jīng)預(yù)活化(依次過10 mL甲醇、15 mL去離子水)的IC-RP10凈化柱,棄去前3 mL,收集流出液,待上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

2.1.1梯度淋洗條件的選擇

圖 1 不同色譜柱溫度下26種組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測定的離子色譜圖Fig. 1 Ion chromatograms of a mixed standard solution of 26 components at different column temperatures Peaks: 1. arginine; 2. trehalose; 3. lysine; 4. glutamine; 5. asparagine; 6. glucose; 7. alanine; 8. threonine; 9. glycine; 10. valine; 11. sucrose; 12. serine; 13. proline; 14. D-lactose; 15. isoleucine; 16. leucine; 17. methionine; 18. maltose; 19. histidine; 20. phenylalanine; 21. glutamic acid; 22. aspartic acid; 23. cysteine; 24. sucralose; 25. tyrosine; 26. tryptophane.

一般淋洗梯度條件難以實(shí)現(xiàn)26種組分的有效分離,為提高檢測靈敏度和分離度,根據(jù)淋洗時(shí)間段和淋洗濃度進(jìn)行了50多次實(shí)驗(yàn)對比研究,最終確定了表1中多級梯度淋洗條件。其中淋洗時(shí)間被分為5段:0～11.5、11.5～17.0、17.0～23.5、23.5～40.0、40.1～50.0 min,初始淋洗濃度是整個(gè)多級梯度淋洗條件的基礎(chǔ),改變初始濃度直接影響率先洗脫組分的分離選擇性,經(jīng)過對比篩選,以45 mmol/L氫氧化鈉溶液作為初始淋洗濃度,恰好能夠?qū)崿F(xiàn)前13種弱保留組分的有效分離。11.5～17.0 min,氫氧化鈉濃度逐步增至90 mmol/L,此時(shí)組分14～17實(shí)現(xiàn)分離;17.0～23.5 min,逐步加入強(qiáng)極性淋洗液醋酸鈉溶液,為中強(qiáng)保留組分的快速洗脫做準(zhǔn)備。23.5～40.0 min,選用氫氧化鈉溶液、醋酸鈉溶液、去離子水(配比24∶40∶36)進(jìn)行洗脫,可使組分18～25完全分離。40.1～50.0 min,為加快洗脫強(qiáng)保留組分色氨酸,同時(shí)確保其靈敏度,選擇氫氧化鈉和醋酸鈉(體積比為50∶50)洗脫液。圖1(35 ℃)是26種組分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖。

2.1.2色譜柱溫度的選擇

溫度是影響離子交換速率和分離選擇性的重要因素[14],但是關(guān)于溫度對離子色譜分離氨基酸和糖的影響當(dāng)前研究較少。根據(jù)待測物的物化性質(zhì)和分離特性,選取了6個(gè)溫度進(jìn)行分析(見圖1)。

從總體上來看,在同一實(shí)驗(yàn)測定條件下,在研究溫度范圍內(nèi),組分1(精氨酸)、組分2(海藻糖)、組分3(賴氨酸)、組分4(谷氨酰胺)、組分5(天冬酰胺)和組分18(麥芽糖)、組分19(組氨酸)、組分20(苯丙氨酸)、組分21(谷氨酸)、組分22(天冬氨酸)、組分23(半胱氨酸)、組分24(三氯蔗糖)、組分25(酪氨酸),幾乎不受溫度的影響,保留時(shí)間和靈敏度沒有明顯變化,因?yàn)檫@些物質(zhì)是極性帶電或含有極性較強(qiáng)側(cè)鏈基團(tuán)組分,它們與色譜柱的作用力主要是庫侖力(電荷力)和側(cè)鏈基團(tuán)作用力,溫度影響相對較小。而中間時(shí)間段出峰的組分6至組分17,主要是非極性、極性不帶電氨基酸和糖類,受溫度影響較大。

從分離度來看,26、28、30、32、35、38 ℃時(shí),出峰組分?jǐn)?shù)量分別為23、25、25、25、26、25種。從圖1中看出,26 ℃時(shí),有3對組分出現(xiàn)共洗脫,分別是組分6和7、組分12和13、組分14和15; 28 ℃時(shí),組分6和7共洗脫,不能滿足定性和定量分析要求;30 ℃和32 ℃時(shí),組分11分別與組分13、12重疊;38 ℃,組分10和11以及組分16和17共洗脫;而35 ℃時(shí),26種組分有效分離,總體分離度最好。

從保留時(shí)間和靈敏度來看,組分6(葡萄糖)、組分10(纈氨酸)、組分11(蔗糖)、組分14(D-乳糖)、組分15(異亮氨酸)、組分16(亮氨酸)和組分26(色氨酸),這7種組分受溫度影響最明顯。其中葡萄糖、蔗糖、乳糖、色氨酸隨著溫度的升高,保留時(shí)間縮短,受溫度影響最大的組分是蔗糖,保留時(shí)間由14.1 min縮短至10.3 min,而且其在混合組分中的出峰順序也發(fā)生了顯著改變;色氨酸出峰時(shí)間從50.3 min縮至44.1 min,葡萄糖和乳糖出峰時(shí)間也有所縮短。蔗糖、乳糖、葡萄糖分子中均含有與苯環(huán)相類似電子結(jié)構(gòu)的含氧六元吡喃環(huán),而蔗糖分子中更是含有一個(gè)吡喃和一個(gè)呋喃(含氧五元雜環(huán))兩個(gè)雜環(huán)結(jié)構(gòu),色氨酸是一種β-吲哚基丙氨酸,吲哚基含有苯環(huán)結(jié)構(gòu),這4種物質(zhì)均含有類苯環(huán)的分子結(jié)構(gòu),而色譜柱內(nèi)骨架基質(zhì)是苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物。從分析化學(xué)角度上,首先,組成和結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì),相對分子質(zhì)量越大,范德華力越大,這4種組分與色譜柱基質(zhì)含有相似的苯環(huán)或者類苯環(huán)結(jié)構(gòu),因此產(chǎn)生了很強(qiáng)的范德華力;其次,極性較大的分子間產(chǎn)生的范德華力以取向力(靜電引力)為主,而取向力與溫度成反比,溫度越高,取向力越弱,組分越易洗脫,因此,這4種組分保留時(shí)間縮短。纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸,隨著溫度的升高,保留時(shí)間卻逐步增大,這3種組分均是相對分子質(zhì)量較小的非極性氨基酸,與色譜柱功能基季銨鹽(-NR3)中烷基的作用力主要來自其側(cè)鏈基團(tuán)疏水性強(qiáng)的烷基[15],而非極性的烷基之間產(chǎn)生的范德華力主要是色散力。首先,色散力與相互作用分子的變形性成正比;其次,烷基具有熱裂解性,溫度升高,烷基鏈增長,分子變形性增大,色散力變大,因此,3種氨基酸保留增強(qiáng)。馬亞杰等[16]發(fā)現(xiàn)這3種氨基酸在色譜柱上的保留行為是吸熱反應(yīng),符合范特霍夫曲線,溫度升高,保留增強(qiáng),從熱力學(xué)角度證實(shí)了此結(jié)論。

從系統(tǒng)壓力來看,隨著溫度的升高,色譜柱內(nèi)填料活性更高,系統(tǒng)壓力逐步降低,由26 ℃時(shí)的20.0 MPa逐步降至38 ℃時(shí)的15.4 MPa; 26 ℃和28 ℃時(shí),最大壓力分別為20.0和18.7 MPa,接近工程師建議的壓力上限20.7 MPa,而35 ℃和38 ℃時(shí),系統(tǒng)最大壓力為16.0和15.4 MPa,此時(shí)壓力適中,系統(tǒng)穩(wěn)定性好。

綜上所述,溫度對疏水性氨基酸和吡喃糖類影響較大,對親水性、酸性、堿性氨基酸影響較小,實(shí)際操作時(shí),可以通過改變柱溫來優(yōu)化分離度和選擇性。本實(shí)驗(yàn)選擇35 ℃分析26種氨基酸和糖。

2.1.3pH值對測定的影響

分別移取相同體積的10份標(biāo)準(zhǔn)儲備液,調(diào)節(jié)為不同pH值,定容至相同體積,此時(shí)每份溶液中26種氨基酸和糖的理論濃度相同,pH值在2.0～13.0之間,依次上機(jī)測定。結(jié)果表明,蘇氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸、海藻糖、蔗糖這7種組分幾乎不受pH值的影響,在酸性和堿性條件下,測定含量均比較穩(wěn)定;而谷氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、葡萄糖、乳糖、麥芽糖這9種組分測定含量受溶液pH值影響較大(見圖2)。

圖 2 不同溶液pH條件下9種組分的含量Fig. 2 Contents of nine components at different solution pH levels

從圖2中可以看出,谷氨酸、絲氨酸是受pH值影響很大,且受pH影響的規(guī)律一致,在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性條件下測定含量均出現(xiàn)了大幅增大,說明在酸堿性條件下兩種組分溶液中離子含量較中性時(shí)出現(xiàn)明顯增大;苯丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸這4種組分測定含量在酸堿性條件下波動(dòng)較大,當(dāng)pH值小于4.0時(shí),測定含量是中性條件下測定含量的85.35%～128.01%,而當(dāng)pH值大于10.0時(shí),這4種組分測定含量波動(dòng)范圍是97.62%～126.91%。

氨基酸之所以受pH值影響較大,是因?yàn)樗莾尚噪娊赓|(zhì),酸性條件下,氨基(-NH2)吸收H+帶正電,堿性條件下,羧基(-COOH)失去H+帶負(fù)電,因此在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿溶液中氨基酸離子含量隨其電離程度大小而變化。除天冬氨酸等電點(diǎn)為2.77、谷氨酸為3.22、賴氨酸為9.74、精氨酸為10.76外,其他16種氨基酸的等電點(diǎn)在5.05～7.60之間,在等電點(diǎn)附近溶液中氨基酸離子的含量穩(wěn)定,因此在弱酸性條件下多數(shù)氨基酸測定含量穩(wěn)定。從圖3中可以看出,葡萄糖、乳糖、麥芽糖在強(qiáng)酸性條件下,測定含量稍有降低,但是在強(qiáng)堿性條件下,葡萄糖含量逐步增大,而乳糖、麥芽糖含量逐步降低;pH值為13.0時(shí),三者測定含量分別是中性條件下的121.94%、36.73%和23.42%,這是由于3種糖中均含有游離的醛基,是還原糖,而乳糖和麥芽糖屬于二糖,在一定條件下可發(fā)生水解等反應(yīng)轉(zhuǎn)化成一定量的單糖葡萄糖,導(dǎo)致所測定葡萄糖的含量有所增大。

氨基酸和糖含量隨pH值的變化規(guī)律,是受自身分子結(jié)構(gòu)、極性、等電點(diǎn)、解離常數(shù)、氧化還原性等各種因素交互影響的結(jié)果,需要進(jìn)行深入研究分析。本實(shí)驗(yàn)選擇26種組分測定含量均很穩(wěn)定,pH值為5.2～6.7,即弱酸性條件下進(jìn)行分析測定。

2.1.4放置時(shí)間對測定的影響

將一份處理好的醬油樣品于20 ℃室溫條件下放置一定時(shí)間,在不同時(shí)間點(diǎn)取樣測定。圖3是0、8、16、24、30、32、36 h 7個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測得的離子色譜圖。

從圖3中可以看出,0、8、16 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的色譜圖基本一致,說明在16 h內(nèi)組分含量穩(wěn)定,但是16 h后多數(shù)組分開始衰減。從24 h開始,精氨酸、葡萄糖、谷氨酸均出現(xiàn)了一定程度的衰減;30 h時(shí),脯氨酸、組氨酸、谷氨酸含量降至0 h時(shí)的52%以下。從圖3中看出,30 h到36 h是26種組分含 量衰減最快、變化最大的時(shí)間段,36 h時(shí)多數(shù)組分測定含量已降至0 h時(shí)的20%以下。因此,為確保26種組分定量準(zhǔn)確,應(yīng)在16 h內(nèi)上機(jī)測定完畢。

圖 3 不同放置時(shí)間下醬油樣品的離子色譜圖Fig. 3 Ion chromatograms of a soy sauce sample at different standing times

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1線性范圍與檢出限

在0.05～2.50 mg/L范圍內(nèi),進(jìn)行了6個(gè)水平(0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.50 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)工作液測定和線性擬合。結(jié)果(見表2)表明,26種組分的線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.995,其中19種組分的相關(guān)系數(shù)大于0.999。26種組分檢出限在0.001 7～0.070 5 mg/L之間,除了谷氨酰胺、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸外,其他22種組分檢出限均小于0.03 mg/L。其中6種糖線性關(guān)系較好,相關(guān)系數(shù)全部大于0.998,檢出限全部小于0.03 mg/L。

2.2.2回收率與精密度

向3個(gè)不同醬油樣品中添加3個(gè)水平(0.20、0.50、2.00 mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次平行測定實(shí)驗(yàn),來驗(yàn)證不同醬油基質(zhì)測定時(shí)方法的回收率和精密度,根據(jù)基質(zhì)濃度、添加濃度和添加后的測定濃度計(jì)算回收率。表3列出3濃度水平、6次平行檢測的平均回收率和RSD數(shù)據(jù)。

從表3中可以看出,26種組分在3種基質(zhì)、3種濃度添加水平下的回收率在84.2%～109%之間,測定數(shù)據(jù)的RSD在2.7%～7.8%范圍內(nèi),說明該測定方法準(zhǔn)確性高、精密度好。

表 2 26種組分的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r2) and limits of detection (LODs) of the 26 components

Y: peak area, nC·min;X: mass concentration, mg/L. LOD:S/N=3.

表 3 26種組分在實(shí)際樣品中3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率及精密度(RSD)(n=6)Table 3 Average recoveries and precisions of the 26 components spiked in samples at three levels (n=6)

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

圖 4 5種醬油樣品的離子色譜圖Fig. 4 Ion chromatograms of five soy sauce samples Peak Nos. are the same as in Fig. 1.

2.3 實(shí)際樣品的分析

從市場上隨機(jī)抽取5種醬油產(chǎn)品,按照離子色譜條件和前處理步驟,進(jìn)行實(shí)際樣品中26種氨基酸和糖含量的測定,圖4是5種醬油樣品的離子色譜圖。

從檢出組分含量來看,含量較高的組分依次是精氨酸、葡萄糖、谷氨酸、丙氨酸,3種氨基酸是醬油中重要的鮮味物質(zhì),葡萄糖是醬油的主要甜味物質(zhì)。從測定穩(wěn)定性來看,檢測基線平穩(wěn),組分峰形尖銳,分離效果理想,幾乎不受其他物質(zhì)的干擾。

5種醬油中氨基酸測定含量與其質(zhì)量等級完全符合,5種醬油中氨基酸總含量依次降低,其質(zhì)量等級恰好是1號特級、2號一級、3號二級、4號三級、5號三級。研究還發(fā)現(xiàn),海藻糖、賴氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蔗糖、絲氨酸、亮氨酸,均符合質(zhì)量等級越高組分含量越大的規(guī)律。

3 結(jié)論

本文利用離子色譜儀,采用多級梯度淋洗和積分脈沖安培檢測相結(jié)合的方法,通過對柱溫、流動(dòng)相配比、溶液pH值、放置時(shí)間等多種影響因素進(jìn)行深入分析研究,構(gòu)建了醬油中26種氨基酸和糖類同時(shí)測定的方法,為醬油樣品中多組分的同時(shí)測定提供了一種高效、便捷、準(zhǔn)確的技術(shù)手段。